KR102308286B1 - SARS-CoV-2 검출용 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

SARS-CoV-2 검출용 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR102308286B1
KR102308286B1 KR1020200065463A KR20200065463A KR102308286B1 KR 102308286 B1 KR102308286 B1 KR 102308286B1 KR 1020200065463 A KR1020200065463 A KR 1020200065463A KR 20200065463 A KR20200065463 A KR 20200065463A KR 102308286 B1 KR102308286 B1 KR 102308286B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cov
sars
seq
leu
gene
Prior art date
Application number
KR1020200065463A
Other languages
English (en)
Inventor
이병철
박일현
이휘호
Original Assignee
주식회사 진캐스트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 진캐스트 filed Critical 주식회사 진캐스트
Priority to KR1020200065463A priority Critical patent/KR102308286B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102308286B1 publication Critical patent/KR102308286B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 SARS-CoV-2 검출을 위한 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SARS-CoV-2를 높은 민감도로 검출할 수 있는 DNA 중합효소, 상기 DNA 중합효소를 포함하는 조성물, 키트 및 상기 키트를 이용한 SARS-CoV-2 검출방법에 관한 것이다.

Description

SARS-CoV-2 검출용 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트 {DNA polymerase for detecting SARS-CoV-2 and kit comprising the same}
본 발명은 SARS-CoV-2 검출을 위한 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SARS-CoV-2를 높은 민감도로 검출할 수 있는 DNA 중합효소, 상기 DNA 중합효소를 포함하는 조성물, 키트 및 상기 키트를 이용한 SARS-CoV-2 검출방법에 관한 것이다.
2019-신규 코로나바이러스 (2019-nCoV)는 2019년 12월 31일에 처음으로 보고되었다. 중국 정부는 WHO에 후베이성 우한의 화난 어시장에서 다수의 환자에서 원인이 알려지지 않은 호흡기 폐렴이 발생한 것으로 보고하였다. 화난 어시장에서 시작된 이 바이러스는 인간에서 인간으로의 전염을 통해 지역 사회 감염을 넘어 전세계로 빠르게 퍼져갔다. 이 신규 바이러스는 우한 위생국에서 코로나바이러스로 발표되었고, 이의 유전자는 2020년 01월 07일에 SARS-Cov 또는 MERS-Cov가 아닌 호흡기 감염을 일으키는 새로운 종의 코로나바이러스인 것으로 발표되었다. WHO는 이를 "2019-신규 코로나바이러스(2019 nCov)"로 명명하였다. BetaCov에 속하는 SARS-Cov (B 계통) 및 MERS-Cov (C 계통)는 급성 호흡기 증상을 특징으로 하는 심각한 호흡기 전염병을 유발한다. SARS-Cov 및 MERS-Cov와 관련된 사망률은 각각 최대 10% 및 35%이다. COVID-19 초기 단계에서 우한의 이형 폐렴 환자로부터 분리된 유전체 서열은 박쥐 SARS-유사-CoVZXC21에 89%의 뉴클레오티드 상동성을 가지며 SARS-CoV에 대해 82%의 상동성을 갖는 것으로 분석되었고, 동일한 betaCoV에 속하는 것으로 밝혀졌다. 이의 명칭은 SARS-CoV-2이다.
HCoV는 일반적으로 양성 (positive-sense)의 매우 긴 (30,000bp) 단일 가닥 RNA 바이러스이다. HCoV는 스파이크 (Spike; S), 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid; N), 매트릭스 (Matrix; M) 및 막 (Envelope; E)과 같은 구조 단백질과 RNA 의존성 RNA 중합효소 (RNA-dependent RNA polymerase; RdRp 또는 nsp12)와 같은 비구조 단백질의 두 가지 단백질 그룹을 특징으로 한다.
S 단백질에는 S1, S2 및 S2'단백질이 있다. S1 단백질은 숙주 수용체와 상호 작용하여 세포막에 비리온을 부착시켜 감염을 시작한다 (유사성에 의함). 인간 ACE2 및 CLEC4M/DC-SIGNR 수용체에 대한 결합 및 숙주 세포의 엔도솜 내로의 바이러스 내재화는 S 당단백질의 입체 구조 변화를 유도한다. 카텝신 CTSL에 의한 단백질 분해는 S2의 융합 펩티드를 드러내게 하고 엔도솜 내의 막 융합을 활성화시킬 수 있다.
S2 단백질은 클래스 I 바이러스 융합 단백질로 작용함으로써 비리온 및 세포막의 융합을 매개한다. 현재 모델에서, 단백질은 적어도 3개의 입체 형태를 갖는다: 전-융합 천연 상태 (pre-fusion native state), 전-헤어핀 중간 상태 (pre-hairpin intermediate state), 및 후-융합 헤어핀 상태 (post-fusion hairpin state). 바이러스 및 표적 세포막 융합 동안, 코일형 코일 영역 (7번 반복; heptad repeats)은 헤어핀 삼량체 구조 (trimer-of-hairpins structure)를 가정하여, 융합 펩티드를 엑토도메인 (ectodomain)의 C-말단 영역에 근접하게 위치시킨다. 이 구조의 형성은 바이러스 및 표적 세포막의 부착 (apposition) 및 후속 융합을 유도하는 것으로 보인다.
S2' 단백질은 바이러스 세포내이입 (endocytosis) 시 발생하는 S2 절단 후 드러나는 바이러스 융합 펩티드로 작용한다.
N 단백질은 양성 가닥 바이러스 유전체 RNA를 나선형 (helical) 리보뉴클레오캡시드 (RNP)로 포장하고 (package), 바이러스 유전체와 막 단백질 M과의 상호 작용을 통해 비리온 (virion) 조립 동안 기본 역할을 수행한다. 하위 유전체 (subgenomic) 바이러스 RNA 전사 및 바이러스 복제의 효율을 향상시키는데 중요한 역할을 한다.
RdRp는 코로나바이러스를 포함한 RNA 바이러스의 생활 주기에 중요한 효소로, RdRp 활성 부위는 고도로 보존되어 베타-턴 (beta-turn) 구조로부터 돌출된 2개의 연속적인 아스파르테이트 (Aspartate)를 나타내고 뉴클레오티드 채널을 통해 (유리 뉴클레오티드가 이를 통해 통과할 수 있음) 이들을 표면에 접근 가능하게 한다.
COVID-19의 전염병이 시작되고 유전자 서열이 공개됨에 따라, WHO는 SARS-CoV-2의 분자 진단을 공유하였다. 분자 진단을 위해, 대부분의 국가와 기관은 실시간 PCR (Real-time PCR; RT-qPCR)을 사용하고 있다. SARS-CoV-2는 인간에서 인간으로의 전염이 쉽게 발생하고 빠르게 감염이 증가하고 있는 만큼, 보다 민감하고 조기에 진단 가능한 키트의 개발이 요구되고 있으나, 현재 사용되는 키트의 어세이의 민감도가 입원 후 초기에 의심스러운 환자를 확인하기에 충분하지 않을 수 있다는 문제점이 제기되고 있다.
또한, PCR은 핵산 검출에 필요한 검출 한계를 크게 낮추는데 기여하였으나, 핵산의 농도가 매우 낮은 경우 검출하기 어려운 문제점이 있으며, 반응 효율이 반응기마다 다르게 나타나는 단점이 있다. 특히 시료의 선별, 핵산의 분리 과정, 시료를 옮기는 과정, 시료의 PCR 과정, 시료 보관 및 전기영동 후 시료의 회수 과정 등에서 교차 오염 (carry-over contamination)이 발생하기도 한다. PCR 과정에서의 오염 원인은 시료들 간의 교차 오염, 실험실에서의 DNA 오염 및 증폭 생산물들과 이전 PCR 산물의 프라이머 (primer)에 의한 교차오염 (carry-over)이 있는데, 이러한 교차 오염은 극히 미량일지라도 목적의 시료와 함께 증폭된다면 기존의 PCR 방법으로는 시료의 오염여부를 구별할 수가 없는 문제점이 발생하게 된다.
따라서, 최근에는 PCR 증폭산물의 교차 오염 (Carry-over contamination)에 의해 위양성 (positive false)이 발생하는 것을 방지함으로써 검출의 정확도를 높이기 위해 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템이 활용되고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 높은 민감도로 SARS-CoV-2 검출이 가능하고, UNG 시스템에 최적화된 DNA 중합효소를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
관련 기술분야의 종래 기술로는 27종의 박쥐 유래 코로나바이러스를 높은 민감도로 검출할 수 있는, 리얼타임 PCR을 이용한 박쥐 유래 코로나바이러스 검사 키트 및 방법이 대한민국 등록특허 제10-2018201호에 공개된 바 있으나, 박쥐 유래 코로나 바이러스 검출을 위한 다양한 프라이머 및 프로브에 대해서만 기재되어 있을 뿐, DNA 중합효소에 대한 내용은 언급되어 있지 않다.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, SARS-CoV-2 검출용 DNA 중합효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 DNA 중합효소를 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 조성물 및/또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 키트를 이용한 SARS-CoV-2 검출방법을 제공한다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 22의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 DNA 중합효소를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 중합효소는 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템에서 서열번호 22의 야생형 Taq DNA 중합효소에 비해 SARS-CoV-2 유전자 증폭 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 SARS-CoV-2 유전자는 S 유전자, N 유전자 및 RdRp 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 DNA 중합효소를 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는
S 유전자 영역인 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 22363 내지 22488의 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브;
N 유전자 영역인 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 29422 내지 29514의 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브; 및
RdRp 유전자 영역인 SARS-CoV-2 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 14106 내지 14241의 영역, 위치 13963 내지 14119의 영역 또는 위치 14177 내지 14283의 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브;
로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, S 유전자 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 서열번호 1 내지 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; N 유전자 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 서열번호 4 내지 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하며; RdRp 유전자 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 서열번호 7 내지 9의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 10 내지 12의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 13 내지 15의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역인 E 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, E 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 서열번호 16 내지 18의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 내부 대조군 (internal control)으로 인간 RPP30 (RNase P) 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 인간 RPP30 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 서열번호 19 내지 21의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 프로브는 각각 5'-말단에 FAM, CAL Fluor Orange 560, VIC, HEX, JOE, Quasar 670 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질 (fluorophore)이 표지되고, 3'-말단에 NFQ-MGB, BHQ-1 BHQ1 nova 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 소광물질이 표지될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 교차 오염 방지를 위한 dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 검출방법을 제공한다:
(a) 분리된 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 RNA에 전술한 키트를 처리하여 역전사 및 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 증폭시키는 단계; 및
(c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분리된 생물학적 시료는 비인두 또는 구강인두 스왑 (swab), 비인두 흡인물 (aspirate), 기관지폐포세척액 및 가래로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 실시간 PCR (Real-time PCR)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 SARS-CoV-2 검출방법은 (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 Taq DNA 중합효소는 WT Taq DNA 중합효소에 비해 높은 검출 민감도로 SARS-CoV-1 및 MERS-CoV을 포함한 31종의 다른 바이러스 및 유기체 (organism)에 대해 교차 반응 없이 SARS-CoV-2만을 특이적으로 검출할 수 있다 (다만, 예외적으로 E 유전자는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역이므로, E 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브는 SARS-CoV-1에 대해 교차 반응성을 나타냄). 또한, 교차 오염 (Carry-over contamination)을 방지를 위한 UNG (우라실-DNA N-글리코실라아제) 시스템에 적용 시에도, WT Taq DNA 중합효소에 비해 SARS-CoV-2 유전자 증폭 효율을 향상시켜 높은 검출 민감도 (RdRp 유전자: 6 카피/rxn, N 유전자: 3 카피/rxn 및 E 유전자: 6 카피/rxn)로 교차 반응 없이 SARS-CoV-2만을 특이적으로 검출할 수 있다.
도 1은 R536K, R660V 및 R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정을 나타낸 것으로, (a)는 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이고, (b)는 단편 PCR에서 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며, (c)는 오버랩 PCR로 전장을 증폭하여 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 1(c)의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 3은 E507K, E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정 중 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 3의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 5는 SARS-CoV-2의 S 유전자의 IVT RNA를 시료로 하여, 본 발명의 Taq DNA 중합효소와 상기 S 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 RT-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다 (IVT RNA: In-vitro transcribed RNA; NTC: No-template control).
도 6은 SARS-CoV-2의 N 유전자의 IVT RNA를 시료로 하여, 본 발명의 Taq DNA 중합효소와 상기 N 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 RT-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다 (IVT RNA: In-vitro transcribed RNA; NTC: No-template control).
도 7 내지 9는 SARS-CoV-2의 RdRp 유전자의 IVT RNA를 시료로 하여, 본 발명의 Taq DNA 중합효소와 상기 RdRp 유전자에 특이적인 3종의 프라이머 세트 및 프로브로 RT-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것으로 (IVT RNA: In-vitro transcribed RNA; NTC: No-template control), 도 7은 서열번호 7 내지 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트 및 프로브에 대한 결과이고 (Set 1), 도 8은 서열번호 10 내지 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트 및 프로브에 대한 결과이며 (Set 2), 도 9는 서열번호 13 내지 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머 세트 및 프로브에 대한 결과이다 (Set 3).
도 10은 SARS-CoV-2의 E 유전자의 IVT RNA를 시료로 하여, 본 발명의 Taq DNA 중합효소와 상기 E 유전자를 검출하는 프라이머 세트 및 프로브로 RT-qPCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다 (IVT RNA: In-vitro transcribed RNA; NTC: No-template control).
도 11은 UNG 시스템 적용 시 WT Taq DNA 중합효소와 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소의 표적 유전자의 증폭 효율을 비교한 것이다.
상술한 바와 같이, 현재 대부분의 국가와 기관은 SARS-CoV-2의 분자 진단을 위해 실시간 PCR (Real-time PCR; RT-qPCR)을 사용하고 있으나, 현재 사용되는 키트의 어세이의 민감도가 입원 후 초기에 의심스러운 환자를 확인하기에 충분하지 않을 수 있다는 문제점이 제기되고 있으며, 교차 오염 방지를 위한 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템에 최적화된 키트의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 높은 민감도로 SARS-CoV-2 검출이 가능하고, UNG 시스템에 최적화된 DNA 중합효소를 고안하여 높은 민감도를 가지고 SARS-CoV-1과의 교차 반응성을 나타내지 않는 SARS-CoV-2 검출용 키트를 개발하고 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 제1 측면은 서열번호 22의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 DNA 중합효소에 관한 것이다.
상기 "Taq 중합효소"는 고온성 세균인 써모스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)의 이름을 따서 명명된 내열성 DNA 중합효소로 상기 세균으로부터 최초로 분리되었다. 써모스 아쿠아티쿠스는 온천 및 열수 분출공에 서식하는 세균으로, Taq 중합효소는 PCR 과정에서 요구되는 단백질 변성 조건 (고온)을 견딜 수 있는 효소로 확인되었다. Taq 중합효소의 최적 활성온도는 75-80 ℃이고, 92.5 ℃에서 2시간 이상, 95 ℃에서 40분, 97.5 ℃에서 9분의 반감기를 가지며, 72 ℃에서 10초 이내에 1000개의 염기쌍 DNA를 복제할 수 있다. 이는 3'→5' 핵산말단가수분해효소(exonuclease) 교정 활성이 결여되어 있으며, 9,000개의 뉴클레오타이드 중 약 1개에서 오류율이 측정된다. 예를 들어 내열성 Taq를 사용하면 고온(60 ℃ 이상)에서 PCR을 실행할 수 있다. Taq 중합효소에 대하여 서열번호 22에 나타낸 아미노산 서열이 기준 서열로 사용된다.
본 발명에서, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K/R536K/R660V"로 명명하였고, 이의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 각각 서열번호 23과 33에 나타내었다.
본 발명의 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소는 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템에 적용 시, 서열번호 22의 야생형 Taq DNA 중합효소에 비해 SARS-CoV-2 유전자 증폭 효율을 현저하게 향상시킬 수 있다. 예를 들어, SARS-CoV-2의 S 유전자, N 유전자 또는 RdRp 유전자의 증폭 효율을 현저하게 향상시킬 수 있으나, 유전자의 종류는 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 제2 측면은 전술한 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소를 포함하는 SARS-CoV02 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 SARS-CoV-2의 유전자를 특이적으로 표적하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머" 는 폴리뉴클레오티드 신장이 개시되는 조건 하에 놓일 때 주형-방향으로 핵산 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 프라이머는 또한 de novo RNA 합성 및 시험관내 전사-관련 공정의 개시제로서 포함되는, 다양한 기타 올리고뉴클레오티드-중재 합성 공정에서 사용될 수 있다. 프라이머는 전형적으로는, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고데옥시리보뉴클레오티드)이다. 프라이머의 적절한 길이는 전형적으로는 6 내지 40 개의 뉴클레오티드 범위, 보다 전형적으로는 15 내지 35 개의 뉴클레오티드 범위에서 의도되는 사용에 따라 달라진다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정적인 혼성화 착물을 형성하기 위해 보다 저온의 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영하는데 요구되지 않으나, 프라이머가 신장되기 위한 주형과 혼성화되기 위해 충분히 상보적이어야만 한다. 특정 구현예에서, 용어 "프라이머 세트"는 증폭되는 핵산 서열의 5'-말단에 상보적으로 혼성화되는 5'-센스 프라이머를 포함하고, 증폭되는 서열의 3' 말단에 혼성화되는 3'-안티센스 프라이머를 포함하는 프라이머의 세트를 의미한다. 프라이머는, 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 표지를 혼입함으로써 표지될 수 있다. 예를 들어, 유용한 표지는 하기를 포함한다: 32P, 형광 염료, 전자-덴스 시약, 효소 (ELISA 분석에서 통상적으로 사용됨), 비오틴, 또는 합텐 및 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용될 수 있는 단백질.
본 발명에서 용어 "프로브"란 상보적인 염기서열과 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지되어 (labeling) 있으므로 특정 염기서열의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 또한, 실시간 PCR을 수행하기 위해서는 형광표식 프로브를 이용할 수 있다. 보다 구체적으로 TaqMan 프로브를 이용하는 경우 5' 말단은 형광물질로 3' 말단은 소광물질 (quencher)로 표지한 올리고뉴클레오티드를 PCR 반응액에 첨가한다. 또한, 사이클링 (Cycling) 프로브를 이용한 실시간 PCR은 RNA와 DNA로 이루어지는 키메라 프로브와 RNAse H로 구성된 고감도의 검출방법이다. 이 역시 프로브의 5' 말단은 형광물질로 3' 말단은 소광물질로 표지한다.
프로브는 증폭 과정 동안 정방향 및 역방향 프라이머 사이에 위치한 특정 표적 서열에 어닐링되며, PCR 사이클의 연장 단계 (extension phase) 동안 Taq 중합효소의 5'뉴클레아제 활성에 의해 절단되어 형광물질 (리포터 염료)이 소광물질 (소광 염료)로부터 분리되어 형광 강도가 증가된다. 형광 강도는 실시간 PCR 시스템에 의해 각 PCR 사이클에서 모니터링될 수 있다.
본 발명의 키트는, 예를 들어, S 유전자 영역인 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 22363 내지 22488의 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브; N 유전자 영역인 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 29422 내지 29514의 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브; 및 RdRp 유전자 영역인 SARS-CoV-2 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 14106 내지 14241의 영역, 위치 13963 내지 14119의 영역 또는 위치 14177 내지 14283의 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에 있어서, S 유전자 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 서열번호 1 내지 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, N 유전자 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 서열번호 4 내지 6의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, RdRp 유전자 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 서열번호 7 내지 9의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 10 내지 12의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 13 내지 15의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 내의 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 내의 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상 또는 25개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 내의 18개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 내의 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상 또는 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 내의 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 4 및 5의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 4 및 5의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상 또는 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, N 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열 내의 18개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상 또는 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열 내의 21개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 10 및 11의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 10 및 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 내의 18개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 내의 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상 또는 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열 내의 21개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열 내의 23개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열 내의 18개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트는 SAR-CoV-1과 SARS-CoV-2의 공통 영역인 E 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트에 있어서, SAR-CoV-1과 SARS-CoV-2의 공통 영역인 E 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브는 SARS-CoV-2의 유전체 서열 (NCBI 접근번호 NC_045512)의 위치 26272 내지 26382의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 16 및 17의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트는 서열번호 16 및 17의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열 내의 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열 내의 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상 또는 27개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, E 유전자에 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열 내의 18개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트는 내부 대조군 (internal control)으로 인간 RPP30 (RNase P) 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, RPP30 유전자에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 19및 20의 뉴클레오티드 서열을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RPP30 유전자에 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RPP30 유전자에 결합하는 프라이머 세트의 정방향 프라이머는 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상 또는 21개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 역방향 프라이머는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열 내의 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 따르면, RPP30 유전자에 결합하는 프로브는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 RPP30 유전자에 결합하는 프로브는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에 따르면, RPP30 유전자에 결합하는 프로브는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열 내의 17개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 프로브는 각각 5'-말단에 FAM, CAL Fluor Orange 560, VIC, HEX, JOE, Quasar 670 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질 (fluorophore)이 표지되고, 3'-말단에 NFQ-MGB, BHQ-1 BHQ1 nova 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 소광물질이 표지될 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트는 또한 다음과 같은 대조군을 포함할 수 있다:
1) 음성 대조군 (No Template Control, NTC)은 어세이 실행 시 오염 가능성을 제거하기 위해 필요하며, 모든 어세이에 사용된다. 이러한 NTC는 분자 등급 (molecular grade), DNase 및 RNase-무첨가 수(water)이다.
2) 양성 주형 대조군 (positive template control)은 어세이가 의도한대로 수행되었는지 확인하기 위해 필요하며, 300 카피 /μL 농도로 마스터 믹스 첨가에서 시작하는 모든 어세이에 사용된다. 양성 대조군은 플라스미드 혼합물 (RdRp, S, N, E 및 RNase P)로 구성된다.
3) PNase P를 표적하는 내부 대조군 (RPP30)은 모든 시료에 핵산이 존재하는지 확인하기 위해 필요하며, 처리된 모든 시료에 사용된다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 조성물 및 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물 및 키트는 역전사 반응 및 실시간 다중 PCR(real-time multiplex PCR)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 키트는 Taq DNA 중합효소 이외에도 검출 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트, SARS-CoV-2의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, 본 발명의 키트는 dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG)를 추가로 포함할 수 있으며, 이에 따라 교차 오염 (carryover contamination) 방지를 위한 dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템을 이용할 수 있다.
PCR은 매우 높은 감도의 검출 방법이므로, 앞서 진행한 PCR 증폭산물의 교차 오염에 의해 위양성 (false positive)이 생기는 경우가 있다. dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템을 사용하면, 이러한 오염(carryover)에 의한 위양성 반응을 방지할 수 있어 검사의 신뢰성을 올릴 수 있다. 구체적으로, 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템은 dTTP 대신에 dUTP를 포함한 dNTP 혼합물을 기질로 사용하여, 티민 대신 우라실을 포함한 증폭산물을 만들어낸다. 만약 이 증폭산물이 교차 오염이 되었더라도, 다음 반응 전에 우라실-N-글리코실라아제 (UNG)로 처리한 후 PCR 반응을 하게 되면, 오염된 증폭산물은 분해되고 우라실을 포함하지 않는 검체 유래의 DNA만 남아 PCR 반응의 주형이 된다. 따라서, 반복적인 PCR에 의한 교차 오염을 방지할 수 있게 된다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 키트는, 예를 들어, 표 1과 같이 구성될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
구성 주요 성분 양
100회 테스트 1,000회 테스트
2X One-step RT-qPCR MMX 버퍼, dNTP w/dUTP, UNG, 역전사 효소, RNase 억제제, Taq DNA 중합효소 1,000μL/튜브×1 10 mL/병×1
10X 프라이머/
프로브 믹스		 - RdRP, S, N 유전자 : SARS-CoV-2 특이적
- E 유전자 : SARS-CoV-1/2 공통
- RPP30 (RNase P) 유전자 : 내부 대조군		 200μL/튜브×1 1 mL/튜브×2
SARS-CoV-2
양성 대조군		 RdRP, S, N, E 및 RNase P 플라스미드의 혼합물 50μL/튜브×1 0.5 mL/튜브×1
뉴클레아제
무첨가 수		 PCR 등급 수 500μL/튜브×1 5 mL/병×1
본 발명의 키트는 개별 튜브에 제공된 모든 시약을 포함하며, 이들 시약은 어세이 전에 첨가된다. 예시적인 검출 정보는 표 2와 같다.
형광 신호
FAM VIC CY5
SARS-CoV-2 특이적 SARS-CoV-1/2 공통 내부 대조군 (IC)
N 유전자
S 유전자
RdRp 유전자		 E 유전자 RPP30 (RNase P) 유전자
본 발명의 키트는 생체 외 진단용 (In-Vitro Diagnostic, IVD)으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 키트는 SARS-CoV-2 감염으로 인한 폐렴 진단에 적용될 수 있다.
본 발명의 제3 측면은 다음의 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 검출방법에 관한 것이다:
(a) 분리된 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 RNA에 본 발명의 키트를 처리하여 역전사 및 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 증폭시키는 단계; 및
(c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출방법에 사용되는 키트는 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소에 각각 SARS-CoV-2의 S, N 및 RdRp 유전자를 표적하는 프라이머 세트 및 프로브를 다양하게 조합하여 사용될 수 있다.
예를 들어, 각 유전자를 표적하는 프라이머 세트 및 프로브를 단독으로 포함하거나, S, N 및 RdRp 유전자 중 2개 또는 3개의 유전자를 표적하는 프라이머 세트 및 프로브를 포함할 수 있다. 표 21 및 22에서 확인되는 바와 같이, E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소와 함께 각 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브를 사용하는 경우, 2~6 카피/rxn의 LoD (RdRp 유전자: 6 카피/rxn, N 유전자: 2 카피/rxn 및 E 유전자: 6 카피/rxn)를 나타내어, 높은 민감도로 SARS-CoV-2를 검출할 수 있고, 표 23에서 확인되는 바와 같이 SARS-CoV-1 및 MERS-CoV을 포함한 31종의 다른 바이러스 및 유기체 (organism)에 대해 교차 반응 없이 SARS-CoV-2만을 특이적으로 검출할 수 있다.
따라서, E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소와 함께 각 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브를 단독으로 사용하더라도, SARS-CoV-2를 높은 민감도로 다른 바이러스 및 유기체 (organism)에 대해 교차 반응 없이 검출할 수 있으며, 3개의 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브를 다양한 조합으로 사용하는 경우, SARS-CoV-2 검출 또는 SARS-CoV-2 감염 진단의 정확도를 높일 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출방법에 있어서, 상기 분리된 생물학적 시료는 비인두 또는 구강인두 스왑 (swab), 비인두 흡인물 (aspirate), 기관지폐포세척액 및 가래로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, SARS-CoV-2를 검출하고자 하는 시료 또는 SARS-CoV-2 감염 여부를 진단하고자 하는 개체로부터 분리된 SARS-CoV-2의 RNA를 포함할 수 있는 생물학적 시료라면 제한 없이 사용될 수 있다.
또한, 상기 SARS-CoV-2 감염 여부를 진단하고자 하는 개체는 척추동물, 보다 바람직하게는 인간 대상체일 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출방법은 실시간 PCR (Real-time PCR)로 수행될 수 있다.
상기 "실시간 PCR"은 PCR을 수행할 때 실시간으로 그 과정을 모니터링할 수 있다. 따라서, 데이터는 PCR이 종료되는 시점이 아니라, PCR 과정 전반에 걸쳐 수집된다. 실시간 PCR에서, 반응은 고정된 사이클 수 후에 축적된 표적 양보다는 증폭이 처음으로 검출될 때의 사이클 동안의 시점을 특징으로 한다. 주로 염료 기반 검출 및 프로브 기반 검출의 두 가지 방법이 정량적 PCR을 수행하는데 사용된다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출방법에 있어서, 전술한 dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG)를 추가로 포함하는 키트를 사용하는 경우, 교차 오염 (carryover contamination) 방지를 위한 dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템을 이용할 수 있다.
도 11에서 확인되는 바와 같이, WT Taq DNA 중합효소의 경우 UNG 시스템 적용 시 Ct 지연 및 형광 신호가 감소되는 문제점이 확인되었으나, E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소는 WT Taq DNA 중합효소에 비해 낮은 Ct 값을 나타내어 표적 유전자의 증폭 효율이 현저하게 개선되었고, 뚜렷한 형광 신호를 나타냈다. 따라서, E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소는 교차 오염 (carryover contamination) 방지를 위한 dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템을 적용한 SARS-CoV-2 검출방법에 유용하다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출방법은 (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 염료의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 염료의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다 (http://www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 소광물질(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 소광물질(NFQ))을 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오티드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오티드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 소광물질에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 소광물질에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' 내지 3' 뉴클레아제 활성에 의해 주형에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광물질에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' 내지 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 소광물질 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 소광물질 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM (506), YOPRO TM-1 (509), YOYO TM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX TM (519), AlexaTM (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green TM 500 (522), Oregon GreenTM 488 (524), RiboGreenTM (525), Rhodamine GreenTM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium GreenTM (531), Calcium GreenTM (533), TO-PROTM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3TM (570), AlexaTM 546 (570), TRITC (572), Magnesium OrangeTM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium OrangeTM (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine RedTM (590), Cy3.5TM (596), ROX (608), Calcium CrimsonTM (615), AlexaTM 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PROTM-3 (631), YOYOTM-3 (631), R-phycocyanin (642), CPhycocyanin(648), TO-PROTM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5TM (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC (546), BHQ-1 (534), BHQ-2 (579), BHQ-3 (672), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다.
적합한 리포터-소광물질 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
또한, TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 소광물질 분자에 이용되는 비형광성 물질은 마이너 그루브 결합 모이어티(minor groove binding(MGB) moiety)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "TaqMan MGB-컨쥬게이트 프로브(MGB-conjugate probe)"는 프로브의 3'-말단에 MGB와 컨쥬게이션된 TaqMan 프로브를 의미한다.
MGB는 높은 친화도로 DNA의 마이너 그루브에 결합하는 물질로서, 네트롭신(netropsin), 디스타마이신 (distamycin), 렉시트롭신 (lexitropsin), 미트라마이신 (mithramycin), 크로모마이신 (chromomycin) A3, 올리보마이신 (olivomycin), 안트라마이신 (anthramycin), 시비로마이신 (sibiromycin), 펜타미딘 (pentamidine), 스틸바미딘 (stilbamidine), 베레닐 (berenil), CC-1065, Hoechst 33258, DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole), CDPI의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머, MPC (N-methylpyrrole-4-carbox-2-amide) 및 이의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
프로브와 MGB의 컨쥬게이션(conjugation)은 프로브와 이의 타겟 간에 형성되는 하이브리드의 안정성을 현저하게 증가시킨다. 보다 상세하게는, 증가된 안정성(즉, 혼성화 정도의 증가)는 정상 프로브와 비교하여 MGB-컨쥬게이트 프로브에 의해 형성된 하이브리드 듀플렉스의 증가된 Tm(melting temperature)을 유발한다. 따라서, MGB는 반데르발스 힘을 안정화시켜 프로브 길이의 증가 없이 MGB-컨쥬게이트 프로브의 Tm(melting temperature)를 증가시킴으로써 보다 엄격 조건 하의 Taqman 실시간 PCR에서 더 짧은 프로브(예컨대, 21개 이하의 뉴클레오티드)의 이용을 가능하게 해준다.
또한, MGB-컨쥬게이트 프로브는 백그라운드 형광을 보다 효율적으로 제거시켜 준다. 따라서, 본 발명의 프로브는 TaqMan MGB-컨쥬게이트 형태일 수도 있으며, 이때 프로브의 길이는 15-30개의 뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출 방법에 있어서, 양성 대조군 및 음성 대조군에 대한 예시적인 결과 해석은 아래 표 3과 같다.
FAM VIC CY5 결정
양성 대조군 25 ≤ Ct ≤ 31 25 ≤ Ct ≤ 31 27 ≤ Ct ≤ 33 유효
음성 대조군 검출되지 않음 검출되지 않음 검출되지 않음 무효
본 발명의 SARS-CoV-2 검출 방법에 있어서, 각 유전자에 대한 컷-오프 (Cut-off) Ct 값에 따른 예시적인 결과 해석은 표 4 및 5와 같다.
임상 시료에서 각 표적의 컷-오프 Ct 값
유효 결과 결정 컷-오프 Ct 값 결정
컷-오프 Ct 값 RdRp 유전자
N 유전자
S 유전자
E 유전자		 ≤40 양성
>40 또는 N/A 음성
케이스 1 케이스 2 케이스 3 케이스 4
IC (CY5) +/- +/- + -
E 유전자 +/- + - -
N+S+RdRP 유전자 + - - -
결과 해석 양성
(SARS-CoV-2 검출)		 음성 (SARS-CoV-2 비검출,
사르베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출)		 음성 무효
본 발명의 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소를 포함하는 키트를 이용한 SARS-CoV-2 검출 방법은 표 6의 31종의 병원체에 대해 교차 반응을 나타내지 않는다. 다만, E 유전자는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역이므로, E 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브는 예외적으로 SARS-CoV-1에 대해 교차 반응성을 나타낸다.
동일한 유전자 패밀리로부터 다른 높은 우선 순위의 병원체 순환 영역 (circulating area)에서 높은 우선 순위의 유기체
Human coronavirus 229E Human Adenovirus 1
Human coronavirus OC43 Human Adenovirus 3
Human coronavirus HKU1 Human Cytomegalovirus
Human coronavirus NL63 Human rhinovirus B14
SARS-coronavirus Human parainfluenza virus 1
MERS-coronavirus Human parainfluenza virus 2
Human parainfluenza virus 3
Influenza A virus (H1N1)
Influenza A virus (H3N2)
Influenza B virus
Human respiratory syncytial virus A
Human respiratory syncytial virus B
Human Rhinovirus A1
Coxsackie virus (B3)
Echovirus (E6)
Mumps virus (H)
Measles virus
Streptococcus pyogenes
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumonia
Legionella pneumophila
Mycobacterium Tuberculosis
Mycobacterium Avium
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Taq 중합효소의 돌연변이유발
1-1. 단편 PCR
본 실시예에서는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K"라 함), 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R660V"라 함) 및 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환되고 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K/R660V"라 함)를 하기와 같이 제조하였다.
먼저, 표 7에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 1의 (a)에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F1 내지 F5)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 8과 같다.
프라이머 서열 (5'→3') 서열번호
Eco-F GG GGTACC TCA TCA CCC CGG 24
R536K-R CTT GGT GAG CTC CTT GTA CTG CAG GAT 25
R536K-F ATC CTG CAG TAC AAG GAG CTC ACC AAG 26
R660V-R GAT GGT CTT GGC CGC CAC GCG CAT CAG GGG 27
R660V-F CCC CTG ATG CGC GTG GCG GCC AAG ACC ATC 28
Xba-R GC TCTAGA CTA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA 29
10ⅹpfu 버퍼 (솔젠트) 2.5 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
F 프라이머 1 μl
R 프라이머 1 μl
증류수 18 μl
pUC19-Taq (10 ng/ μl) 1 μl
Pfu 중합효소 0.5 μl
30 사이클 (Ta=60℃) 25 μl
PCR 산물을 전기영동 상에서 확인해본 결과, 도 1의 (b)에 나타난 바와 같이 각 단편에 대한 밴드가 확인되어 목적하는 단편이 증폭되었음을 확인하였다.
1-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 1-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 9 및 10과 같다.
R660V 또는 R536K
10ⅹpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5ⅹ인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 27 μl
단편 1 (또는 단편 3) 1 μl
단편 2 (또는 단편 4) 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
R536K/R660V
10ⅹpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5ⅹ인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 26 μl
단편 2 1 μl
단편 3 1 μl
단편 5 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
그 결과, 도 1의 (c)에 나타난 바와 같이 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V"의 Taq 중합효소가 증폭되었음을 확인하였다.
1-3. 라이게이션
pUC19을 하기 표 11의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고 정제된 DNA를 표 12의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
10ⅹCutSmart 버퍼 (NEB) 2.5 μl
pUC19 (500 ng/μl) 21.5 μl
EcoRI-HF (NEB) 0.5 μl
XbaI (NEB) 0.5 μl
　 25 μl
10ⅹSAP 버퍼 (로슈) 2 μl
정제된 DNA 17 μl
SAP (로슈) 1 μl
　 20 μl
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 1-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 13의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 2).
10ⅹCutSmart 버퍼 (NEB) 2 μl
정제된 PCR 산물 17 μl
EcoRI-HF (NEB) 0.5 μl
XbaI (NEB) 0.5 μl
　 20 μl
표 14의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 원하는 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V")를 수득하였다.
　 벡터 단독 벡터+인서트
10ⅹ연결효소 버퍼 (솔젠트) 1 μl 1 μl
벡터 1 μl 1 μl
인서트 - 3 μl
증류수 7 μl 4 μl
T4 DNA 연결효소 (솔젠트) 1 μl 1 μl
　 10 μl 10 μl
E507K 변이의 도입
2-1. 단편 PCR
상기 실시예 1에서 제조된 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V" 각각에 추가로 E507K 변이(서열번호 22의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기를 글루탐산에서 리신으로 치환)를 도입하였으며, 야생형 (WT) Taq DNA 중합효소에도 E507K 변이를 도입하였다. E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소의 제조방법은 실시예 1과 동일하다.
표 15에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 3에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F6 내지 F7)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 16와 같다.
프라이머 서열 (5'→3') 서열번호
Eco-F GG GGTACC TCA TCA CCC CGG 24
E507K-R CTT GCC GGT CTT TTT CGT CTT GCC GAT 25
E507K-F ATC GGC AAG ACG AAA AAG ACC GGC AAG 26
Xba-R GC TCTAGA CTA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA 29
10ⅹpfu 버퍼 (솔젠트) 2.5 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
F 프라이머 (10 pmol/μl) 1 μl
R 프라이머 (10 pmol/μl) 1 μl
증류수 18 μl
주형 플라스미드 (10 ng/μl) 1 μl
Pfu 중합효소 0.5 μl
30 사이클 (Ta=60℃) 25 μl
*주형 플라스미드: pUC19-Taq (WT)pUC19-Taq (R536K)pUC19-Taq (R660V)
pUC19-Taq (R536K/R660V)
2-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 2-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 17과 같다.
10ⅹpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5ⅹ인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 27 μl
단편 6 1 μl
단편 7 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
2-3. 라이게이션
pUC19을 표 11의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고, 정제된 DNA를 표 12의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 2-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 13의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 4).
표 14의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α 또는 DH10β에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("E507K/R536K", "E507K/R660V" 및 "E507K/R536K/R660V")를 수득하였다.
프라이머 및 프로브의 제작
SARS-CoV-2를 특이적으로 검출하는, S, N 및 RdRp 유전자를 표적하는 프라이머와 프로브, SARS-CoV-1/2 공통인 E 유전자를 표적하는 프라이머와 프로브 및 내부 대조군으로 사용하기 위한 RPP30 (RNase P) 유전자를 표적하는 프라이머 및 프로브를 디자인하기 위해 OligoAnalyzer Tool (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) 프로그램과 Multiple primer analyzer (https://www.thermofisher.com/kr/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html) 를 이용하여 프라이머 크기, Tm값, 프라이머 GC 함량, 프라이머 내에 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)이 있는지의 여부, 2차 구조(secondary structure)의 형성 가능성, 프라이머 간의 homo-dimer, hetero-dimer 형성 가능성을 배제한 후 표 18에 나타난 바와 같이 프라이머를 디자인하였다.
디자인된 프라이머는 BLAST 분석 (Nucleotide BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 통해 해당서열이 검출하고자 하는 SARS-CoV-2에 특이적인 것을 확인하였으며, 표 6의 병원체를 포함한 NCBI 데이터베이스의 서열에 대한 교차반응 가능성이 없음을 확인하였다. 다만, E 유전자는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역이므로, E 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브는 예외적으로 SARS-CoV-1에 대해 BLAST 결과가 도출되었다.
서브세트 표적 영역 프라이머/ 프로브 서열 (5'-3') 서열 번호 Ref. 유전체 (NC_045512)에서의 영역
SARS-CoV-2 특이적 프라이머 S S_F1 GGG TTA TCT TCA ACC TAG GAC TTT TC 1 22363-22488
S_R1 TCT ACA GTG AAG GAT TTC AAC GTA C 2
S_FAM1 CTG TGC ACT TGA CCC TCT CTC AGA AA 3
N N_F2 GCA GAG ACA GAA GAA ACA GCA A 4 29422-29514
N_R2 GCA CTG CTC ATG GAT TGT T 5
N_FAM2 CTT CCT GCT GCA GAT TTG GAT GAT T 6
RdRp
(Set 1)		 RdRp_F1 CAT ACA AAC CAC GCC AGG TAG T 7 14106-14241
RdRp_R1 CTT AAT GTA AGG CTT TGT TAA GTC AGT G 8
RdRp_FAM1 ATT AAC CTT GAC CAG GGC TTT AAC TGC A 9
RdRp
(Set 2)		 RdRp_F2 CAA ACA TAC AAC GTG TTG TAG CTT G 10 13963-14119
RdRp_R2 AGT TGT GGC ATC TCC TGA TGA G 11
RdRp_FAM2 TAA TGA GTG TGC TCA AGT ATT GAG TGA AAT 12
RdRp
(Set 3)
 RdRp_F4 CCT TGA CCA GGG CTT TAA C 13 14177-14283
RdRp_R4 TTT TAA CCT CTC TTC CGT GAA G 14
RdRp_FAM4 TGT AAG GCT TTG TTA AGT CAG TGT C 15
SARS-CoV-1/2
공통 프라이머		 E E_F1 GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GTA CTT C 16 26272-26382
E_R1 AAT ATT GCA GCA GTA CGC ACA C 17
E_CFO560 ACT AGC CAT CCT TAC TGC GCT TCG A 18
내부 대조군 RPP30
(RNase P)		 RPP30 F2 GAT GCA AAT CTG CAA AGG AAA GA 19 　
RPP30 R2 CCC AAA CAG CAA GCC TAG AT 20
RPP30 QS670_2 TAA GAG GGC CAT ATG ACG TGG CAA 21
SARS-CoV-2 검출
4-1. 시료의 준비
현재 2019-nCoV의 정량화된 바이러스 분리물은 이용할 수 없으므로, 각 유전자 플라스미드 (Ref. 유전체 (genome): NC_045512)로부터 시험관 내 전사된 RNA (IVT RNA)로 테스트를 수행하였다. S 유전자의 IVT RNA (SARS-CoV-2 레퍼런스 유전체: NC_045512의 21536-23500 nt 영역), N 유전자의 IVT RNA (SARS-CoV-2 레퍼런스 유전체: NC_045512의 28274-29533 nt 영역), RdRp 유전자 IVT RNA (SARS-CoV-2 레퍼런스 유전체: NC_045512의 13901-15530 nt 영역) 및 E 유전자 IVT RNA (SARS-CoV-2 레퍼런스 유전체: NC_045512의 26245-26472 nt 영역)로 테스트를 수행하였다.
4-2. SARS-CoV-2 검출
상기 실시예 2에서 수득한 E507K/R536K/R660V"변이를 포함하는 Taq 중합효소 (서열번호 23)와 표 18의 프라이머 세트 및 프로브를 사용하여 각 유전자의 SARS-CoV-2 합성 RNA (IVT RNA)의 특성화된 스톡 (characterized stocks)의 10배 연속 희석물 (104, 103, 102 및 101)을 테스트하였다. 구체적인 qPCR 실험 조건은 하기 표 19 및 20과 같다.
SARS-CoV-2 반응 마스터 혼합물
성분 테스트 당 부피 (μL)
뉴클레아제 무첨가 수 3
2X One-step RT-qPCR MMX 10
10X 프라이머/프로브 믹스 2
시료 5
총 20
사이클링 파라미터
단계 사이클 온도 시간 데이터 수집
UNG 배양 1 1 25℃ 2분 -
역전사 2 1 50℃ 15분
초기 변성 3 1 95℃ 5분
변성 4 45 95℃ 10초 -
어닐링 5* 60℃ 30초 FAM / VIC / CY5
연장 6 72℃ 10초 -
* 단계 5의 데이터 수집. 60℃에서 형광이 검출됨.
도 5 내지 10에서 확인되는 바와 같이, E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 상기 표 18의 프라이머 세트 및 프로브와 조합하여 사용하는 경우 각각 표적하는 유전자를 모든 시료에서 검출할 수 있었다.
4-3. 검출 한계 (LoD) 확인
LoD를 확인하기 위해, 각 유전자의 SARS-CoV-2 합성 RNA (IVT RNA)의 특성화된 스톡 (characterized stocks)의 10배 연속 희석물을 LoD에 근접한 농도의 5개의 희석된 시료 (8카피/rxn, 6카피/rxn, 4카피/rxn, 3카피/rxn 및 2카피/rxn)로 준비하였고, 이들 각 시료에 대해 20회 반복 테스트를 수행하였다. AB 7500 Fast (Applied Biosystems 7500 Fast) 및 Bio-rad CFX96에서의 LoD를 각각 표 21 및 22에 나타냈다.
AB 7500 Fast에서 검출 한계 확인
표적 RNA 농도* 양성/전체 % 반복 검출
(Replicate Detection)		 평균 Ct** 표준 편차 (Ct)
2019-nCoV_N 8 카피/반응 24/24 100.0 33.8 0.6
6 카피/반응 24/24 100.0 34.3 0.5
4 카피/반응 24/24 100.0 34.9 0.7
3 카피/반응 23/24 95.8 35.5 0.7
2 카피/반응 18/24 75.0 36.6 1.2
2019-nCoV_S 8 카피/반응 24/24 100.0 34.9 0.7
6 카피/반응 24/24 100.0 35.4 0.7
4 카피/반응 24/24 100.0 35.9 0.8
3 카피/반응 24/24 100.0 36.3 0.9
2 카피/반응 21/24 87.5 37.4 2.0
2019-nCoV_RdRp
(Set 1)		 8 카피/반응 24/24 100.0 34.1 0.5
6 카피/반응 24/24 100.0 34.3 1.1
4 카피/반응 22/24 91.7 36.3 1.0
3 카피/반응 22/24 91.7 36.6 1.1
2 카피/반응 16/24 66.7 37.2 1.4
2019-nCoV_E 8 카피/반응 24/24 100.0 32.8 1.1
6 카피/반응 24/24 100.0 33.1 0.8
4 카피/반응 18/24 75.0 34.8 1.6
3 카피/반응 11/24 45.8 35.2 1.7
2 카피/반응 9/24 37.5 35.3 1.7
Bio-rad CFX96에서 검출 한계 확인
표적 RNA 농도* 양성/전체 % 반복 검출
(Replicate Detection)		 평균 Ct** 표준 편차 (Ct)
2019-nCoV_N 8 카피/반응 24/24 100.0 34.0 0.3
6 카피/반응 24/24 100.0 34.6 0.3
4 카피/반응 24/24 100.0 34.9 0.0
3 카피/반응 24/24 100.0 35.2 0.2
2 카피/반응 23/24 95.8 36.3 0.3
2019-nCoV_S
(Set 1)		 8 카피/반응 24/24 100.0 34.5 0.1
6 카피/반응 24/24 100.0 35.1 0.1
4 카피/반응 24/24 100.0 35.3 0.1
3 카피/반응 24/24 100.0 35.6 0.1
2 카피/반응 20/24 83.3 36.5 0.2
2019-nCoV_RdRp 8 카피/반응 24/24 100.0 34.5 0.4
6 카피/반응 24/24 100.0 34.8 0.5
4 카피/반응 24/24 100.0 35.7 0.8
3 카피/반응 23/24 95.8 36.4 0.6
2 카피/반응 22/24 91.7 37.5 0.7
2019-nCoV_E 8 카피/반응 24/24 100.0 32.9 0.2
6 카피/반응 24/24 100.0 33.4 0.1
4 카피/반응 21/24 87.5 34.0 0.3
3 카피/반응 21/24 87.5 35.5 0.1
2 카피/반응 14/24 58.3 35.8 0.7
* 농도는 RNA 카피/반응으로 나타냄.
* 평균 Ct는 양성 결과만 포함함.
표 21 및 22에서 확인되는 바와 같이, E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 상기 표 18의 프라이머 세트 및 프로브와 조합하여 사용한 SARS-CoV-2 검출 방법은 2~6 카피/rxn의 검출 한계 (LoD)를 나타낸다. 구체적으로, AB 7500 Fast에서 3~6 카피/rxn, Bio-Rad CFX96에서 2~6 카피/rxn을 나타냈다.
교차 반응 확인
상기 실시예 2에서 수득한 "E507K/R536K/R660V" 변이를 포함하는 Taq 중합효소 (서열번호 23), 표 18의 각 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브로 표 6의 31종의 바이러스 및 유기체 (organisms)에 대한 교차 반응을 테스트하였다 (wet-tested). 모든 바이러스 및 유기체는 핵산으로 테스트되었고, 각 바이러스 및 유기체는 표 23에 나타낸 농도로 표 19의 RT-qPCR 반응 마스터 혼합물에 직접 혼합하였다 (spiked).
교차 반응 테스트
이름 공급원 농도 FAM
(RdRp, S및 N 유전자)		 VIC
(E 유전자)
Human Coronavirus 229E KBPV (KBPV-VR-9) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Coronavirus HKU1 ATCC (VR-3262SD) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Coronavirus OC43 ATCC (VR-1558DQ) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Coronavirus NL63 ATCC (VR-3263SD) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
MERS-CoV ATCC (VR-3248SD) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
SARS-CoV 플라스미드 6x103카피/rxn 0/3 3/3
Human Adenovirus 1 KBPV (VR-1) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Adenovirus 3 KBPV (VR-2) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Cytomegalovirus KBPV (VR-7) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human rhinovirus B14 KBPV (VR-39) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human parainfluenza virus 1 KBPV (VR-44) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human parainfluenza virus 2 KBPV (VR-45) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human parainfluenza virus 3 KBPV (VR-46) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Influenza A virus (H1N1) NCCP (42004) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Influenza A virus (H3N2) NCCP (42471) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Influenza B virus NCCP (43027) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human respiratory syncytial virus A NCCP (43238) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human respiratory syncytial virus B NCCP (43239) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Human Rhinovirus A1 NCCP (43226) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Coxsackie (B3) NCCP (43221) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Echovirus (E6) NCCP (41001) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Mumps virus (H) NCCP (40001) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Measles virus NCCP (40204) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Streptococcus pyogenes NCCP (72067) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Klebsiella pneumoniae NCCP (72008) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Pseudomonas aeruginosa NCCP (72006) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Haemophilus influenzae NCCP (72020) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Streptococcus pneumonia NCCP (72003) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Legionella pneumophila NCCP (72002) 2x104카피/rxn 0/3 0/3
Mycobacterium Tuberculosis vircell (MBC034) 1x104카피/rxn 0/3 0/3
Mycobacterium Avium vircell (MBC086) 1x104카피/rxn 0/3 0/3
표 23에서 확인되는 바와 같이, E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq 중합효소를 상기 표 18의 각 유전자를 표적하는 프라이머 세트 및 프로브와 조합하여 사용한 SARS-CoV-2 검출 방법은 표 6의 31종의 병원체에 대해 교차 반응을 나타내지 않았다. 다만, E 유전자는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역이므로, E 유전자에 대한 프라이머 세트 및 프로브는 예외적으로 SARS-CoV-1에 대해 교차 반응성을 나타냈다.
UNG 시스템 적용 시 표적 유전자의 증폭 효율 확인
dNTP 단독과 dNTP/dUTP 혼합 사용 시, WT Taq DNA 중합효소 및 E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소의 표적 유전자 증폭 효율을 비교하기 위해 HEK293T 총 RNA를 시료로 하여 GAPDH 유전자 검출 효능을 평가하였다. 사용된 GAPDH 프라이머 세트 및 프로브 정보, RT-qPCR 조건 및 dNTP 또는 dNTP+dUTP 처리 조건은 표 24 내지 27과 같다. Taq DNA 중합효소와 RTase는 각각 4U 및 24U의 양으로 처리하였다.
프라이머/프로브 서열 (5' - 3') 서열번호 형광물질/소광물질
GAPDH F 프라이머 GAA GGT GAA GGT CGG AGT 30
GAPDH R 프라이머 GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC 31
GAPDH 프로브 CAA GCT TCC CGT TCT CAG CCT 32 FAM/BHQ1
성분 부피 (μL)
2X One-step RT-qPCR MMX 10
HEK293T total RNA (5 ng/ μL) 2
뉴클레아제 무첨가 수 4
GAPDH 프라이머 믹스 (각 2 μM) 2
GAPDH 프로브 (FAM, 4 μM) 2
총 20
사이클링 파라미터
단계 사이클 온도 시간 데이터 수집
UNG 배양 1 1 25℃ 2분 -
역전사 2 1 50℃ 15분
초기 변성 3 1 95℃ 5분
변성 4 45 95℃ 10초 -
어닐링 5* 60℃ 30초 FAM
연장 6 72℃ 10초 -
* 단계 5의 데이터 수집. 60℃에서 형광이 검출됨.
구성 최종 농도
dNTP dNTP + dUTP
dATP 250 uM 210 uM
dCTP 250 uM 210 uM
dGTP 250 uM 210 uM
dTTP 250 uM 150 uM
dUTP - 420 uM
도 11 및 표 28에서 확인되는 바와 같이, WT Taq DNA 중합효소의 경우 UNG 시스템 적용 시 Ct 지연 및 형광 신호가 감소되는 문제점이 확인되었으나, E507K/R536K/R660V 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소는 WT Taq DNA 중합효소에 비해 낮은 Ct 값을 나타내어 표적 유전자의 증폭 효율이 현저하게 개선되었고, 뚜렷한 형광 신호를 나타냈다.
dNTP dNTP + dUTP
Taq (WT) E507K/R536K/R660V ΔCt Taq (WT) E507K/R536K/R660V ΔCt
Taq 4U
Rtase 24U		 26.2 21.4 4.8 28.8 22.2 6.6
SEQUENCE LISTING <110> GeneCast Co., Ltd. <120> DNA polymerase for detecting SARS-CoV-2 and kit comprising the same <130> 1067532 <160> 33 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> S_F1 primer <400> 1 gggttatctt caacctagga cttttc 26 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> S_R1 primer <400> 2 tctacagtga aggatttcaa cgtac 25 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> S_FAM1 probe <400> 3 ctgtgcactt gaccctctct cagaaa 26 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> N_F2 primer <400> 4 gcagagacag aagaaacagc aa 22 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> N_R2 primer <400> 5 gcactgctca tggattgtt 19 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> N_FAM2 probe <400> 6 cttcctgctg cagatttgga tgatt 25 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_F1 primer <400> 7 catacaaacc acgccaggta gt 22 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_R1 primer <400> 8 cttaatgtaa ggctttgtta agtcagtg 28 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_FAM1 probe <400> 9 attaaccttg accagggctt taactgca 28 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_F2 primer <400> 10 caaacataca acgtgttgta gcttg 25 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_R2 primer <400> 11 agttgtggca tctcctgatg ag 22 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_FAM2 probe <400> 12 taatgagtgt gctcaagtat tgagtgaaat 30 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_F4 primer <400> 13 ccttgaccag ggctttaac 19 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_R4 primer <400> 14 ttttaacctc tcttccgtga ag 22 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RdRp_FAM4 probe <400> 15 tgtaaggctt tgttaagtca gtgtc 25 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> E_F1 primer <400> 16 ggtacgttaa tagttaatag cgtacttc 28 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> E_R1 primer <400> 17 aatattgcag cagtacgcac ac 22 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> E_CFO560 probe <400> 18 actagccatc cttactgcgc ttcga 25 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RPP30 F2 primer <400> 19 gatgcaaatc tgcaaaggaa aga 23 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RPP30 R2 primer <400> 20 cccaaacagc aagcctagat 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RPP30 QS670_2 probe <400> 21 taagagggcc atatgacgtg gcaa 24 <210> 22 <211> 832 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Thermus aquaticus DNA polymerase (Taq) <400> 22 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 <210> 23 <211> 832 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Taq E507K/R536K/R660V <400> 23 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Glu Lys Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Lys Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Val Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Eco-F <400> 24 ggggtacctc atcaccccgg 20 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R536K-R <400> 25 cttggtgagc tccttgtact gcaggat 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R536K-F <400> 26 atcctgcagt acaaggagct caccaag 27 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R660V-R <400> 27 gatggtcttg gccgccacgc gcatcagggg 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R660V-F <400> 28 cccctgatgc gcgtggcggc caagaccatc 30 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Xba-R <400> 29 gctctagact atcactcctt ggcggagagc ca 32 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH F primer <400> 30 gaaggtgaag gtcggagt 18 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH R primer <400> 31 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH probe <400> 32 caagcttccc gttctcagcc t 21 <210> 33 <211> 2499 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Taq E507K/R536K/R660V <400> 33 atgaggggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60 cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120 gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180 gcggtgatcg tggtctttga cgccaaggcc ccctccttcc gccacgaggc ctacgggggg 240 tacaaggcgg gccgggcccc cacgccggag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300 gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360 gtcctggcca gcctggccaa gaaggcggaa aaggagggct acgaggtccg catcctcacc 420 gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgtcctcca ccccgagggg 480 tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540 gactaccggg ccctgaccgg ggacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600 gagaagacgg cgaggaagct tctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660 ctggaccggc tgaagcccgc catccgggag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720 ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780 aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840 ctcctccacg agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900 ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960 cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020 gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080 ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140 gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200 gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260 gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320 ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380 ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440 cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500 cccgccatcg gcaagacgaa aaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560 gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtacaagga gctcaccaag 1620 ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680 cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740 ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tccgccgggc cttcatcgcc 1800 gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860 cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920 gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgcgtg 1980 gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040 gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100 cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160 gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220 cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280 atgaagctgg ctatggtgaa gctcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc 2340 cttcaggtcc acgacgagct ggtcctcgag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400 cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460 gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggagtga 2499

Claims (21)

  1. 서열번호 22의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq DNA 중합효소;
    S 유전자 영역에 특이적으로 결합하는 서열번호 1과 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로브;
    N 유전자 영역에 특이적으로 결합하는 서열번호 4와 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로브; 및
    RdRp 유전자 영역에 특이적으로 결합하는 서열번호 7과 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 9의 뉴클레오티 서열로 이루어진 프로브;
    를 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트로서,
    SARS-CoV-2 검출 한계는 2 카피/반응 내지 6 카피/반응인, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 키트는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 공통 영역인 E 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 E 유전자에 결합하는 서열번호 16과 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  9. 제1항에 있어서, 상기 키트는 내부 대조군 (internal control)으로 인간 RPP30 (RNase P) 유전자에 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 추가로 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인간 RPP30 유전자에 결합하는 서열번호 19와 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  11. 제1항 및 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 각각 5'-말단에 FAM, CAL Fluor Orange 560, VIC, HEX, JOE, Quasar 670 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질 (fluorophore)이 표지되고, 3'-말단에 NFQ-MGB, BHQ-1 BHQ1 nova 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 소광물질이 표지되는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  12. 제1항 및 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG)를 추가로 포함하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 키트는 교차 오염 방지를 위한 dUTP 및 우라실-DNA N-글리코실라아제 (UNG) 시스템을 이용하는, SARS-CoV-2 검출용 키트.
  14. 다음의 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 검출방법:
    (a) 분리된 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 RNA에 제1항 및 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 키트를 처리하여 역전사 및 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 증폭시키는 단계; 및
    (c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 상기 분리된 생물학적 시료는 비인두 또는 구강인두 스왑 (swab), 비인두 흡인물 (aspirate), 기관지폐포세척액 및 가래로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, SARS-CoV-2 검출방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR (Real-time PCR)인, SARS-CoV-2 검출방법.
  17. 제14항에 있어서, (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함하는, SARS-CoV-2 검출방법.
  18. 다음의 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 검출방법:
    (a) 분리된 생물학적 시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 RNA에 제12항의 키트를 처리한 후 역전사 및 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하여 증폭시키는 단계; 및
    (c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
  19. 제18항에 있어서, 상기 분리된 생물학적 시료는 비인두 또는 구강인두 스왑 (swab), 비인두 흡인물 (aspirate), 기관지폐포세척액 및 가래로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, SARS-CoV-2 검출방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 PCR은 실시간 PCR (Real-time PCR)인, SARS-CoV-2 검출방법.
  21. 제18항에 있어서, (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함하는, SARS-CoV-2 검출방법.
KR1020200065463A 2020-05-29 2020-05-29 SARS-CoV-2 검출용 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트 KR102308286B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200065463A KR102308286B1 (ko) 2020-05-29 2020-05-29 SARS-CoV-2 검출용 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200065463A KR102308286B1 (ko) 2020-05-29 2020-05-29 SARS-CoV-2 검출용 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102308286B1 true KR102308286B1 (ko) 2021-10-05

Family

ID=78077541

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200065463A KR102308286B1 (ko) 2020-05-29 2020-05-29 SARS-CoV-2 검출용 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102308286B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101958659B1 (ko) * 2017-07-12 2019-03-18 주식회사 진캐스트 유전자 변이 특이적 증폭 효율이 증가된 dna 중합효소

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101958659B1 (ko) * 2017-07-12 2019-03-18 주식회사 진캐스트 유전자 변이 특이적 증폭 효율이 증가된 dna 중합효소

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Tetzner 등, Nucleic Acids Research, Vol. 35, No. 1, 페이지 1-7 (2006.11.28.)* *
Won 등, Exp Neurobiol., Vol. 29, No. 2, 페이지 107-119 (2020.04.30.)* *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA3019725C (en) Compositions and methods for detection of mycoplasma genitalium
JP5619602B2 (ja) クラミジア・トラコマチスを検出するためのプライマー及びプローブ配列
KR102030244B1 (ko) 뎅기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도
KR102297191B1 (ko) RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 이를 포함하는 키트
US11008626B2 (en) Compositions and methods for detection of drug resistant Mycobacterium tuberculosis
CA2925212C (en) Detecting single nucleotide polymorphism using hydrolysis probes with 3&#39; hairpin structure
KR102370550B1 (ko) Egfr 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트
KR102310819B1 (ko) Tert 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트
EP2714929B1 (en) Compositions and methods for detection of staphylococcus aureus
US20220290221A1 (en) Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations
KR102308286B1 (ko) SARS-CoV-2 검출용 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트
CA2967912C (en) Detecting single nucleotide polymorphism using overlapping hydrolysis probes
KR20190041314A (ko) 치쿤군야 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도
KR102281380B1 (ko) S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 이를 포함하는 키트
US6841346B1 (en) Methods for detecting bacteriophage MS2
US10370731B2 (en) Compositions and methods for detection of hepatitis C virus genotype 3
KR101753833B1 (ko) 절단 가능한 프로브를 이용한 만성골수성백혈병 유전자의 멀티플렉스 검출 방법
KR101443715B1 (ko) 반코마이신 내성 장구균의 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트
KR102291402B1 (ko) Jak2 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트
KR20190100675A (ko) Sfts 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도
US7642082B1 (en) Methods for determining the presence of staphylococcal enterotoxin A gene in a sample
WO2024042042A1 (en) Compositions and methods for detecting monkeypox virus
CN117441029A (zh) 用于检测具有刺突蛋白突变的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)变体的组合物和方法
WO2024003260A1 (en) Compositions and methods for detecting lymphogranuloma venereum (lgv) serovars of chlamydia trachomatis
JP2024517835A (ja) 二重標的アッセイによりデルタ型肝炎ウイルスを検出するための組成物及び方法

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
AMND Amendment
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant