KR101443715B1

KR101443715B1 - 반코마이신 내성 장구균의 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트

Info

Publication number: KR101443715B1
Application number: KR1020140037915A
Authority: KR
Inventors: 김정욱
Original assignee: 주식회사 현일바이오
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2014-11-04

Abstract

본 발명은 반코마이신 내성 장구균-특이적 프라이머 및 프로브를 이용하여 반코마이신 내성 장구균을 특이적으로 검출하는 방법 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 타겟 유전자(구체적으로는, 반코마이신 내성 유전자(vanA, vanB), 장구균의 ddl(D-alanine-D-alanine ligase) 유전자, 16S rRNA)-특이적인 프라이머와 프로브를 이용한 멀티플렉스 실-시간 PCR(multiplex real-time polymerase chain reaction)을 통해 반코마이신 내성 장구균을 매우 높은 효율로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 시료 내 타겟 유전자들을 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 반코마이신 내성 장구균의 시료 내 감염 여부를 용이하게 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 치료에 적용될 수 있다.

Description

반코마이신 내성 장구균의 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트{Methods for Simultaneously Detecting Vancomycin-Resistant Enterococci and Kits Using the Same}

본 발명은 반코마이신 내성 장구균의 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트에 관한 것이다.

반코마이신 내성 장구균(Vancomycin-Resistant Enterococci, VRE)은 1987년 영국과 프랑스에서 처음 출현한 이래 세계적으로 발생이 급격히 증가하여 원내감염의 중요한 병원균이 되었다. 국내에서는 1992년 박 등이 백혈병 환자의 가검물에서 고도내성을 갖는 Enterococcus durans 1주를 보고하였다. 그 후 내성장구균의 분리빈도는 매우 낮았으나 1998년부터 경구용 반코마이신 사용 증가와 더불어 급격하게 증가하였다. 현재 중환자실에서 분리되는 Enterococcus faecium의 30-45%에서 반코마이신에 내성을 보이고 있어 적절한 감염관리가 필요하다.

반코마이신 내성장구균의 신속하고 민감한 검출은 감염 환자에게는 적절한 항균제 치료를 가능하게 하고 균 정착이 있는 환자에게는 적절한 감염관리를 시행하여 내성장구균의 전파를 예방할 수 있게 한다. 반코마이신내성 장구균 선별 고형배지에 접종하거나 선별 액체배지에서 증균 후 고형배지에 접종하는 통상의 검출방법은 검사 결과 보고까지 4-5일이 소요되어 감염관리에 문제가 되고 있다. 이에 중합효소연쇄반응 등을 이용하여 신속하고 정확하게 검출하는 방법이 내성장구균의 감시배양에 사용되었다. 실시간 중합효소연쇄반응법은 중합효소연쇄반응법보다 내성장구균을 더 신속하고 민감하게 검출하고 업무량도 적어 병원검사실에 더 적합하다. 반응시간이 짧고 실시간에 증폭산물을 민감하고 정확하게 확인 할 수 있어 반응 후 전기영동이 필요치 않기 때문이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 반코마이신 내성 장구균을 간편하고 신속하게 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 반코마이신 내성 장구균 검출 세트를 제작하여 멀티플렉스 실-시간 PCR을 실시함으로써 시료(예를 들어, 임상검체로부터 유래된 DNA 시료)로부터 반코마이신 내성 장구균을 특이적으로 간단하게 검출할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 반코마이신 내성 장구균 검출방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 반코마이신 내성 장구균 검출키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비결핵 마이코박테리아의 동시 검출방법을 제공한다:

(a) 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계;

(b) (ⅰ) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열의 프로브로 제1검출세트; 및 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열의 프로브로 이루어진 제2검출세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 검출세트; 및 (ⅱ) 서열목록 제4서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제6서열의 프로브로 이루어진 제3검출세트; 및 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 제4검출세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 검출세트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 증폭 결과를 분석하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열의 프로브로 제1검출세트; 및 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열의 프로브로 이루어진 제2검출세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 검출세트; (ⅱ) 서열목록 제4서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제6서열의 프로브로 이루어진 제3검출세트; 및 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 제4검출세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 검출세트; 및 (ⅲ) 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제15서열 및 서열목록 제16서열로 구성된 군으로부터 선택된 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 포함하는 반코마이신 내성 장구균 검출키트를 제공한다.

본 발명자들은 반코마이신 내성 장구균을 간편하고 신속하게 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 반코마이신 내성 장구균 검출 세트를 제작하여 멀티플렉스 실-시간 PCR을 실시함으로써 시료(예를 들어, 임상검체로부터 유래된 DNA 시료)로부터 반코마이신 내성 장구균을 특이적으로 간단하게 검출할 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 방법은 시료 내에서 반코마이신 내성 장구균을 매우 효과적이고 간편하게 분리 검출할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR; 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 및 제4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR; Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification, TMA; WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication; WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences; 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction, CP-PCR; 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR; 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA; 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 멀티플렉스 PCR, 실-시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상(예컨대, 임상검체인 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 분리된 DNA 시료)에서 타겟 유전자들을 동시에 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 시료에서 추출한 DNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 시료는 임상검체-유래된 시료로, 상기 임상검체는 객담, 타액, 혈액 및 소변을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 분리된 DNA 시료는 임상검체(예컨대, 객담, 타액, 혈액 또는 소변)로부터 추출된 DNA 시료를 포함한다. 시료에서 DNA를 추출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)).

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우(Klenow)” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 발명의 방법은 상술한 바와 같이 증폭된 타겟 유전자(구체적으로는, 반코마이신 내성 유전자(vanA, vanB), 장구균의 ddl(D-alanine-D-alanine ligase) 유전자 또는 16S rRNA)를 분석하여 반코마이신 내성 장구균을 검출할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 DNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에 있어서 (a) (ⅰ) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열의 프로브로 제1검출세트; 및 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열의 프로브로 이루어진 제2검출세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 검출세트; 및 (ⅱ) 서열목록 제4서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제6서열의 프로브로 이루어진 제3검출세트; 및 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 제4검출세트로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 검출세트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭 결과를 분석하는 단계를 포함하며 이를 통해 시료로부터 추출한 DNA에서 반코마이신 내성 장구균을 효과적이고 간편하게 검출 또는 정량할 수 있다.

본 발명의 반코마이신 내성 장구균의 검출방법에 이용되는 제1검출세트 및 제2검출세트는 반코마이신 내성 유전자를 검출할 수 있는 검출세트로서 사용되며, 제3검출세트 및 제4검출세트는 임상검체에서 분리되는 장구균의 대부분을 차지하는 Enterococcus faecium(5-10%)과 Enterococcus faecalis(90-95%) 균주를 각각 검출할 수 있는 검출세트로서 사용된다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 반코마이신 내성 장구균의 검출방법에는 제1검출세트 및 제2검출세트로 구성된 군으로부터 선택되는 반코마이신 내성 유전자 검출세트 및 제3검출세트 및 제4검출세트로 구성된 군으로부터 선택되는 장구균 검출세트의 조합을 이용하여 반코마이신 내성을 갖는 장구균을 검출할 수 있다.

상기 검출세트의 조합에 있어서 이용되는 프라이머 쌍 및 프로브에 따라 적합한 형광 채널(예컨대, 녹색채널(510 ± 5 nm), 노랑채널(555 ± 5 nm), 주황채널(610 ± 5 nm) 및 빨강채널(660 ± 10nm))을 가지도록 조합되는 경우도 검출세트의 조합으로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 반코마이신 내성 장구균을 동시에 검출할 수 있다.

실-시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실-시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 C _t 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실-시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실-시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실-시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 C _t 값이 산출된다.

실-시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 인터킬레이팅(interchelating) 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.

먼저, 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 인터킬레이팅 시약(SYBR 그린 I 또는 에티듐 브로마이드)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실-시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat., Vol 23(5): 513-521(2004)).

C _t (cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 C _t 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. C _t 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. C _t 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. C _t 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(http://www.appliedbiosystems.co.kr/).

한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5’-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3’-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = For fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 구체적으로는, TaqMan 프로브는 16S rRNA 유전자, vanA 또는 vanB 유전자 절편의 내부서열로 고안될 수 있다.

TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5’-말단은 상기 연장 프라이머의 3’-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3’-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5’-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.

TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red 628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC (546), BHQ-1 (534), BHQ-2 (579), BHQ-3 (672), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 VIC, HEX, FAM, Cy5, Cy5.5, ROX, BHQ-1, BHQ-2 및 MGB-기반 표지를 포함한다.

적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.

또한, TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자에 이용되는 비형광성 물질은 마이너 그루브 결합 모이어티(minor groove binding(MGB) moiety)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 “TaqMan MGB-컨쥬게이트 프로브(MGB-conjugate probe)”는 프로브의 3’-말단에 MGB와 컨쥬게이션된 TaqMan 프로브를 의미한다. MGB는 높은 친화도로 DNA의 마이너 그루브에 결합하는 물질로서, DPI3(dihydrocyclopyrroloindole tripeptide), 네트롭신(netropsin), 디스타마이신(distamycin), 렉시트롭신(lexitropsin), 미트라마이신(mithramycin), 크로모마이신(chromomycin) A3, 올리보마이신(olivomycin), 안트라마이신(anthramycin), 시비로마이신(sibiromycin), 펜타미딘(pentamidine), 스틸바미딘(stilbamidine), 베레닐(berenil), CC-1065, Hoechst 33258, DAPI(4’-6-diamidino-2-phenylindole), CDPI의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머, MPC(N-methylpyrrole-4-carbox-2-amide) 및 이의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

프로브와 MGB의 컨쥬게이션(conjugation)은 프로브와 이의 타겟 간에 형성되는 하이브리드의 안정성을 현저하게 증가시킨다. 보다 상세하게는, 증가된 안정성(즉, 혼성화 정도의 증가)는 정상 프로브와 비교하여 MGB-컨쥬게이트 프로브에 의해 형성된 하이브리드 듀플렉스의 증가된 Tm(melting temperature)을 유발한다. 따라서, MGB는 반데르발스 힘을 안정화시켜 프로브 길이의 증가 없이 MGB-컨쥬게이트 프로브의 Tm(melting temperature)를 증가시킴으로써 보다 엄격 조건 하의 Taqman 실-시간 PCR에서 더 짧은 프로브(예컨대, 21개 이하의 뉴클레오타이드)의 이용을 가능하게 해 준다.

또한, MGB-컨쥬게이트 프로브는 백그라운드 형광을 보다 효율적으로 제거시켜 준다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 TaqMan MGB-컨쥬게이트 프로브의 길이는 12-20 뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 5’-말단은 VIC, HEX, FAM, Cy5, Cy5.5 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되며, 상기 프로브의 3’-말단은 BHQ-1, BHQ-2 및 MGB로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 퀀처(quencher)로 변형될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 TaqMan MGB-컨쥬게이트 프로브의 농도는 50-900 nM이며, 보다 구체적으로는 100-600 nM이고, 보다 더 구체적으로는 150-400 nM이며, 보다 더욱 더 구체적으로는 200-300 nM이다.

본 발명에서 이용되는 타겟 핵산은 특별하게 제한되지 않으며, DNA(gDNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자를 모두 포함하며, 보다 구체적으로는 gDNA이다. 타겟 핵산이 RNA 분자인 경우에는 cDNA로 역전사 하여 사용한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 핵산은 임상검체로부터 유래된 핵산 시료를 포함하고, 보다 구체적으로는 임상검체로부터 유래된 바이러스 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 타겟 핵산을 연장 프라이머 및 프로브에 어닐링 또는 혼성화 시키는 방법은 당업계에 공지된 혼성화 방법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 반응 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.

본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 5’to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 효소이다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 바람직하게는 DNA 중합효소이다. 통상적으로 DNA 중합효소들은 5’to 3’뉴클레아제 활성을 가지고 있다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 주형-의존성 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함한다.

주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 촉매되는 “주형-의존성 연장반응”은 주형의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 합성하는 반응을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 반코마이신 내성 장구균-특이적 프라이머 및 프로브를 이용하여 반코마이신 내성 장구균을 특이적으로 검출하는 방법 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명의 방법은 타겟 유전자(구체적으로는, 반코마이신 내성 유전자(vanA, vanB), 장구균의 ddl(D-alanine-D-alanine ligase) 유전자, 16S rRNA)-특이적인 프라이머와 프로브를 이용한 멀티플렉스 실-시간 PCR(multiplex real-time polymerase chain reaction)을 통해 반코마이신 내성 장구균을 매우 높은 효율로 선택적으로 검출할 수 있다.

(ⅲ) 또한, 본 발명의 키트는 시료 내 타겟 유전자들을 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다.

(ⅳ) 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 반코마이신 내성 장구균의 시료 내 감염 여부를 선택적으로 용이하게 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 치료에 적용될 수 있다.

도 1a-1e는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 검출된 반코마이신 내성 장구균의 형광 검출 결과이다. Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기(Norm. Fluoro.)를 나타낸다.
도 1a는 주황채널(내적 대조군, 16S rRNA)을 나타내며, Threshold: 0.04, Ct < 37에서 피크가 관찰되면 DNA 추출이 양호하며 PCR 저해가 없음을 의미한다.
도 1b는 빨강채널(vanA 내성유전자)을 나타내며, Threshold : 0.04, Ct<37에서 피크가 관찰되면 양성으로 판정한다.
도 1c는 진홍채널(Enterococcus faecium)을 나타내며, Threshold : 0.04, Ct<37에서 피크가 관찰되면 양성으로 판정한다.
도 1d는 노랑채널(Enterococcus faecalis)을 나타내며, Threshold : 0.04, Ct<37에서 피크가 관찰되면 양성으로 판정한다.
도 1e는 녹색채널(vanB 내성유전자)을 나타내며, Threshold : 0.04, Ct<37에서 피크가 관찰되면 양성으로 판정한다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

실험균주

표준균주 6주(E.faecium ATCC 700221, E.faecalis ATCC 51299, E. gallinarum ATCC 49573, E. casseliflavus ATCC 25788, E. faecalis ATCC 29212, E. faecium ATCC 19434)와 임상검체에서 분리된 100주의 장구균을 대상으로 하였다. 반코마이신 6 μg/mL를 넣은 EA(Enterococcosel agar)와 반코마이신을 첨가하지 않은 EA에서 대상균주를 선별하였다. EA에서 자란 검은색 집락 적당량을 면봉에 묻혀 증류수 0.5 mL가 들어있는 1.5 mL 원심분리용 튜브에 풀고 10분 동안 끓은 물에 중탕시켰다. 13,000 rpm으로 3분간 원심분리한 후 상청액을 사용하였다.

프라이머 및 프로브 제작

서열 정렬에 기초하여, 본 발명자들은 목적 부위(regions of interest)를 찾고 Primer 3 program(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 또는 수작업으로 프라이머들 및 프로브들을 제작하였다. 보다 상세하게는, NCBI의 데이터베이스에서 얻을 수 있는 반코마이신 내성 유전자 및 장구균(E.faecalis, E. faecium)의 염기서열을 분석하여 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 본 연구에서 고안되어 이용된 실-시간 PCR 프라이머 및 프로브들은 표 1에 제시되어 있다. 각각의 튜브에는 해당 바이러스에 특이한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 및 프로브가 각각 동일한 량(5 pmole/μl 및 2 pmole/μl)으로 들어 있다.

다양한 비결핵 마이코박테리아 검출용 실-시간 PCR 프라이머 및 프로브

타겟 유전자		서열(5’→3’)	타겟 균주
*vanA* 유전자	정방향 프라이머	ttttgccgtttcctgtatcc	-
	역방향 프라이머	gttataaccgttcccgcaga
	Taqman 프로브	tcctcgctcctctgctgaaa
D-alanine-D-alanine ligase( *ddl* ) 유전자	정방향 프라이머	tgtcaaacctgcgaatatgg	Enterococcus faecium
	역방향 프라이머	ttgcagctcttctcggtttt
	Taqman 프로브	agtgtcggcattacaaaggcag
*vanB* 유전자	정방향 프라이머	tcgcattytctgagcctttt	-
	역방향 프라이머	gatttgattgtcggcgaagt
	Taqman 프로브	ttcctgatggatgcggaaga
D-alanine-D-alanine ligase( *ddl* ) 유전자	정방향 프라이머	gcgaattttcaggaaaacga	Enterococcus faecalis
	역방향 프라이머	ccatttggcccatgtaaaac
	Taqman 프로브	tgaagaagaagcgattgttttccc
박테리아 16S rRNA 유전자	정방향 프라이머	gctacacacgtgctacaatgg	내적 대조군
	역방향 프라이머	aaggcccgggaacgtatt
	Taqman 프로브	tgaagtcggaatcgctagtaatcg 또는 tgaagctggaatcgctagtaatcg

다중 실시간 중합효소연쇄반응법(multiplex real-time PCR)

Rotor-Gene multiplex PCR Kit (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 사용하여 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 다중 실시간 중합효소연쇄반응은 Rotor-Gene Q(QIAGEN Inc., 미국)을 이용하였다. 약 95℃에서 약 5분간 변성 공정을 1 사이클(cycle), 약 95℃에서 약 15초 간 변성, 약 63℃에서 약 15초 간 어닐링 및 연장 공정을 1 사이클로 하여, 40 사이클을 수행하였다. 이때, 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 반응물의 조성은 하기 표 2와 같다. 하기 프라이머-프로브 믹스에는 검출대상 유전자와 내적 대조군 대상유전자를 검출하는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 각각 동일한 량(10 pmole/㎕)으로 들어 있고 프루브는 각각 4 pmole/㎕이 들어 있었다. 따라서 반응에 사용되는 프라이머-프로브 믹스 1.25 ㎕에는 정방향 및 역방향 프라이머가 각각 12.5 pmole이 되고 프로브는 5 pmole이 들어 있게 되었다. 총 25 ㎕의 중합연쇄반응을 수행하는 반응물의 총부피가 25 ㎕이니 프라이머의 농도는 0.5 μM(12.5 pmoles/25 ㎕), 프로브는 0.2 μM(5 pmole/25 ㎕)가 사용되었다.

중합연쇄반응물의 구성 및 농도

성분		부피(㎕)	농도
2X Rotor-Gene Multiplex PCR Master Mix		12.5	1X
프라이머-프로브 혼합물	프라이머(10 pmole/㎕)	1.25	0.5 μM
	프로브(4 pmole/㎕)		0.2 μM
뉴클레아제-결핍 물		6.25	-
샘플 DNA 템플레이트		5	-
전체		25	-

다중 실시간 중합효소연쇄반응 중 결합 및 연장단계에서 프로브에 의해 생성된 형광을 Rotor-Gene Q(QIAGEN Inc., 미국)에서 측정한다. 상기 다중 실시간 중합효소연쇄반응 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 실시간 중합효소연쇄반응의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 실시간 모니터 상에서 FAM^TM 이 발색되는 경우 녹색채널(510±5nm), HEX^TM이 발색되는 경우 노랑채널(555±5nm), Cy5^TM이 발색되는 경우 빨강채널(660±10nm), ROX^TM이 발색하는 경우 주황채널(610±5nm ), Cy5.5^TM이 발색되는 경우 진홍채널(712 log pass)에서 표시하도록 지정하였다. 녹색채널(green channel), 노랑채널(yellow channel), 주황채널(orange channel), 빨강채널(red channel), 진홍채널(crimson channel)에서 형광을 관찰하였다.

실험결과

각 튜브에서 진홍채널의 역치(threshold) 값은 0.04로 지정하고 나머지 채널의 역치 값은 0.03으로 지정한 뒤 C_t 값을 확인한다. C_t 값이 <36에서 피크(peak)가 관찰되면 양성으로 판독한다.

반코마이신 내성 유전자 및 장구균(Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis)에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 이용한 실-시간 PCR은 해당 형광채널에서 타겟을 특이적으로 확인시켜 주었다(참고: 도 1a 내지 도 1e).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Hyunil-bio Co. <120> Methods for Simultaneously Detecting Vancomycin-Resistant Enterococci and Kits Using the Same <130> PN140117 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanA gene forward primer <400> 1 ttttgccgtt tcctgtatcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanA gene reverse primer <400> 2 gttataaccg ttcccgcaga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanA gene probe <400> 3 tcctcgctcc tctgctgaaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus faecium ddl gene forward primer <400> 4 tgtcaaacct gcgaatatgg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus faecium ddl gene reverse primer <400> 5 ttgcagctct tctcggtttt 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus faecium ddl gene probe <400> 6 agtgtcggca ttacaaaggc ag 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanB gene forward primer <400> 7 tcgcattytc tgagcctttt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanB gene reverse primer <400> 8 gatttgattg tcggcgaagt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vanB gene probe <400> 9 ttcctgatgg atgcggaaga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus faecalis ddl gene forward primer <400> 10 gcgaattttc aggaaaacga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus faecalis ddl gene reverse primer <400> 11 ccatttggcc catgtaaaac 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus faecalis ddl gene probe <400> 12 tgaagaagaa gcgattgttt tccc 24 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control forward primer <400> 13 gctacacacg tgctacaatg g 21 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control reverse primer <400> 14 aaggcccggg aacgtatt 18 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control probe1 <400> 15 tgaagtcgga atcgctagta atcg 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control probe2 <400> 16 tgaagctgga atcgctagta atcg 24

Claims

다음의 단계를 포함하는 반코마이신 내성 장구균의 검출방법:
(a) 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계;
(b) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열의 프로브로 구성된 제1검출세트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과를 분석하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 DNA 시료는 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 반코마이신 내성 장구균의 검출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제15서열 및 서열목록 제16서열로 구성된 군으로부터 선택된 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 반코마이신 내성 장구균의 검출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 반코마이신 내성 장구균의 검출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 프로브는 표지가 결합되어 있고, 상기 단계 (c)에서 증폭 결과의 분석은 상기 프로브로부터 발생되는 시그널을 검출하여 실시하는 것을 특징으로 하는 반코마이신 내성 장구균의 검출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 증폭은 실-시간(real-time) PCR에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 반코마이신 내성 장구균의 검출방법.
제 6 항에 있어서, 상기 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 반코마이신 내성 장구균의 검출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 제1검출세트에서 상기 프로브의 5’-말단은 HEX, FAM, Cy5, Cy5.5 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되며, 상기 프로브의 3’-말단은 BHQ-1 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 퀀처(quencher)로 변형될 수 있는 것을 특징으로 하는 반코마이신 내성 장구균의 검출방법.
(ⅰ) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열의 프로브로 구성된 제1검출세트; 및 (ii) 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제15서열 및 서열목록 제16서열의 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 포함하는 반코마이신 내성 장구균 검출키트.