KR101289310B1 - Ｍｒｓａ 검출 방법 및 이를 이용한 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다양한 프라이머 및 프로브를 이용한 3개의 타겟 유전자를 동시에 증폭하여 분석하여 MRSA를 검출하는 방법 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다. 본 발명은 타겟 유전자(바람직하게는, mecA, SCCmec/orfX 및 16S rRNA)-특이적인 프라이머와 프로브를 이용한 멀티플렉스 실-시간 PCR(real-time polymerase chain reaction)을 통해 MRSA를 효과적으로 검출하고 이를 다른 스트레인들과 용이하게 구별할 수 있다. 또한, 본 발명의 진단키트는 시료 내 타겟 유전자들을 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 MRSA의 정확한 진단 뿐 아니라 감염을 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 예후를 예측하고 치료에 적용될 수 있다.

Description

ＭＲＳＡ 검출 방법 및 이를 이용한 키트{Methods and Kits for Detecting Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus}
본 발명은 3개의 타겟 유전자의 동시 증폭 및 분석을 통해 시료 내 MRSA를 검출하는 방법 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다.
병원 및 지역 공동체(community settings)에서 빈번하게 나타나는 메티실린-저항성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)의 만연은 전세계적으로 공공 건강에 대한 큰 위험이다. 따라서, 신속하고 정확한 검출 및 적절한 중재는 MRSA의 유병률(prevalence)을 감소시킨다(1-3). 최근에, MRSA을 분자적으로 신속하게 검출하는 방법이 개발되었다. Huletsky 등(4)은 스타필로코커스 카세트 염색체(staphylococcal cassette chromosome, SCCmec)/orfX(open reading frame X) 정션(junction)을 증폭하는 단일-유전자 위치(single-locus)에 대한 실-시간(real time) PCR 어세이를 최초로 제안하였으며, 현재까지 SCCmec/orfX 정션의 검출에 기반하여 MRSA를 동정하는 상업적으로 유용한 많은 어세이 방법들이 있다(5-7). 상술한 어세이 방법들은 스크리닝 표본들로부터 MRSA의 직접적 검출을 위해 mecA 유전자와 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 특이적 유전자의 동시 검출에 기반 한 이중 유전자 위치에 대한 어세이(double-locus assays)보다 우수한 장점을 가진다. MSSA(methicillin-sensitive S. aureus)와 MRCoNS(methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci)가 섞여 있는 비강 면봉(nasal swabs)검체 등 임상 시료에서 상기 이중 유전자 위치에 대한 어세이들은 거짓-양성(false positive) MRSA 검출과 관련되기 때문이다(8). 그러나 거짓-양성 MRSA 검출은 SCCmec 잔여물(remnants)을 가진 MSSA 균주들이 MRSA로 오인됨으로써 단일 유전자 위치 어세이에서도 보고되고 있다(6, 7, 9-15).
MRSA는 수년 동안 대한민국에서 만연된 풍토병이었다. 임상 표본들로부터 회수된 S. aureus 분리체들 중 메티실린 저항성을 나타내는 비율은 2000년대에 67.8-74.1%에 달했다(16). SCCmec는 염색체에 삽입되거나 또는 절단될 수 있는 모바일 엘리먼트(mobile element)이다. 풍토성 MRSA 스트레인들로부터 SCCmec의 부분적 절단은 MSSA 분리체들에서 초래된다고 보고되었다(13, 15). 따라서, 고풍토성 지역에서, MRSA의 직접 검출을 위한 단일-유전자 위치에 대한 어세이는 SCCmec 잔여물을 가지는 MRSA에서 유래된 MSSA 균주들로 인해 거짓-양성 결과들을 초래할 가능성이 더 높은 듯 하다. 따라서, MRSA를 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 기술의 개발 필요성이 당업계에서 시급히 요구되고 있는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자는 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)를 검출 또는 정량할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자는 MRSA의 mecA, SCCmec/orfX 및 16S rRNA 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하여 실-시간 정량적 PCR을 실시함으로써 시료(바람직하게는, 혈액, 타액 또는 소변)로부터 MRSA를 특이적이고 간단하게 검출 및 정량할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)의 검출 또는 정량방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 MRSA 검출 또는 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)의 검출 또는 정량방법을 제공한다: (a) 시료를 준비하는 단계; (b) 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제6서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 역방향 프라이머 및 서열목록 제9서열의 프로브; 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제12서열의 프로브; 및 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제15서열의 프로브를 이용하여 상기 시료 내의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제6서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 역방향 프라이머 및 서열목록 제9서열의 프로브; 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제12서열의 프로브; 및 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제15서열의 프로브를 포함하는 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 검출 또는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명자는 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)를 검출 또는 정량할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자는 MRSA의 mecA, SCCmec/orfX 및 16S rRNA 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하여 실-시간 정량적 PCR을 실시함으로써 시료(바람직하게는, 혈액, 타액 또는 소변)로부터 MRSA를 특이적이고 간단하게 검출 및 정량할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 풍토병인 MRSA를 매우 효과적이고 간편하게 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.
본 명세서에 기재된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 멀티플렉스 PCR, 실-시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상(예컨대, 타겟 미생물을 포함하는 시료)에서 타겟 유전자들을 동시에 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 시료 내의 미생물에서 분리된 DNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
이렇게 증폭된 타겟 유전자(바람직하게는, mecA, SCCmec/orfX 및 16S rRNA)를 적합한 방법으로 분석하여 MRSA를 검출하는 것이다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 타겟 유전자를 검출할 수 있다.
따라서 본 발명의 방법을 미생물의 DNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) SCCmec/orfX 뉴클레오타이드 서열에 어닐링되는 프라이머 및 프로브; mecA 뉴클레오타이드 서열에 어닐링되는 프라이머 및 프로브; 또는 16S rRNA 뉴클레오타이드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 형광을 통해 분석하는 단계를 포함하며 이를 통해 시료로부터 추출한 DNA에서 MRSA를 검출 또는 정량할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 MRSA 스트레인은 CCARM 3792, CCARM 3795, CCARM 3798, CCARM 3803, CCARM 3805, CCARM 3877, CCARM 3897 및 CCARM 3911을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 용어 "혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 MRSA를 다른 미생물들과 구분하기 위해 3개의 유전자(mecA, SCCmec/orfX 및 16S rRNA)를 동시에 검출하는 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제6서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 역방향 프라이머 및 서열목록 제9서열의 프로브; 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제12서열의 프로브; 및 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제15서열의 프로브를 포함한다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트에서 이용되는 타겟 유전자는 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제6서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 역방향 프라이머 및 서열목록 제9서열의 프로브에 의해 검출되는 SCCmec/orfX 유전자; 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제12서열의 프로브에 의해 검출되는 mecA 유전자; 및 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제15서열의 프로브에 의해 검출되는 16S rRNA 유전자를 포함한다.
실-시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실-시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al ., PCR Methods Appl ., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 C t 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실-시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실-시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실-시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 C t 값이 산출된다.
실-시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요하 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.
먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques ., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실-시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al ., Clin Cancer Res ., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al ., Hum Mutat ., Vol 23(5): 513-521(2004)).
C t (threshold cycle) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 C t 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. C t 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. C t 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. C t 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(http://www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al ., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 바람직하게는, TaqMan 프로브는 서열목록 제13서열 및 제14서열에 의해 증폭되는 16S rRNA 유전자 절편 내부서열로 고안될 수 있다.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 모두 형광성 물질이다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM (506), YO-PROTM-1 (509), YOYOTM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorXTM (519), AlexaTM (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon GreenTM 500 (522), Oregon GreenTM 488 (524), RiboGreenTM (525), Rhodamine GreenTM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium GreenTM (531), Calcium GreenTM (533), TO-PROTM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3TM (570), AlexaTM 546 (570), TRITC (572), Magnesium OrangeTM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium OrangeTM (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine RedTM (590), Cy3.5TM (596), ROX (608), Calcium CrimsonTM (615), AlexaTM 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PROTM-3 (631), YOYOTM-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PROTM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5TM (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5(694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 바람직하게는, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 HEX, FAM 및 Cy5.5-기반 표지를 포함한다.
본 발명에서, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭 할 수 있는 비-형광 블랙 퀀처 분자가 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 비-형광 블랙 퀀처 분자의 예는 BHQ 및 DABCYL를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 BHQ1 및 BHQ2이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브에서 이용되는 리포터-퀀처 쌍은 HEX, FAM, Cy5.5, BHQ1 및 BHQ2-기반 표지를 포함한다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제9서열은 5'-말단의 형광물질로 HEX 및 3'-말단에 퀀처로 BHQ1을 이용하고, 본 발명의 서열목록 제12서열은 5'-말단의 형광물질로 FAM 및 3'-말단에 퀀처로 BHQ1을 이용하며, 본 발명의 서열목록 제15서열은 5'-말단의 형광물질로 Cy5.5 및 3'-말단에 퀀처로 BHQ2를 이용한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al ., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
본 발명에서 이용되는 타겟 핵산은 특별하게 제한되지 않으며, DNA(gDNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자를 모두 포함하며, 보다 바람직하게는 gDNA이다. 타겟 핵산이 RNA 분자인 경우에는 cDNA로 역전사 하여 사용한다. 타겟 핵산은 예컨대, 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다.
타겟 핵산을 연장 프라이머 및 프로브에 어닐링 또는 혼성화 시키는 방법은 당업계에 공지된 혼성화 방법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 반응 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al ., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 5' to 3' 뉴클레아제 활성을 가지는 효소이다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 바람직하게는 DNA 중합효소이다. 통상적으로 DNA 중합효소들은 5' to 3' 뉴클레아제 활성을 가지고 있다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 주형-의존성 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus, Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens , Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함한다.
주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 촉매되는 "주형-의존성 연장반응"은 주형의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 합성하는 반응을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 다양한 프라이머 및 프로브를 이용한 3개의 타겟 유전자를 동시에 증폭하여 분석하여 MRSA를 검출하는 방법 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다.
(b) 본 발명은 타겟 유전자(바람직하게는, mecA, SCCmec/orfX 및 16S rRNA)-특이적인 프라이머와 프로브를 이용한 멀티플렉스 실-시간 PCR(real-time polymerase chain reaction)을 통해 MRSA를 효과적으로 검출하고 이를 다른 스트레인들과 용이하게 구별할 수 있다.
(c) 또한, 본 발명의 진단키트는 시료 내 타겟 유전자들을 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다.
(d) 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 MRSA의 정확한 진단 뿐 아니라 감염을 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 예후를 예측하고 치료에 적용될 수 있다.
도 1은 209개의 MRSA 및 74개의 MRCoNS 분리주들에서 mecA, SCCmec/orfX 및 16S rRNA의 Ct 값들 간의 상관관계를 보여주는 결과이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시 예
실험결과
본 발명의 어세이 방법은 다양한 국제적 모집물(international collections)로부터 얻어진 레퍼런스 스트레인들(reference strains) 및 실험실로부터 얻어진 임상 분리주들 모두를 포함하는 444개의 스트레인들을 이용하여 평가되었다. 상기 레퍼런스 스트레인들은 8개의 MRSA 스트레인들(CCARM 3792, CCARM 3795, CCARM 3798, CCARM 3803, CCARM 3805, CCARM 3877, CCARM 3897 및 CCARM 3911), 4개의 MSSA 스트레인들(KCTC 1621, KCTC 1916, KCTC 1928 및 ATCC 29213), 그리고 11개의 코아귤라제-음성(coagulase-negative) 스타필로코커스 스트레인들(Staphylococcus epidermidis, KCCM 35494; Staphylococcus simulans, KCCM 41686; Staphylococcus capitis, KCCM 41466; Staphylococcus warneri, KCTC 3340; Staphylococcus haemolyticus, KCTC 3341; Staphylococcus xylosus, KCTC 3342; Staphylococcus intermedius, KCTC 3344; Staphylococcus saprophyticus, KCTC 3345; Staphylococcus cohnii, KCTC 3574; Staphylococcus caprae, KCTC 3583; 및 Staphylococcus auricularis, KCTC 3584)을 포함하였다. SCCmec 타이핑에 의해 확인된(17, 18) SCCmec 엘리먼트를 운반하고 있는 29개의 MSSA 분리주들이 대조군 스트레인들로 테스트되었다. 209개의 MRSA 스트레인들, 109개의 MSSA 스트레인들, 그리고 74개의 MRCoNS 스트레인들로 구성된 임상 분리주들은 대부분 상처, 타액(sputum), 혈액 및 소변 시료들로부터 회수되었다. 상술한 스타필로코커스 분리주들의 동정 및 민감성(susceptibility) 테스팅은 MicroScan WalkAway 96(Siemens Healthcare Diagnostics Inc., West Sacramento, CA, USA) 및 VITEK 2(bioMerieux Inc., Durham, NC, USA)-자동화된 동정 및 민감성 테스팅 시스템을 이용하여 실시하였다.
레퍼런스 스트레인들과 임상 분리주들은 혈액-아가 플레이트(Asan Pharmaceutical, seoul, Korea)에서 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 레퍼런스 스트레인들과 분리주들의 약 2-3개의 박테리아 콜로니들이 1 μl 루프(loop)로 수득하여 0.5 ml의 증류수에 현탁하였다. 상기 현탁액이 끓는 워터 배스에서 10분 동안 가열시킨 후, 13,000 x g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 상층액이 실-시간 PCR에 이용되었다.
SCCmec/orfX 정션, mecA, 및 스타필로코커스 16S rRNA 유전자들의 염기 서열은 NCBI GenBank로부터 얻어서 Sequencher 5.0 소프트웨어(Gene Codes Co., Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 정렬(align)하였다. 서열 정렬에 기초하여, 본 발명자들은 목적 부위(regions of interest)를 찾고 the Primer 3 program(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 또는 수작업으로 프라이머들 및 프로브들을 제작하였다. 상기 프라이머 서열의 해당 유전자 내 위치는 다음과 같다: (a) SCCmec, staphylococcus의 ORF(open reading frame); 및 (b) orfX, 3' 말단 근처의 attBscc 부위. 본 연구에서 고안되어 이용된 실-시간 PCR 프라이머 및 프로브들은 표 1에 제시되어 있다.
MRSA 검출용 실-시간 PCR 프라이머 및 프로브.
올리고뉴클레오타이드 서열(5'→3') 농도
(μM) 		타겟 a
FSCC_A
FSCC_B
FSCC_C
FSCC_D
FSCC_E
FSCC_F
BorfX1
BorfX2
Porfx
FmecA
BmecA
PmecA
F16SrRNA
B16SrRNA
P16SrRNA		 GCGGAGGCTAACTATGTCAA
CTTTATGAAGCGGCTGAAAA
ATATGTAATTCCTCCACATCTCATT
GGCTGAAGTAACCGCATCA
TTCATAATATGTGCTACGCAATC
CGGCAATTCTCATAAACCTC
CGCACTATCATTCAGCAAAA
GCAAAATGACATTCCCACA
HEX-TCAATTAACACAACCCGCATCAT-BHQ1
GAATGCAGAAAGACCAAAGC
TTCTTTGGAACGATGCCTAT
FAM-TTGGCCAATACAGGAACAGCA-BHQ1
CAGCTAACGCATTAAGCACT
TTGTCARAGGATGTCAAGATTT
Cy5.5-AAGCAACGCGAAGAACCTTACC-BHQ2		 0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.2
0.1
0.1
0.04
0.1
0.1
0.04		 I, II, IVa, IVb, IVc, IVg, VI, VIII
II, IVa, IVb, IVc, IVg, VI, IX
III, V, VII
IVe
X
IX, XI
orfX
orfX
orfX
mecA
mecA
mecA
16S rRNA
16S rRNA
16S rRNA
a숫자는 프라이머에 의해 증폭된 SCCmec 타입을 나타낸다. 약어: F, 정방향; B, 역방향; 및 P, 프로브.
실-시간 PCR 반응은 Rotor-gene Q 실-시간 PCR instrument(QIAGEN Inc., Germanμtown, MD, USA)을 이용하여 실시하였다. PCR 혼합물은 0.5 μl의 프라이머-프로브 믹스(mix), 5 μl의 2x Rotor-Gene 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA) 및 1.0 μl의 템플레이트 DNA를 포함하는 총 10 μl의 반응액으로 구성된다. PCR 조건은 다음과 같다: (a) PCR 사이클, (i) 전-변성(pre-denaturign) 단계, 95℃에서 5분; 및 (ii) 40 사이클, 95℃에서 15초 및 60℃에서 15초로 구성된 1 사이클; 및 (b) 검출 단계, 녹색, 황색 및 진홍색(crimson) 형광을 검출. PCR 완료 후, mecA, SCCmec/orfX 및 16S rRNA 유전자들의 Ct 값은 Rotor-gene Q 소프트웨어를 이용하여 기록하였다. 상관계수(r) 및 기술통계학을 포함하는 통계적 테스트들은 SPSS 13.0 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 실시하였다. 5% 레벨 이하의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실-시간 PCR의 분석 민감도(sensitivity)는 10배씩 연속적으로 희석된(10-fold serial dilutions) MRSA 스트레인 CCARM 3792의 계대배양액으로 결정하였다. 상기 스트레인이 혈액 아가 플레이트에서 하룻밤 동안 배양되어 0.5의 맥팔란드 탁도(McFarland turbidity number)와 동일한 밀도로 염 용액에 현탁시키고, 102에서 107까지 10배씩 연속적으로 희석하였다. DNA는 QIAamp DNA mini Kit 내 QIAcube(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 이용하여 박테리아 희석액(200 μl)으로부터 추출하여 50 μl에 녹였다. 동시에, 상기 박테리아 희석액(200 μl)이 혈액 아가에 플레이팅되어 24시간 동안 37℃에서 배양되었다. 이후, CFU(colony-forming units)가 카운팅되었다.
우선, 실-시간 PCR 어세이는 23개의 레퍼런스 스트레인들 및 29개의 MSSA 대조군 스트레인들에 대해 실시하였다. 예상된 PCR 산물은 레퍼런스 스트레인에서만 증폭되었다. 하지만, SCCmec/orfX는 29개의 대조군 스트레인들 중 6개에서 검출되지 않았다.
392개의 임상 분리주들에 대한 결과들은 다음과 같았다: 3개의 타겟들이 209개의 모든 MRSA(100%) 분리주들 및 4개의 MRCoNS(5.4%) 분리주들에서 동시에 검출되었다. 109개의 MSSA 분리주들 중, mecA 및 16S rRNA가 2개의 분리주들(1.8%)에서 동시에 검출되었으며, SCCmec/orfX 및 16S rRNA는 11개의 분리주들(10.1%)에서 모두 검출되었다. mecA의 Ct 값과 SCCmec/orfX 및 16S rRNA의 Ct 값이 비교되었다. mecA Ct 값과 SCCmec/orfX Ct 값 간의 상관계수는 MRSA 분리주들에서 높았고(r = 0.959; P < 0.0001), mecA Ct 값과 16S rRNA Ct 값 간의 상관계수는 MRSA 분리주들(r = 0.970; P < 0.0001) 및 MRCoNS 분리주들(r = 0.963; P < 0.0001)에서 높았다. 상술한 결과들은 도 1 및 표 2에 나타나 있다.
멀티플렉스 실-시간 PCR을 이용한 임상 분리주들에서의 MRSA 검출 결과.
종 분리주
의 수		 mecA SCCmec/orfX 16S rRNA SCCmec/orfX과 16S rRNA 간의 Ct 차이(Ctscc)b 16S rRNA와 mecA 간의 Ct 차이(Ct16S)b
양성 결과를 나타내는 분리주의 수 Ct 값a 양성 결과를 나타내는 분리주의 수 Ct 값a 양성 결과를 나타내는 분리주의 수 Ct 값a
MRSA

MSSA

MRCoNS		 209

109

74		 209

2

74		 16.71±2.44
35.40±1.36
15.48±2.36		 209
11
4		 19.02±2.59
29.32±2.45
34.98±2.35		 209

109

74		 17.35±2.73
17.95±2.87
15.61±2.41		 2.70±0.50



17.78±1.84		 1.08±0.70

-18.58±1.28
0.10±0.51
a, bCt(cycle threshold) 값은 평균값±표준편차로 표시된다.
그 결과, SCCmec/orfX와 mecA 간의 Ct 값 차이(CtSCC), 그리고 16S rRNA와 mecA Ct 값 차이(Ct16S)는 MRSA의 존재를 평가하는 데 이용되었다. CtSCC(≥ 4.7; mean+4SD)은 MRSA와 MRSA 이외의 스타필로코커스가 동시에 존재한다는 것을 나타내는 반면에, Ct16S(≤ -1.72; mean-4SD)은 MRSA와 mecA 유전자가 없는 스타필로코커스가 함께 존재한다는 것을 의미하였다.
어세이의 검출 한계(detection limit)는 MRSA 스트레인 CCARM 3792 스탁(stock) 용액의 1:104 희석액으로부터 정제된 게놈(genomic) DNA를 이용하여 실시하였으며, PCR 반응 당 20 CFU(colony forming unit)인 것으로 측정되었다.
현재, S. aureus의 orfX 및 SCCmec 엘리먼트의 오른쪽 최외곽 정션(right extremity junction)을 타겟팅하는 실-시간 PCR 어세이는 감염 대조군을 위해 이용되고 있다(19-22). 이전 연구들은 상술한 단일-유전자 위치 어세이에서 각각 0.0%부터 7.3%까지의 거짓 음성 결과들 및 0.0%부터 5.4%까지의 거짓 양성 결과들을 보고하였다(4, 6, 23-25). 거짓 음성 및 양성 결과들은 전체 감염 조절 프로그램에 영향을 미쳐 병원 내 MRSA 전파 및 불필요한 동정 및 보균제거(decolonization) 과정을 실시하게 한다. 알려지지 않은 SCCmec 타입을 가진 MRSA가 시료 내에 존재한다면, 거짓 음성 결과가 나올 수 있다. 현재까지, 11개의 다른 타입의 SCCmec들이 S. aureus에 알려져 있다(http://www.sccmec.org/). 이에, 본 발명자는 알려진 모든 타입의 SCCmec들을 검출하기 위해 6개의 정방향 프라이머, 2개의 역방향 프라이머 및 1개의 프로브를 제작하였다.
본 발명자가 아는 한, 한국에서 거짓 양성의 경우가 SCCmec/orfX 정션을 타겟팅하는 실-시간 PCR 어세이를 통해 보고되지 않았다. 본 발명자는 낮은 MRSA 풍토병을 나타내는 나라들에서보다 더 높은 거짓 양성 결과들을 예측하였다. 예측한 대로, 거짓 양성 결과들이 3개월 이상 본 발명자의 실험실에서 3개월 이상 수집된 스타필로코커스의 임상 분리주들에서 10.1%였다. 거짓 양성 결과들의 비율이 높다면, 단일-유전자 위치에 대한 실-시간 PCR 어세이의 진단값은 높은 MRSA 풍토성(endemicity)에 대한 실험에 적합하지 않다. 따라서, 본 발명자는 SCCmec 잔여물을 운반하고 mecA 유전자가 없는 MSSA 분리주들을 제외하기 위해 mecA 유전자 및 SCCmec/orfX 정션의 동시 증폭을 고려하였다. 하지만, 상기 동시 증폭 방법도 SCCmec 잔여물을 포함하는 MRCoNS 및 MSSA가 임상 시료에 모두 존재하는 경우에 거짓 양성 결과를 초래할 수 있다. 따라서, 거짓 양성 결과들을 감소시키기 위해 스타필로코커스 16S rRNA 유전자가 타겟으로 부가되었다. 진짜 MRSA에서, Ct 값으로 표현되는 상기 3개의 타겟 유전자들의 카피 수는 모두 동일한 반면에, SCCmec 잔여물을 포함하는 MRCoNS 및 MSSA이 복합된 개체들(populations)의 경우, 상기 유전자들의 카피 수가 대부분 다를 것이다.
본 발명자는 SCCmec 잔여물을 포함하는 MRCoNS 및 MSSA이 복합된 개체들이 상기 3개의 타겟들의 상대적인 정량을 통해 구별될 수 있는 지 여부를 테스트하였다. MRSA 및 MRSA 이외의 스타필로코커스로부터 유래한 게놈 DNA의 혼합물 및 SCCmec 잔여물을 포함하는 MRCoNS 및 MSSA의 혼합물을 포함하는 스타필로코커스 게놈 DNA 시료들의 복합 칵테일이 상기 3개의 타겟을 증폭하는 데 이용되었다. 이후, 증폭된 시료들이 분석되었다(결과를 보이지 않음). 본 발명자들은 SCCmec 잔여물을 포함하는 MRCoNS 및 MSSA는 CtSCC 값이 ≥ 4.7이고 Ct16S 값이 ≤ -1.72인 경우에만 동시에 존재하였고, MRSA 및 MRCoNS의 혼합 개체군들은 CtSCC 값이 ≥ 4.7이고 Ct16S 값이 ≤ -1.71인 경우에 SCCmec 잔여물을 포함하는 MRCoNS 및 MSSA와 구별할 수 없다는 것을 확인하였다.
본 연구에서, 4개의 MRCoNS 분리주들은 3개의 타겟들의 동시 증폭물을 생산하였다: CtSCC 값은 각각 19.69, 17.50, 18.55 및 15.37이었으며; Ct16S 값은 각각 0.61, -0.97, -0.31 및 0.09이었다. 상술한 경우들은 MRSA 및 MRCoNS의 복합물 또는 SCCmec 잔여물을 포함하는 MRCoNS 및 MSSA의 복합물로부터 얻은 결과였다. 대한민국에서, SCCmec 잔여물을 포함하는 MSSA는 임상 표본들로부터 회수된 S. aureus의 약 3%에 달할 것으로 추정되는데, 이는 약 30%의 S. aureus 분리주들이 MSSA 및 10%의 SCCmec 잔여물을 포함하는 MSSA이기 때문이다. Becker의 연구에 따르면, MSSA와 MRCoNS에 의한 비강 공동-군체(cocolonization)는 약 3.4%의 환자들에서 관찰되었다(8). 더욱이, SCCmec 잔여물을 포함하는 MSSA가 15 이상의 CtSCC 값을 가지는 혼합된 개체군들 중 90% 이상이라는 것을 분석된 시료들로부터 확인하였다. 따라서, SCCmec 잔여물을 포함하는 MRCoNS 및 MSSA의 혼합 개체군들로부터 상기 3개의 타겟들이 동시 증폭될 가능성이 매우 낮다.
결론적으로, 본 발명자는 본 발명의 멀티플렉스 실-시간 PCR 어세이 방법이 SCCmec/orfX 정션을 증폭하는 단일-유전자 위치 실-시간 PCR 어세이와 비교하여 매우 낮은 거짓 양성 결과들을 초래한다는 것을 증명하였다. 비록 임상 표본들의 직접적 MRSA 스크리닝에 적용되기 전에 추가적인 평가가 필요할 지라도, 본 발명의 어세이 방법은 높은 MRSA 풍토병을 가진 임상 실험실에서 유용할 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참고문헌
1. Bootsma MC , Diekmann O, and Bonten MJ . 2006. Controlling methicillin-resistant Staphylococcus aureus: quantifying the effects of interventions and rapid diagnostic testing. Proc Natl Acad Sci U S A 103:5620-5625.
2. Harbarth S, Masuet - Aumatell C, Schrenzel J, Francois P, Akakpo C, Renzi G, Pugin J, Ricou B, and Pittet D. 2006. Evaluation of rapid screening and pre-emptive contact isolation for detecting and controlling methicillin-resistant Staphylococcus aureus in critical care: an interventional cohort study. Crit Care 10:R25.
3. Chowers MY , Paitan Y, Gottesman BS , Gerber B, Ben - Nissan Y, and Shitrit P. 2009. Hospital-wide methicillin-resistant Staphylococcus aureus control program: A 5-year follow-up. Infect Control Hosp Epidemiol 30:778-781.
4. Huletsky A, Giroux R, Rossbach V, Gagnon M, Vaillancourt M, Bernier M, Gagnon F, Truchon K, Bastien M, Picard FJ , van Belkum A, Ouellette M, Roy PH , and Bergeron MG . 2004. New Real-Time PCR Assay for Rapid Detection of Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus Directly from Specimens Containing a Mixture of Staphylococci. J Clin Microbiol 42:1875-1884.
5. Peterson LR , Liesenfeld O, Woods CW , Allen SD , Pombo D, Patel PA , Mehta MS , Nicholson B, Fuller D, and Onderdonk A. 2010. Multicenter evaluation of the LightCycler methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) advanced test as a rapid method for detection of MRSA in nasal surveillance swabs. J Clin Microbiol 48:1661-1666.
6. Rossney AS , Herra CM , Brennan GI , Morgan PM , and O'Connell B. 2008. Evaluation of the Xpert methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) assay using the GeneXpert real-time PCR platform for rapid detection of MRSA from screening specimens. J Clin Microbiol 46:3285-3290.
7. Rossney AS , Herra CM , Fitzgibbon MM , Morgan PM , Lawrence MJ , and O'Connell B. 2007. Evaluation of the IDI-MRSA assay on the SmartCycler real-time PCR platform for rapid detection of MRSA from screening specimens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 26:459-466.
8. Becker K, Pagnier I, Schuhen B, Wenzelburger F, Friedrich AW , Kipp F, Peters G, and von Eiff C. 2006. Does nasal cocolonization by methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains occur frequently enough to represent a risk of false-positive methicillin-resistant S. aureus determinations by molecular methods? J Clin Microbiol 44:229-231.
9. Laurent C, Bogaerts P, Schoevaerdts D, Denis O, Deplano A, Swine C, Struelens MJ , and Glupczynski Y. 2010. Evaluation of the Xpert MRSA assay for rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from nares swabs of geriatric hospitalized patients and failure to detect a specific SCCmec type IV variant. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 29:995-1002.
10. Oberdorfer K, Pohl S, Frey M, Heeg K, and Wendt C. 2006. Evaluation of a single-locus real-time polymerase chain reaction as a screening test for specific detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in ICU patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 25:657-663.
11. Stamper PD , Louie L, Wong H, Simor AE , Farley JE , and Carroll KC . 2011. Genotypic and phenotypic characterization of methicillin-susceptible Staphylococcus aureus isolates misidentified as methicillin-resistant Staphylococcus aureus by the BD GeneOhm MRSA assay. J Clin Microbiol 49:1240-1244.
12. Wong H, Louie L, Lo RY , and Simor AE . 2010. Characterization of Staphylococcus aureus isolates with a partial or complete absence of staphylococcal cassette chromosome elements. J Clin Microbiol 48:3525-3531.
13. Donnio PY , Oliveira DC , Faria NA , Wilhelm N, Le Coustumier A, and de Lencastre H. 2005. Partial excision of the chromosomal cassette containing the methicillin resistance determinant results in methicillin-susceptible Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 43:4191-4193.
14. Shore AC , Rossney AS , O'Connell B, Herra CM , Sullivan DJ , Humphreys H, and Coleman DC . 2008. Detection of staphylococcal cassette chromosome mec-associated DNA segments in multiresistant methicillin-susceptible Staphylococcus aureus (MSSA) and identification of Staphylococcus epidermidis ccrAB4 in both methicillin-resistant S. aureus and MSSA. Antimicrob Agents Chemother 52:4407-4419.
15. Donnio PY , Fevrier F, Bifani P, Dehem M, Kervegant C, Wilhelm N, Gautier - Lerestif AL , Lafforgue N, Cormier M, and Le Coustumier A. 2007. Molecular and epidemiological evidence for spread of multiresistant methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains in hospitals. Antimicrob Agents Chemother 51:4342-4350.
16. Korea Centers for Disease Control and Prevention . 2010. VRSA Newsletter. 10:3.
17. Chen L, Mediavilla JR , Oliveira DC , Willey BM , de Lencastre H, and Kreiswirth BN . 2009. Multiplex real-time PCR for rapid Staphylococcal cassette chromosome mec typing. J Clin Microbiol 47:3692-3706.
18. Milheirico C, Oliveira DC , and de Lencastre H. 2007. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 51:3374-3377.
19. Ho TH , Huang YC , and Lin TY . 2011. Evaluation of the BD GeneOhm StaphSR assay for detection of Staphylococcus aureus in patients in intensive care units. J Microbiol Immunol Infect 44:310-315.
20. Keshtgar MR , Khalili A, Coen PG , Carder C, Macrae B, Jeanes A, Folan P, Baker D, Wren M, and Wilson AP . 2008. Impact of rapid molecular screening for meticillin-resistant Staphylococcus aureus in surgical wards. Br J Surg 95:381-386.
21. Kluytmans J. 2007. Control of meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the value of rapid tests. J Hosp Infect 65 Suppl 2:100-104.
22. Schulz M, Nonnenmacher C, and Mutters R. 2009. Cost-effectiveness of rapid MRSA screening in surgical patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 28:1291-1296.
23. Kolman S, Arielly H, and Paitan Y. 2010. Evaluation of single and double-locus real-time PCR assays for methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) surveillance. BMC Res Notes 3:110.
24. Ornskov D, Kolmos B, Bendix Horn P, Nederby Nielsen J, Brandslund I, and Schouenborg P. 2008. Screening for methicillin-resistant Staphylococcus aureus in clinical swabs using a high-throughput real-time PCR-based method. Clin Microbiol Infect 14:22-28.
25. Soderquist B, Neander M, Dienus O, Zimmermann J, Berglund C, Matussek A, and Molling P. 2012. Real-time multiplex PCR for direct detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in clinical samples enriched by broth culture. APMIS 120:427-432.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. 다음의 단계를 포함하는 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)의 검출 또는 정량방법:
    (a) 시료를 준비하는 단계;
    (b) 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제6서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 역방향 프라이머 및 서열목록 제9서열의 프로브로 이루어진 SCCmec/orfX 유전자 검출세트; 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 mecA 유전자 검출세트; 및 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제15서열의 프로브로 이루어진 16S rRNA 유전자 검출세트를 이용하여 상기 시료 내의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계로, SCCmec/orfX와 mecA 간의 Ct 값 차이(CtSCC)가 ≥ 4.7이거나 또는 16S rRNA와 mecA Ct 값 차이(Ct16S)가 ≤ -1.72이면 시료 내 MRSA가 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 타액 또는 소변인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 증폭은 실-시간(real-time) PCR에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 MRSA 스트레인은 CCARM 3792, CCARM 3795, CCARM 3798, CCARM 3803, CCARM 3805, CCARM 3877, CCARM 3897 또는 CCARM 3911을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제6서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 역방향 프라이머 및 서열목록 제9서열의 프로브로 이루어진 SCCmec/orfX 유전자 검출세트; 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 mecA 유전자 검출세트; 및 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍 및 서열목록 제15서열의 프로브로 이루어진 16S rRNA 유전자 검출세트를 포함하는 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 검출 또는 진단용 키트로, SCCmec/orfX와 mecA 간의 Ct 값 차이(CtSCC)가 ≥ 4.7이거나 또는 16S rRNA와 mecA Ct 값 차이(Ct16S)가 ≤ -1.72이면 시료 내 MRSA가 존재하는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 증폭은 실-시간 PCR에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016099076A1 (ko) * 2014-12-16 2016-06-23 이화여자대학교 산학협력단 세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법
KR102126429B1 (ko) * 2019-04-11 2020-07-08 충북대학교 산학협력단 메티실린 내성의 황색포도알균 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 메티실린 내성 황색포도알균 검출 방법
KR20240061708A (ko) 2022-11-01 2024-05-08 삼육대학교산학협력단 수은 고정 탄소나노튜브 센서를 이용한 무처리 혈액 내 황색포도상구균 분석방법

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020055101A1 (en) * 1995-09-11 2002-05-09 Michel G. Bergeron Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
US20120077684A1 (en) * 2007-12-26 2012-03-29 O'hara Shawn Mark Methods and Compositions Including Diagnostic Kits For The Detection In Samples Of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus
US8715936B2 (en) * 2010-01-13 2014-05-06 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Method of determining types I, II, III, IV or V or methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in a biological sample

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Appl. Microbiol., Vol. 108, No. 3, pp. 779-788 (2009.07.13.) *
J. Clin. Microbiol., Vol. 48, No. 10, pp. 3525-3531 (2010.07.28.) *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016099076A1 (ko) * 2014-12-16 2016-06-23 이화여자대학교 산학협력단 세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법
KR101798176B1 (ko) 2014-12-16 2017-11-15 주식회사 엠디헬스케어 세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법
US10351900B2 (en) * 2014-12-16 2019-07-16 Md Healthcare Inc. Method for identifying pathogens of bacterial infectious diseases by using bacteria-derived nanovesicles
KR102126429B1 (ko) * 2019-04-11 2020-07-08 충북대학교 산학협력단 메티실린 내성의 황색포도알균 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 메티실린 내성 황색포도알균 검출 방법
KR20240061708A (ko) 2022-11-01 2024-05-08 삼육대학교산학협력단 수은 고정 탄소나노튜브 센서를 이용한 무처리 혈액 내 황색포도상구균 분석방법

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