WO2016099076A1 - 세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법 - Google Patents

세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법 Download PDF

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김영주
최현일
지영구
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김성민
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단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
한양대학교 산학협력단
인제대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention is to identify the causative agent (caused bacteria) of bacterial infectious diseases through genetic analysis contained in the nano-vesicles in clinical samples containing nano-sized extracellular vesicles, that is, nano-vesicles derived from bacteria, It relates to a method for predicting antibiotic resistance to.
  • Severe bacterial infections are characterized by severe expression of bacterial infections such as pneumonia, infective endocarditis, osteomyelitis, osteoarthritis, meningitis, sepsis, etc., among bacterial infections.
  • the incidence rate is increasing rapidly with the spread of multidrug-resistant bacteria due to the use of antibiotics.
  • Enterococcus as a multidrug resistant bacterium that causes bacterial severe infectious diseases spp ., Staphylococcus aureus , Klebsiella pneumoniae , Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa , Enterobacter spp. Etc. are known.
  • Severe infection by multidrug-resistant bacteria occurs mainly in the form of in-hospital infection, and mortality due to severe infection is 5.4% for pneumonia and 29% for sepsis.
  • the bacterial infection is severe, the patient's hospital stay is longer, the utility of the treatment is low compared to the investment, and in Korea, the annual cost of disease caused by multidrug-resistant bacteria has been surveyed to more than 1 trillion won.
  • the recent reports of multidrug-resistant bacteria in the community as well as internal infections by multidrug-resistant bacteria are expected to be a major problem for the public health in the future.
  • a method currently used for diagnosing a bacterial severe infectious disease includes a method of identifying a causative bacterium by a biochemical method by performing bacterial culture of a clinical sample such as blood in vitro.
  • the conventional method based on the results of the recent metagenenomic analysis of metagenome (metagenome) can be identified only 1% of the total bacteria, and it takes at least 5 days to culture the bacteria until now, do not know the causative bacteria The situation is based on the use of antibiotics based on clinical experience.
  • eukaryotic cells such as prokaryotic cells such as bacteria and host cells, such as humans, secrete vesicles out of cells, and secreted vesicles have been reported to perform various functions.
  • Extracellular vesicles secreted by bacteria contain lipopolysaccharide (LPS), bacteria-derived proteins and genes, and are generally called nanovesicles because they are 20-100 nanometers (nm) in size. It has been reported that extracellular vesicles have been found in various secretions, excreta, or tissue lavage fluids of humans or animals, and the extracellular vesicles present in tissues are known to reflect the state of the tissues secreting vesicles. Has been reported.
  • the present inventors found that the genes derived from bacteria exist in the bacteria-derived nano-vesicles derived from the samples separated from the body of mammals, and the cause of severe bacterial infection through the gene sequence analysis extracted from the nano-vesicles.
  • the present invention has been completed by developing a method for predicting (causative bacteria).
  • the present invention extracts genes present in nano-vesicles from clinical samples of mammals containing bacterial-derived endoplasmic reticulum to identify the causative bacteria of severe bacterial infection through sequencing and predict antibiotic resistance of the causative bacteria.
  • the purpose is to provide.
  • the present invention comprises the steps of: (A) extracting the gene in the nano-vesicles from the patient sample containing the bacteria-derived nano-vesicles; (B) performing PCR on the extracted gene using primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2; And (C) provides a method for identifying bacterial bacterial infection causing bacteria, comprising the step of determining that the bacterial bacterial infection causing bacteria is present when the PCR result is increased compared to the normal person.
  • the present invention (A) extracting the gene in the nano-vesicles from the patient sample containing the bacteria-derived nano-vesicles; (B) performing PCR on the extracted gene using primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2; And (C) provides a method for predicting antibiotic resistance to the bacterial bacterial infectious agent causing bacterial infection when the PCR result is increased compared to the normal person, the antibiotic response to the bacterial bacterial infectious disease causative agent. .
  • the patient sample is selected from the group consisting of urine, blood, oral fluid, gastric juice, feces, nasal fluid, sputum, skin cleansing fluid, pleural fluid, peritoneal fluid, joint fluid, cerebrospinal fluid, amniotic fluid and vaginal fluid It is characterized by.
  • the gene in the nano-vesicles is characterized in that 16S rDNA or 16S rRNA.
  • the nano-vesicles preferably have an average diameter of 10-300nm, more preferably 20-100nm.
  • the bacterial serious infectious disease is characterized in that selected from the group consisting of sepsis, sinusitis, pneumonia, tuberculosis, infective endocarditis, osteoarthritis, osteomyelitis, urinary tract infections, encephalitis, meningitis and nephritis.
  • the causative bacterium is characterized by being a multidrug resistant bacterium selected from the group consisting of Skermanella , Alkalibacterium , Ureaplasma , Corynebacterium , Streptococcus , Caulobacteraceae , Brevibacterium , Staphylococcus , Kocuria , Pseudomonas , Xanthomonadaceae , and Sphingobium .
  • step of extracting the gene in step (A) (a) centrifuging the patient sample to obtain a supernatant, and then removing the bacteria and foreign matter by a filter; (b) centrifuging and concentrating the product obtained after the filtering; (c) ultra-centrifuging the concentrated product to obtain nano-vesicle pellets; (d) heat treating the nano-vesicle pellets; And (e) centrifuging the heat treatment product to obtain a supernatant.
  • the heat treatment in step (d) is characterized in that it is carried out for 5-30 minutes at 90-110 °C.
  • the method of the present invention it is possible to provide information on the causative agent of bacterial infection and to predict the causative agent of bacterial infection by analyzing the gene sequences in the nano-endoplasmic reticulum in clinical samples containing the bacterial-derived nano-ER.
  • Figure 1 is an electron micrograph to confirm the shape of the nano-vesicles in the urine samples of normal and severe bacterial infection patients.
  • Figure 2 is a dynamic light scattering measurement results for confirming the size of the nano-vesicles in the urine samples of normal and severe bacterial infection patients.
  • 3 is a PCR result for confirming the presence of a gene derived from bacteria in the nano-vesicles isolated from the urine samples of normal people and severe bacterial infection.
  • Figure 4a is a result of the meta-genomic analysis of the nano-vesicles isolated from the urine samples of normal and severe bacterial infection patients
  • Figure 4b shows a list of bacteria (yellow highlighted) increased nano-vesicles in patients with severe bacterial infections compared to normal people The result is.
  • 5 is a result showing the difference in the amount of DNA extraction according to the heat treatment method, DNA extraction kit, DNA extraction compound (phenol / chloroform) treatment in the urine samples of normal and severe bacterial infection patients.
  • 6 is a result of performing a heat treatment by separating the nano-vesicles from the urine sample, or a direct heat treatment to the urine sample, the meta-genomic analysis at the gate level (phylum level).
  • FIG. 7 is a result obtained by separating nano-vesicles from a urine sample and performing a heat treatment or direct heat treatment on a urine sample, and performing a metagenome analysis at a genus level.
  • the present invention relates to a method for identifying the causative bacteria of severe bacterial infection and predicting antibiotic resistance by analyzing gene sequences in nano-vesicles in clinical samples such as urine containing bacterial-derived nano-vesicles.
  • the inventors have discovered that nanovesicles secreted from bacteria are absorbed into the body and distributed through the blood into various tissues of the mammal, which are excreted in urine and feces. Therefore, the genes were extracted from the urine samples of 11 normal individuals (control) and 25 severe bacterial infections (separated from nanovesicles), followed by analyzing the sequencing of 16S rDNA or 16S rRNA specific to bacteria. It was confirmed that the causative agent of bacterial infection can be predicted.
  • the present inventors conducted a metagenome analysis on DNA extracted from the nano vesicles, and found that the endoplasmic reticulum derived from 12 bacteria was significantly increased in the urine of the severely infected bacteria compared to the urine of normal people. It was.
  • the gene was extracted and subjected to metagenomic analysis of the sample through heat treatment, it was confirmed that the distribution of bacteria-derived endoplasmic reticulum is similar at the phylum level and genus level. In other words, it was found that the same result was obtained even by analyzing gene sequencing by directly extracting genes in nano-vesicles without separating bacterial-derived nano-vesicles from clinical samples.
  • the genome was extracted by heat treatment to the urine samples derived from urine samples of normal people, infectious endocarditis and nephritis (APN), and then amplified using 16S rDNA primers to perform metagenome analysis at the genus level.
  • the urine of infective endocarditis increased more than about 60% of the endoplasmic reticulum derived from Staphylococcus , and the remarkable increase of the endoplasmic reticulum derived from Caulobacteraceae to more than 40% in urine of patients with nephritis. It was confirmed.
  • bacterial infection or bacterial infectious disease refers to diseases caused by bacteria or bacterial toxins.
  • bacterial or bacterial toxins penetrate through the host's defenses to cause infectious diseases.
  • Representative examples include pneumonia and pulmonary tuberculosis; Osteomyelitis, osteoarthritis of the bone joints; Infective endocarditis in the heart; Encephalitis, meningitis, which occurs in the brain; Nephritis occurring in the kidneys; Systemic sepsis.
  • severe bacterial infection or “severe bacterial infection” refers to a severe expression of a bacterial infection including a case in which mortality is high or difficult to treat due to bacterial infection such as pneumonia, sepsis, infective endocarditis, nephritis, osteoarthritis, etc. Means.
  • 'prediction of the causative agent or causative organism' means that an appropriate antibiotic can be used by providing information on the causative causative agent of an infectious disease caused by a bacterium or a bacterial toxin, or that the course of the disease can be predicted after antibiotic use. It is meant to include.
  • the term 'predicting antibiotic resistance' includes providing antibiotic resistance information on a causative agent of an infectious disease caused by a bacterium or a bacterial toxin to use an appropriate antibiotic, or predicting disease progression after using antibiotics. I mean.
  • bacteria-derived endoplasmic reticulum is a nano-size endoplasmic reticulum secreted by the bacteria contained in the clinical sample, extracting the gene by separating the nano-vesicles from the clinical sample, or without separating the nano-vesicles from the clinical sample containing the nano-vesicles
  • Genes contained in the nano-vesicles can be extracted by heat treatment, compound treatment, or the like.
  • the 'clinical sample' containing the nano-vesicles is not particularly limited as a sample obtained from a patient, but may use blood, urine, sputum, feces, nasal fluid, oral fluid, joint fluid, pleural fluid, cerebrospinal fluid, etc. as desired. Can be.
  • the method for separating the nano-vesicles from the clinical sample is not particularly limited, for example, in urine or blood, such as centrifugation, ultrafast centrifugation, filtration by filter, gel filtration chromatography, pre-flow electrophoresis, capillary electrophoresis, etc. A method, and a combination thereof. In addition, it may further include a process such as washing, centrifugation, concentration of the obtained nano-vesicles for the removal of impurities.
  • the method of extracting the gene in the nano-vesicles from the clinical sample, after separating the nano-vesicles from the clinical sample, extract the genes in the nano-vesicles by physical or chemical methods, or the process of separating nano-vesicles from the clinical samples containing nano-vesicles Genes in nanovesicles can be extracted directly by physical or chemical methods such as heat treatment without going through.
  • the nanovesicles separated by the above method may have an average diameter of 10 to 300 nm, but preferably 20 to 100 nm.
  • 'gene' is a concept including DNA and RNA derived from bacteria, and 'gene sequencing' includes amplifying a gene using primers complementary to gene sequences.
  • 'metagenome' is also referred to as 'military genome', and means a total of genomes including all viruses, bacteria, fungi, and the like in an isolated region such as soil and animal intestine, and mainly refers to a microorganism that is not cultured. It is used as a concept of genome to explain the identification of many microorganisms at once using sequencer for analysis.
  • the metagenome does not refer to one genome or genome, but to a kind of mixed dielectric as the genome of all species of one environmental unit. This is a term from the point of view of defining a species in the course of the evolution of biology in terms of functional species as well as various species that interact with each other to create a complete species.
  • rapid sequencing is used to analyze all DNA and RNA regardless of species, to identify all species in one environment, and to identify interactions and metabolism.
  • Urine samples in 50 ml tubes were suspended by centrifugation (3,500 ⁇ g, 10 min, 4 ° C.), the supernatant was taken only, and bacteria and foreign substances were removed using a 0.22 ⁇ m filter. Subsequently, the centrifugal tube (centripreigugal filters 50 kD) was transferred to 1,500 ⁇ g, centrifuged at 4 ° C. for 15 minutes to discard materials smaller than 50 kD and concentrated to 10 ml.
  • Nano-vesicle quantitative value ( ⁇ g / ml) Normal 1 6 Normal 2 114 Normal 3 8 Normal 4 10 Normal 5 2 Sepsis patients 1 2 Sepsis 2 35 Sepsis 3 2 Sepsis 4 4 Sepsis patients 5 7
  • Example 2 In urine samples Nanovesicular Structure and size analysis
  • the size of the nano-vesicles separated by the method of Example 1 was measured using a dynamic light scattering method (Dynamic light scattering: zetasizer nano ZS Malverk, UK). After preparing 1ml of the nano-vesicles at a concentration of 5 ⁇ g / ml, and transferred to the cuvette (ZEN0112) was placed in place and photographed three times 30 times. As a result, it was confirmed that the size of about 10 to 100 nm as shown in FIG.
  • PCR was performed with the following 16s rDNA primer to confirm the presence of a gene derived from bacteria in the extracted DNA. As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the bacteria derived from sepsis 1 and 2 were present. .
  • DNA was extracted from the nano vesicles by the heat treatment method of Example 3, 16S rDNA primer pair (SEQ ID NO: Sequencing was performed by PCR amplification using 1 and 2) (Roche GS FLX sequencer).
  • SFF Standard Flowgram Format
  • OTU operational taxonomy unit
  • Figure 4a is a result of the meta-genomic analysis of the nano-vesicles isolated from the urine samples of normal and severe bacterial infection patients
  • Figure 4b is a list of bacteria increased nano-vesicles in patients with severe bacterial infections (yellow highlighted) ), 12 species of Skermanella , Alkalibacterium , Ureaplasma, Corynebacterium , Streptococcus, Caulobacteraceae , Brevibacterium , Staphylococcus, Kocuria , Pseudomonas , Xanthomonadaceae , and Sphingobium increased.
  • DNA was hardly extracted in the case of using the DNA extraction kit, and the amount of DNA extraction increased in the case of extraction with the phenol / chloroform compound than in the case of using the kit. It was found that the method is superior to other methods in the amount of DNA extraction.
  • Example 6 Nanoendoplasmic Reticulum Derivation of bacteria with or without isolation Nanoendoplasmic Reticulum Analysis of the differences in the distribution
  • DNA was extracted after heat-treatment on nano-vesicles separated from urine samples and after heat-treatment on urine samples without separate nano-vesicles.
  • the metagenome analysis was performed by the method of Example 4 above.
  • Example 4 For each of 10 urine samples of a normal person and an infectious endocarditis patient, PCR amplification of the genome extracted by the heat treatment method of Example 3 with 16S rDNA primer pairs (SEQ ID NOs: 1 and 2), followed by Example 4 The metagenome analysis was performed by the method of. As a result, it was confirmed that the endoplasmic reticulum derived from Staphylococcus increased 61% significantly in the urine of patients with infective endocarditis compared to normal subjects.
  • Example 3 For each of 10 urine samples of normal people and nephritis (APN), the genome extracted by the heat treatment method of Example 3 was PCR amplified by 16S rDNA primer pairs (SEQ ID NOs: 1 and 2), followed by the method of Example 4 Metagenome analysis was performed. As a result, it was confirmed that 46% of the endoplasmic reticulum derived from Caulobacteraceae increased significantly in the urine of nephritis patients compared to normal people.

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Abstract

본 발명은 세균에서 유래하는 나노크기의 세포밖소포체, 즉 나노소포체를 함유하는 임상샘플에서, 나노소포체에 함유되어 있는 유전자 분석을 통해 세균성 중증 감염질환의 원인인자(원인균)를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 중증 세균감염의 원인균에 대한 정보를 제공하고 세균감염의 원인인자 예측 및 원인균에 대한 항생제 내성을 예측하는 것이 가능하다.

Description

세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법
본 발명은 세균에서 유래하는 나노크기의 세포밖소포체, 즉 나노소포체를 함유하는 임상샘플에서, 나노소포체에 함유되어 있는 유전자 분석을 통해 세균성 감염질환의 원인인자(원인균)를 동정하는 동시에, 상기 원인균에 대한 항생제 내성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
세균성 중증 감염질환은 세균에 의한 감염질환 중에서 폐렴, 감염성 심내막염, 골수염, 골관절염, 뇌막염, 패혈증 등과 같이 세균감염의 중증발현을 특징으로 하는 질환으로서, 최근 인구의 고령화에 따른 대상 환자군의 증가와 무차별적 항생제 사용에 따른 다제내성균의 확산에 따라 발생률이 급증하고 있다. 세균성 중증감염질환을 일으키는 다제 내성균으로서 Enterococcus spp ., Staphylococcus aureus , Klebsiella pneumoniae , Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa , Enterobacter spp. 등이 알려져 있다.
다제내성균에 의한 중증감염은 주로 원내 감염의 형태로 나타나고, 중증 감염에 의한 사망률이 높아 폐렴인 경우에는 사망률이 5.4%이고, 패혈증인 경우에는 29%의 사망률을 보이는 것으로 보고되었다. 또한, 세균성 중증감염에 걸리면 환자의 재원기간이 길어지며, 치료에 들어가는 투자대비 효용이 낮고, 우리나라의 경우 다제내성균 감염에 의한 연간 질병비용은 1조원 이상으로 조사된 바 있다. 더욱이, 최근 다제내성균에 의한 원내감염뿐만 아니라 지역사회에서 다제내성균이 보고되고 있어 향후 국민보건에 큰 문제가 될 것으로 예상된다.
이와 관련하여, 현재 세균성 중증감염질환을 진단하기 위하여 사용되고 있는 방법으로는, 혈액 등의 임상샘플을 체외에서 세균배양을 수행하여 생화학적인 방법으로 원인균을 동정하는 방법이 있다. 그러나, 최근 균유전체학인 메타게놈(metagenome) 분석결과를 토대로 한 상기의 전통적인 방법으로는 전체 세균의 1%만 확인이 가능하고, 세균배양에 소요되는 시간이 최소 5일이 걸려 현재까지는 원인균을 모르는 상태에서 임상적인 경험에만 근거하여 항생제를 사용하고 있는 실정이다.
한편, 세균과 같은 원핵세포와 사람 등의 숙주세포인 진핵세포는 세포밖으로 소포체(vesicles)를 분비하고, 분비된 소포체가 여러 기능을 수행함이 보고되었다. 세균에서 분비된 세포밖 소포체는 내독소(lipopolysaccharide; LPS)와 세균 유래 단백질과 유전자를 함유하고 있고, 크기가 20-100 나노미터(nm) 크기라서 통상적으로 나노소포체(nanovesicle)라고 칭한다. 사람 또는 동물의 여러 분비물, 배설물 또는 조직 세척액 등에서 세포밖 소포체가 발견되었음이 보고되었으며, 조직에 존재하는 세포밖 소포체는 소포체를 분비하는 조직의 상태를 반영하는 것으로 알려져 있고, 질병의 진단에 이용될 수 있음이 보고되었다.
그러나, 아직까지 사람 몸에 존재하는 세균에서 유래하는 나노소포체 내의 유전자를 통해 중증 세균감염의 원인균을 동정하고, 이러한 원인균의 항생제 내성을 예측하는 방법에 대한 연구 결과는 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은, 포유동물의 체내에서 분리한 샘플에서 유래한 세균유래 나노소포체 내에 세균에서 유래하는 유전자가 존재함을 발견하고, 나노소포체에서 추출한 유전자 염기서열 분석을 통해 중증 세균감염의 원인인자(원인균)를 예측할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 세균 유래 나노소포체를 함유하는 포유동물의 임상샘플에서 나노소포체 내에 존재하는 유전자를 추출하여 염기서열 분석을 통해 중증 세균감염의 원인균을 동정하고, 상기 원인균의 항생제 내성을 예측하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, (A) 세균 유래 나노소포체를 함유하는 환자샘플에서 나노소포체 내의 유전자를 추출하는 단계; (B) 상기 추출된 유전자에 대하여 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (C) 상기 PCR 결과물이 정상인에 비하여 증가되어 있을 경우 세균성 중증 감염질환 원인균이 존재하는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 세균성 중증 감염질환 원인균의 동정방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, (A) 세균 유래 나노소포체를 함유하는 환자샘플에서 나노소포체 내의 유전자를 추출하는 단계; (B) 상기 추출된 유전자에 대하여 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (C) 상기 PCR 결과물이 정상인에 비하여 증가되어 있을 경우 세균성 중증 감염질환 원인균에 대하여 항생제 반응성이 낮을 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 세균성 중증 감염질환 원인균에 대한 항생제 내성을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 환자샘플은 소변, 혈액, 구강액, 위액, 대변, 비강액, 객담, 피부세척액, 흉막액, 복막액, 관절액, 뇌척수액, 양수 및 질세척액으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 나노소포체 내의 유전자는 16S rDNA 또는 16S rRNA인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 나노소포체는 평균 직경이 10-300nm인 것이 바람직하고, 20-100nm인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 세균성 중증 감염질환은, 패혈증, 부비동염, 폐렴, 결핵, 감염성 심내막염, 골관절염, 골수염, 요로감염, 뇌염, 뇌막염 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 원인균은 Skermanella , Alkalibacterium , Ureaplasma, Corynebacterium, Streptococcus, Caulobacteraceae, Brevibacterium, Staphylococcus, Kocuria, Pseudomonas, Xanthomonadaceae, 및 Sphingobium으로 이루어진 군에서 선택되는 다제내성균인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 단계 (A)에서 유전자를 추출하는 단계는, (a) 환자샘플을 원심분리하여 상등액을 얻은 후 필터에 의해 세균 및 이물질을 제거하는 단계; (b) 상기 필터링 후 얻은 산물을 원심분리하여 농축하는 단계; (c) 상기 농축 산물을 초고속원심분리하여 나노소포체 펠렛(pellet)을 얻는 단계; (d) 상기 나노소포체 펠렛을 열처리하는 단계; 및 (e) 상기 열처리 산물을 원심분리하여 상등액을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 단계 (d)에서 열처리는 90-110℃에서 5-30분간 행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에 의하면, 세균 유래 나노소포체를 함유하는 임상샘플에서 나노소포체 내의 유전자 염기서열을 분석함으로써, 세균감염의 원인균에 대한 정보를 제공하고 세균감염의 원인인자를 예측하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 방법에 의하면, 세균감염의 원인균에 대한 정보를 제공함으로써 세균감염의 원인균에 대한 항생제 내성을 예측하는 것이 가능하다.
도 1은 정상인과 중증세균감염 환자의 소변샘플 내 나노소포체의 형태를 확인하기 위한 전자현미경 사진이다.
도 2는 정상인과 중증세균감염 환자의 소변샘플 내 나노소포체의 크기를 확인하기 위한 동적광산란법 측정 결과이다.
도 3은 정상인과 중증세균감염 환자의 소변샘플에서 분리한 나노소포체 내에 세균에서 유래한 유전자가 존재하는지 확인하기 위한 PCR 결과이다.
도 4a는 정상인과 중증세균감염 환자의 소변샘플에서 분리한 나노소포체를 메타게놈 분석한 결과이고, 도 4b는 정상인에 비하여 중증세균감염 환자에서 나노소포체가 증가된 세균목록(노란색 하이라이트 표시)을 나타낸 결과이다.
도 5는 정상인과 중증세균감염 환자의 소변샘플에서 열처리 방식, DNA 추출 키트, DNA 추출 화합물(페놀/클로로포름) 처리에 따른 DNA 추출 양의 차이를 보여주는 결과이다.
도 6은 소변샘플에서 나노소포체를 분리하여 열처리를 하거나, 또는 소변샘플에 직접 열처리를 한 후, 메타게놈 분석을 문 수준(phylum level)에서 행한 결과이다.
도 7은 소변샘플에서 나노소포체를 분리하여 열처리를 하거나, 또는 소변샘플에 직접 열처리를 한 후, 메타게놈 분석을 속 수준(genus level)에서 행한 결과이다.
본 발명은 세균 유래 나노소포체를 함유하는 소변 등의 임상샘플에서 나노소포체 내 유전자 염기서열을 분석하여 중증 세균감염의 원인균을 동정하고, 이에 대한 항생제 내성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 세균에서 분비되는 나노소포체가 체내로 흡수되어 혈액을 통해 포유동물의 여러 조직으로 분포하고, 이는 소변과 대변으로 배설됨을 발견하였다. 이에, 11명의 정상인(대조군)과 25명의 중증세균감염 환자의 소변샘플에서 (나노소포체를 분리하여) 유전자를 추출한 후, 세균에 특이적으로 존재하는 16S rDNA 또는 16S rRNA의 염기서열을 분석하여 중증 세균감염 원인균을 예측할 수 있음을 확인하였다.
이 과정에서, 본 발명자들은 나노소포체에서 추출한 DNA에 대하여 메타게놈 분석을 실시한 결과, 정상인의 소변에 비하여 세균성 중증감염환자의 소변에는 12개의 세균 속에서 유래하는 나노소포체가 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다.
또한, 임상샘플에 열처리를 할 경우 추출된 유전자의 순도가 증가됨을 밝혔다.
또한, 나노소포체 분리 유무와 상관없이 샘플에 열처리를 통해 유전자를 추출하여 메타게놈 분석한 결과, 세균 유래 나노소포체의 분포가 문(phylum) 수준 및 속(genus) 수준에서 유사함을 확인하였다. 즉, 임상샘플에서 세균 유래 나노소포체를 분리하지 않고, 직접 나노소포체 내 유전자를 추출하여 유전자 염기서열을 분석하여도 동일한 결과가 나온다는 것을 알 수 있었다.
또한, 정상인과 감염성 심내막염(infective endocarditis), 신장염(APN) 환자의 소변샘플 유래의 나소소포체에 열처리 방법으로 유전체를 추출한 후 16S rDNA 프라이머를 사용하여 증폭하여 메타게놈 분석을 속(genus) 수준에서 수행한 결과, 정상인에 비하여 감염성 심내막염 환자의 소변에는 Staphylococcus 속에서 유래하는 나노소포체가 약 60% 이상 확연히 증가되어 있었고, 신장염 환자의 소변에서는 Caulobacteraceae 속에서 유래하는 나노소포체가 약 40% 이상 확연히 증가되어 있었음을 확인하였다.
본 명세서에서 '세균감염(bacterial infection) 혹은 세균성 감염질환 (bacterial infectious disease)'이란, 세균 혹은 세균 유래 독소에 의해 발생하는 질환을 총칭한다. 일반적으로 세균 혹은 세균 유래 독소가 숙주의 방어막을 뚫고 들어와서 감염질환이 발생하게 되는데, 대표적인 예로 폐에 발생하는 폐렴, 폐결핵; 골관절에 발생하는 골수염, 골관절염; 심장에 발생하는 감염성 심내막염; 뇌에 발생하는 뇌염, 뇌막염; 신장에 발생하는 신장염; 전신적으로 발생하는 패혈증 등이 있다.
본 명세서에서 '중증 세균감염' 또는 '세균성 중증 감염질환'이란, 폐렴, 패혈증, 감염성 심내막염, 신장염, 골관절염 등과 같이 세균감염에 의해 사망률이 높거나, 치료가 어려운 경우를 포함하는 세균감염의 중증발현을 의미한다.
본 명세서에서 '원인인자 혹은 원인균의 예측'이란, 세균 혹은 세균 유래 독소에 의해 발생하는 감염질환의 원인균에 대한 정보를 제공함으로써 적절한 항생제를 사용하도록 하거나, 항생제 사용 후 질환의 경과를 예측할 수 있는 것을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 '항생제 내성의 예측'이란, 세균 혹은 세균 유래 독소에 의해 발생하는 감염질환 원인균에 대한 항생제 내성 정보를 제공함으로써 적절한 항생제를 사용하도록 하거나, 항생제 사용 후 질환의 경과를 예측할 수 있는 것을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 '세균 유래 나노소포체'란 임상샘플에 함유된 세균이 분비하는 나노크기의 소포체로서, 임상샘플에서 나노소포체를 분리하여 유전자를 추출하거나, 나노소포체가 함유된 임상샘플에서 나노소포체 분리 없이 열처리, 화합물 처리 등의 방법으로 나노소포체 내에 함유되어 있는 유전자를 추출할 수 있다.
본 명세서에서 나노소포체가 함유된 '임상샘플'은 환자에서 얻은 시료로서 특별히 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 혈액, 소변, 객담, 대변, 비강액, 구강액, 관절액, 흉수, 뇌척수액 등과 같은 것을 이용할 수 있다.
상기 임상샘플에서 나노소포체를 분리하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 소변이나 혈액에서, 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 모세관 전기영동 등의 방법, 및 이들의 조합을 들 수 있다. 또한, 불순물의 제거를 위한 세척, 원심분리, 수득된 나노소포체의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.
상기 임상샘플에서 나노소포체 내의 유전자를 추출하는 방법은, 임상샘플에서 나노소포체를 분리한 후 물리적 혹은 화학적인 방법으로 나노소포체 내 유전자를 추출하거나, 나노소포체가 함유된 임상샘플에서 나노소포체 분리과정을 거치지 않고 열처리와 같이 물리적 혹은 화학적인 방법으로 직접 나노소포체 내 유전자를 추출할 수 있다.
상기 방법에 의하여 분리된 나노소포체는 평균 직경이 10∼300nm일 수 있으나, 바람직하게는 20∼100nm이다.
본 명세서에서 '유전자'는 세균 유래 DNA와 RNA를 포함하는 개념이고, '유전자 염기서열 분석'은 유전자 염기서열에 상보적인 프라이머를 이용하여 유전자를 증폭하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 '메타게놈'이란 '군유전체'라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈, 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 소변샘플에서 나노소포체 분리
50ml 튜브 내의 소변샘플을 원심분리법(3,500×g, 10min, 4℃)으로 부유물을 가라앉히고 상등액만을 취한 후, 0.22㎛ 필터를 사용하여 세균 및 이물질을 제거하였다. 이후, 센트리프랩 튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮겨서 1,500×g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50kD 보다 작은 물질은 버리고 10ml까지 농축시켰다. 다시 0.22㎛ filter를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000×g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리 방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹였다. 이어서, 단백질 정량방법(Bradford Assay)을 수행하여 나노소포체 양을 측정한 결과를 하기 [표 1]에 나타내었다.
소변에서 초원심분리법으로 분리한 소변내 나노소포체의 양
샘 플 나노소포체 정량값 ( ㎍/ ml)
정상인 1 6
정상인 2 114
정상인 3 8
정상인 4 10
정상인 5 2
패혈증 환자 1 2
패혈증 환자 2 35
패혈증 환자 3 2
패혈증 환자 4 4
패혈증 환자 5 7
실시예 2: 소변샘플내의 나노소포체의 구조 및 크기 분석
상기 실시예 1에서 분리한 나노소포체의 구조를 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 전자현미경(Transmission electron microscopy : JEM 1011 electromicroscopy Jeol, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
먼저, 나노소포체를 50㎍/ml 농도로 20㎕ 준비하고, 전자현미경분석을 위한 그리드 표면에 7㎕를 떨어뜨리고 10초간 흡착하게 한 다음 티슈로 표면에 남은 용매를 흡수하여 제거한다. 이어서, 음성염색을 위한 2% 우라닐아세테이트 7㎕를 떨어뜨리고 10초간 흡착하게 한 다음 역시 티슈로 제거하고 8시간 상온에서 건조시켜 전자현미경으로 촬영하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
또한, 상기 실시예 1의 방법으로 분리한 나노소포체의 크기를 동적광산란법 (Dynamic light scattering : zetasizer nano ZS Malverk, UK)을 이용하여 측정하였다. 나노소포체를 5㎍/ml 농도로 1ml 준비한 후 큐벳(ZEN0112)에 옮긴 후 정위치 시킨 다음 30번씩 3번 촬영을 하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 10∼100 nm 내외의 크기임을 확인하였다.
실시예 3: 나노소포체에서 DNA 추출 (열처리 방법)
소변샘플에서 기존의 DNA 추출 키트로 DNA를 추출하면 유전자가 추출되지 않기 때문에, 이를 해결하기 위하여 다음과 같은 열처리 방법을 실시하였다.
우선, 상기 실시예 1의 방법으로 분리한 나노소포체 100㎕를 heatblock 100℃에서 15분 동안 열처리하여 소포체 내부의 DNA를 지질막 밖으로 나오게 한 후, 얼음에 5분 동안 식혔다. 그리고 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000×g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액만을 모은 후, Nano Spectrophotometer(Nanodrop)를 이용하여 DNA 양을 정량한 결과, 소변 ㎕당 1,000∼1,500ng의 DNA가 추출되었다.
이어서, 추출한 DNA에 세균 유래의 유전자가 존재하는지 확인하기 위하여, 하기 16s rDNA primer로 PCR을 수행하였으며, 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 패혈증 1 및 2에서 세균 유래의 유전자가 존재함을 확인하였다.
Forward Primer: 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3' (서열번호 1)
(염기 M은 A 또는 C를 의미함)
Reverse Primer: 5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3' (서열번호 2)
실시예 4: 나노소포체에서 추출한 DNA를 이용한 메타게놈 분석
정상인 11명과 중증세균성 감염질환 환자 25명의 소변샘플에서 상기 실시예 1의 방법으로 나노소포체를 분리한 후, 상기 실시예 3의 열처리 방법으로 나노소포체에서 DNA를 추출하고, 16S rDNA 프라이머쌍(서열번호 1 및 2)을 사용하여 PCR 증폭하여 시퀀싱을 수행하였다(Roche GS FLX sequencer).
그 결과를 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software (v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score파일로 변환하였다. 이후, 리드의 신용도 평가를 확인하고, window (20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만 (Phred score <20)인 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300bp 이상인 것만 이용하였다(Sickle version 1.33).
Operational Taxonomy Unit(OTU) 분석을 위해서는 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하고, genus는 94%, family는 90%, order는 85%, class는 80%, phylum은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고, 각 OTU의 phylum, class, order, family, gunus 레벨의 분류를 수행한 후, BLASTN와 GreenGenes의 16S rDNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도를 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME).
이때, 통계 분석은, t-test를 이용하여 각 군의 평균 분포 비율이 2-fold 이상 다르며 p 값이 0.05인 경우로 하여, 대조군과 실험군에 유의하게 다른 비율로 존재하는 세균을 선정하였다.
또한, Hierarchical clustering, Principal Component Analysis (PCA) 등을 이용하여 샘플들 사이의 유사도를 분석한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 정상인의 소변에 비하여 중증 세균감염환자의 소변에는 12개의 세균 속에서 유래하는 나노소포체가 유의하게 증가되어 있었음을 확인하였다. 구체적으로, 도 4a는 정상인과 중증세균감염 환자의 소변샘플에서 분리한 나노소포체를 메타게놈 분석한 결과이고, 도 4b는 정상인에 비하여 중증세균감염 환자에서 나노소포체가 증가된 세균목록(노란색 하이라이트 표시)을 나타낸 결과로서, Skermanella , Alkalibacterium , Ureaplasma, Corynebacterium , Streptococcus, Caulobacteraceae , Brevibacterium , Staphylococcus, Kocuria , Pseudomonas , Xanthomonadaceae, 및 Sphingobium의 12종이 증가함을 알 수 있었다.
실시예 5: 나노소포체의 열처리, 키트 , 화합물 처리에 따른 DNA 추출양의 차이
상기 실시예 3의 열처리 방법으로 정상인과 중증 세균성 감염질환 환자 소변의 나노소포체에서 DNA를 각각 추출한 후, DNA 추출 키트((주) 바이오니아) 및 DNA 추출 화합물(페놀/클로로포름 extraction)을 사용한 경우와 비교하여 DNA 추출양에 차이가 있는지 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, DNA 추출 키트를 사용한 경우에는 DNA가 거의 추출되지 않았고, 페놀/클로로포름 화합물로 extraction한 경우에는 키트를 사용한 경우보다 DNA 추출양이 증가하였으나, 실시예 3의 열처리 방법이 DNA 추출양에 있어서 다른 방법에 비하여 월등히 우수함을 알 수 있었다.
실시예 6: 나노소포체 분리 유무에 따른 세균 유래 나노소포체 분포의 차이 분석
나노소포체 분리 유무에 다른 세균 유래 나노소포체의 분포 차이를 비교하기 위하여, 소변샘플에서 분리된 나노소포체에 열처리한 후와, 별도의 나노소포체의 분리없이 소변샘플 자체에 열처리한 후, 각각 DNA를 추출하여 상기 실시예 4의 방법으로 메타게놈 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 나노소포체 분리 유무와 상관없이 소변 열처리군과 세포밖 소포체 열처리군 모두 세균 유래 나노소포체의 분포가 문 (phylum) 수준과 속(genus) 수준에서 유사함을 알 수 있었다.
실시예 7: 감염성 심내막염 소변에서 열처리 방법으로 유전자를 추출하여 수행한 메타게놈 분석
정상인과 감염성 심내막염(infective endocarditis) 환자의 소변샘플 각 10개에 대하여, 상기 실시예 3의 열처리 방법으로 추출한 유전체를 16S rDNA 프라이머쌍(서열번호 1 및 2)으로 PCR 증폭한 후, 상기 실시예 4의 방법으로 메타게놈 분석을 수행하였다. 그 결과, 정상인에 비하여 감염성 심내막염 환자의 소변에는 Staphylococcus 속에서 유래하는 나노소포체가 61% 확연히 증가되어 있음을 확인하였다.
실시예 8: 신장염 소변에서 열처리 방법으로 유전자를 추출하여 수행한 메타 게놈 분석
정상인과 신장염(APN) 환자의 소변샘플 각 10개에 대하여, 상기 실시예 3의 열처리 방법으로 추출한 유전체를 16S rDNA 프라이머쌍(서열번호 1 및 2)으로 PCR 증폭한 후, 상기 실시예 4의 방법으로 메타게놈 분석을 수행하였다. 그 결과, 정상인에 비하여 신장염 환자의 소변에는 Caulobacteraceae 속에서 유래하는 나노소포체가 46% 확연히 증가되어 있음을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer for 16s rDNA
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer for 16s rDNA
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (16)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 세균성 중증 감염질환 원인균의 동정방법.
    (A) 세균 유래 나노소포체를 함유하는 환자샘플에서 나노소포체 내의 유전자를 추출하는 단계;
    (B) 상기 추출된 유전자에 대하여 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (C) 상기 PCR 결과물이 정상인에 비하여 증가되어 있을 경우 세균성 중증 감염질환 원인균이 존재하는 것으로 판정하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 환자샘플은 소변, 혈액, 구강액, 위액, 대변, 비강액, 객담, 피부세척액, 흉막액, 복막액, 관절액, 뇌척수액, 양수, 및 질세척액으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 나노소포체 내의 유전자는 16S rDNA 또는 16S rRNA인 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 나노소포체는 평균 직경이 10-300nm인 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 세균성 중증 감염질환은, 패혈증, 부비동염, 폐렴, 결핵, 감염성 심내막염, 골관절염, 골수염, 요로감염, 뇌염, 뇌막염, 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 원인균은 Skermanella , Alkalibacterium , Ureaplasma, Corynebacterium , Streptococcus, Caulobacteraceae , Brevibacterium , Staphylococcus, Kocuria , Pseudomonas , Xanthomonadaceae, 및 Sphingobium으로 이루어진 군에서 선택되는 다제내성균인 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (A)에서 유전자를 추출하는 단계는, 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동정방법.
    (a) 환자샘플을 원심분리하여 상등액을 얻은 후 필터에 의해 세균 및 이물질을 제거하는 단계;
    (b) 상기 필터링 후 얻은 산물을 원심분리하여 농축하는 단계;
    (c) 상기 농축 산물을 초고속원심분리하여 나노소포체 펠렛(pellet)을 얻는 단계;
    (d) 상기 나노소포체 펠렛을 열처리하는 단계; 및
    (e) 상기 열처리 산물을 원심분리하여 상등액을 얻는 단계.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 열처리는 90-110℃에서 5-30분간 행하는 것을 특징으로 하는, 동정방법.
  9. 하기의 단계를 포함하는, 세균성 중증 감염질환 원인균에 대한 항생제 내성예측방법.
    (A) 세균 유래 나노소포체를 함유하는 환자샘플에서 나노소포체 내의 유전자를 추출하는 단계;
    (B) 상기 추출된 유전자에 대하여 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (C) 상기 PCR 결과물이 정상인에 비하여 증가되어 있을 경우 세균성 중증 감염질환 원인균에 대하여 항생제 반응성이 낮을 것으로 판단하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 환자샘플은 소변, 혈액, 구강액, 위액, 대변, 비강액, 객담, 피부세척액, 흉막액, 복막액, 관절액, 뇌척수액, 양수, 및 질세척액으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 예측방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 나노소포체 내의 유전자는 16S rDNA 또는 16S rRNA인 것을 특징으로 하는, 예측방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 나노소포체는 평균 직경이 10-300nm인 것을 특징으로 하는, 예측방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 세균성 중증 감염질환은, 패혈증, 부비동염, 폐렴, 결핵, 감염성 심내막염, 골관절염, 골수염, 요로감염, 뇌염, 뇌막염, 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 예측방법.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 원인균은 Skermanella , Alkalibacterium , Ureaplasma, Corynebacterium , Streptococcus, Caulobacteraceae , Brevibacterium , Staphylococcus, Kocuria , Pseudomonas , Xanthomonadaceae, 및 Sphingobium으로 이루어진 군에서 선택되는 다제내성균인 것을 특징으로 하는, 예측방법.
  15. 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (A)에서 유전자를 추출하는 단계는, 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 예측방법.
    (a) 환자샘플을 원심분리하여 상등액을 얻은 후 필터에 의해 세균 및 이물질을 제거하는 단계;
    (b) 상기 필터링 후 얻은 산물을 원심분리하여 농축하는 단계;
    (c) 상기 농축 산물을 초고속원심분리하여 나노소포체 펠렛(pellet)을 얻는 단계;
    (d) 상기 나노소포체 펠렛을 열처리하는 단계; 및
    (e) 상기 열처리 산물을 원심분리하여 상등액을 얻는 단계.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 열처리는 90-110℃에서 5-30분간 행하는 것을 특징으로 하는, 예측방법.
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