KR102260992B1 - 항생제 내성 균주 검출용 조성물 및 그 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍 그리고 서열번호 33 및 34의 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍;
서열번호 53 및 54의 프라이머 쌍, 서열번호 89 및 90의 프라이머 쌍, 그리고 서열번호 91 및 92의 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍; 및/또는
서열번호 127 및 128의 프라이머 쌍을 포함하는 다중 항생제 내성 황색 포도상 구균, 다중 항생제 내성 폐렴 막대균 및/또는 살모넬라 티피무리움 검출용 키트 및 그것을 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머쌍은 이들 다중 항생제 내성 균주를 검출하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

항생제 내성 균주 검출용 조성물 및 그 방법{A COMPOSITION FOR DETECTING ANTIBIOTICS-RESISTANT BACTERIA AND A METHOD FOR DETECTING ANTIBIOTICS-RESISTANT BACTERIA USING THE SAME}

본 발명은 항생제 내성 균주 검출용 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.

항생제는 세균 감염을 예방하고 치료하는 데 사용되는 의약품으로, 오랫동안 많은 인간에 대한 이환율 및 사망률의 주요 원인인 감염성 질환을 방제하는데 많은 유익한 효과를 주어 오랫동안 널리 사용되어 왔다. 그러나 최근 항생제의 오용과 남용은 항생제 내성 박테리아의 발병을 일으켰다. 일부 국가에서 보고된 바와 같이, 동물의 박테리아를 제어하거나 더 많은 육류를 생산하는 데 사용되는 항생제는 인간의 박테리아보다 훨씬 높기 때문에 항생제 내성 박테리아가 발생하였다. 병원성 박테리아에서 다중 내성 및 교차 내성의 출현과 확산 때문에 항생제 사용과 내성 박테리아 발생 사이의 메커니즘을 이해해야 하고, 이는 다중 약물 내성 박테리아의 치료를 위한 가능한 해결책을 찾는데 도움이 된다.

병원균 Klebsiella pneumoniae는 다제 내성 K. pneumoniae 균주가 현재 항생제 치료의 치료 실패를 일으킬 수 있기 때문에 높은 이환율과 사망률로 병원성 감염을 주로 관여한다.

황색 포도상 구균 (Staphylococcus aureus)은 질병 통제 예방 센터 2016 (CDC 2016)에 따르면 미국에서 발병 관련 질병을 유발하는 상위 5가지 병원체 식품 범주 쌍 중 하나이다.

동일하고 다른 항생제에 반복적으로 노출되면, 메티실린 내성 S. 아우레우스 (MRSA)가 분리되어 심각한 임상 및 공중 보건 문제를 유발하는 것으로 보고되었다. 살모넬라 균으로 인한 살모넬라증은 치료에 사용된 항생제의 효과가 떨어지기 때문에 치료하기 어려워지는 감염 중 하나이다(WHO 2018). 다제 내성 살모넬라 티피무리움은 공중 보건에 심각한 위협이 되었다.

β-락탐 항균제에 내성을 갖는 다제내성 그람음성균에 의한 감염이 최근에 증가하는 추세이다. 이러한 감염은 사망률과 이환율을 높이고 치료기간이 길어져 의료비 상승의 원인이 되며, 병원감염관리에 어려움을 주고 있다.

그래서 감염병의 예방, 관리 및 적절한 치료를 위해서는 다제내성균을 신속하게 검출하여야 한다. 항생제 감수성검사는 다제내성균을 검출하는 기본검사이다. 이 검사는 균의 배양에 일정한 시간이 소요되며 β-락타마아제 유전자의 발현 정도가 다양하고 특이적인 억제제가 없어 내성기전을 정확하게 파악하기 어렵다. 이와 달리 분자생물학적인 방법으로 β-락타마아제 유전자를 검출하는 검사는 신속하고 정확하게 내성기전을 밝힐 수 있어 병원감염관리와 내성균의 역학적 연구에 유용된다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 등록특허 10-1473444

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항생제 내성 균주를 검출하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항생제 내성 균주를 검출하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍 그리고 서열번호 33 및 34의 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 다중 항생제 내성 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus) 검출용 키트를 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍 그리고 서열번호 33 및 34의 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 다중 항생제 내성 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항생제는 에리스로마이신, 시프로플록사신, 노르프로사신 및 테트라사이클린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항생제인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 박테리아를 포함하는 검체로부터 DNA를 추출하여 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍 그리고 서열번호 33 및 34의 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 처리하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계를 포함하는 다중 항생제 내성 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)을 검출하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 53 및 54의 프라이머 쌍, 서열번호 89 및 90의 프라이머 쌍, 그리고 서열번호 91 및 92의 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 다중 항생제 내성 폐렴 막대균(Klebsiella pneumoniae) 검출용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 53 및 54의 프라이머 쌍, 서열번호 89 및 90의 프라이머 쌍, 그리고 서열번호 91 및 92의 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 다중 항생제 내성 폐렴 막대균(Klebsiella pneumoniae) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항생제는 토보브라마이신, 크로람페니콜, 에리스로마이신, 시프로플록사신, 노르프로사신, 앰피실린, 및 세포타심으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항생제인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 박테리아를 포함하는 검체로부터 DNA를 추출하여 서열번호 53 및 54의 프라이머 쌍, 서열번호 89 및 90의 프라이머 쌍, 그리고 서열번호 91 및 92의 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 처리하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계를 포함하는 다중 항생제 내성 폐렴 막대균(Klebsiella pneumoniae)을 검출하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 127 및 128의 프라이머 쌍을 포함하는 다중 항생제 내성 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium ) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항생제는 토보브라마이신, 에리스로마이신, 테트라사이클린, 및 앰피실린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항생제인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 박테리아를 포함하는 검체로부터 DNA를 추출하여 서열번호 127 및 128의 프라이머 쌍을 처리하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계를 포함하는 다중 항생제 내성 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium )을 검출하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 이중 초점을 설정한다 : 첫째, 본 발명자들은 항생제 내성 균주를 검출하기 위하여 항생제 내성 균주들에서 프로테오믹 연구에서 설계된 특정 유전자의 발현을 관찰하고, 두 번째로 항생제에 S. aureus, K. pneumoniae 및 Salmonella thiphimurium을 노출시킨 다음 유전자 발현 연구를 수행하여 저항 메커니즘을 이해하고 이러한 박테리아를 치료할 수 있는 가능한 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 본 발명의 어떤 구현 예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR; 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 및 제4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR; Sambrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H I(WO 89/06700) 및 Davey, C 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification, TMA; WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication; WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences; 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction, CP-PCR; 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR; 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA; 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 멀티플렉스 PCR, 실-시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다.

PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, MJ, 및 Moller, SG PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, NY (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 방법이 프라이머를 이용하여 실시되는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상(예컨대, 임상검체-유래된 시료)에서 타겟 유전자들을 동시에 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 시료에서 추출한 DNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 시료는 임상검체-유래된 시료로, 상기 임상검체는 객담, 타액, 혈액 및 소변을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

시료에서 DNA를 추출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C et al, Plant Mol Biol Rep, 9:242(1991); Ausubel, FM et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P et al, Anal Biochem 162:156(1987)) 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, [0028] 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(2001) 및 Haymes, BD, 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E coli DNA 중합효소 I의 “클레나우(Klenow)”단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 실-시간 PCR을 통해 다양한 항생제 내성 균주를 동시에 검출할 수 있다.

실-시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실-시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(cycle threshold)을 가지게 된다.

3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다.

종래의 PCR 방법에 비해, 실-시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실-시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다;(g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실-시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.

실-시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating [0043] 방법(SYBR 그린I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.

먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실-시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat., Vol 23(5): 513-521(2004)).

Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다.

Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다 (http://www.appliedbiosystems.co.kr/).

한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5’-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3’-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = For fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 구체적으로는, TaqMan 프로브는 본원발명의 타겟 유전자 절편의 내부서열로 고안될 수 있다.

TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5’to 3’ 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5’-말단은 상기 연장 프라이머의 3’-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3’-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5’to 3’뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5’-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.

TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2™ (506), YOPRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110(520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533),TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568),BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™(615), Alexa™ 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), Rphycocyanin(642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670),Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC (546), BHQ-1 (534), BHQ-2 (579), BHQ-3 (672), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590(591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3(520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 Cy5,ROX, HEX, FAM, BHQ-1, BHQ-2 또는 Cy5.5-기반 표지를 포함한다.

적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH(Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972);Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992);Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R.P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene,Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 핵산은 임상검체로부터 유래된 핵산 시료를 포함한다. 타겟핵산을 연장 프라이머 및 프로브에 어닐링 또는 혼성화 시키는 방법은 당업계에 공지된 혼성화 방법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다.

이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다.

예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 반응 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(2001); 및 MLM Anderson, Nucleic Acid Hybridization,Springer-Verlag New York Inc NY(1999)에서 확인할 수 있다.

본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 5’to 3’ 뉴클레아제 활성을 가지는 효소이다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 바람직하게는 DNA 중합효소이다. 통상적으로 DNA 중합효소들은 5’to 3’ 뉴클레아제 활성을 가지고 있다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 E coli DNA 중합효소 I, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 주형-의존성 핵산중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함한다.

주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 촉매되는 “주형-의존성 연장반응”은 주형의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 합성하는 반응을 의미한다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 프라이머쌍은 항생제 내성 Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, 및/또는 Salmonella Typhimurium를 검출하는데 유용한 바이오마커로 사용될 수 있어서 이들 다중 항생제 내성 균주를 검출하는데 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 Staphylococcus aureus ATCC 15564 (SAWT), ciprofloxacin 유도된 Staphylococcus aureus ATCC 15564 (SACIP), oxacillin-유도된 Staphylococcus aureus ATCC 15564 (SAOXA) 및 Staphylococcus aureus CCARM 3080(SACCARM)의 qPCR 역치 (Ct) 값을 나타낸 그래프.
도 2는 Klebsiella pneumoniae ATCC 23357 (KPWT), ciprofloxacin 유도 Klebsiella pneumoniae ATCC 23357 (KPCIP) 및 Klebsiella pneumoniae CCARM 10237 (KPCCARM)의 qPCR 역치 (Ct) 값을 나타내는 그래프,
도 3은 Salmonella Typhimurium ATCC 19585 (STWT), ciprofloxacin 유도 Salmonella Typhimurium ATCC 23357 (STCIP) 및 Salmonella Typhimurium CCARM 8009 (STCCARM)의 qPCR 임계 값(Ct) 값을 나타낸 그래프.
도 4는 30 분 동안 8 * MIC로 시프로플록사신에 노출된 Staphylococcus aureus CCARM 3080(SACCARM), Staphylococcus aureus ATCC 15564 (SAWT), ciprofloxacin-유도 Staphylococcus aureus ATCC 15564 (SACIP), 및 oxacillin-유도된 Staphylococcus aureus ATCC 15564 (SAOXA)의 qPCR 역치(Ct)값을 나타내는 그래프,
도 5는 ciprofloxacin에 노출된 Klebsiella pneumoniae CCARM 10237 (KPCCARM), Klebsiella pneumoniae ATCC 23357 (KPWT), 및 ciprofloxacin 유도된 Klebsiella pneumoniae ATCC 23357 (KPCIP)의 qPCR 역치(Ct)값을 나타내는 그래프,
도 6은 8 * MIC로 30 분 동안 ciprofloxacin에 노출된 Salmonella Typhimurium CCARM 8009 (STCCARM), Salmonella Typhimurium ATCC 19585 (STWT), 및 ciprofloxacin 유도된 Salmonella Typhimurium ATCC 23357 (STCIP)의 qPCR 임계 값 (Ct) 값을 나타내는 그래프.

야생형 (WT), 시프로플록사신 (CIP) 및/또는 옥사실린 (OXA) 유도 및 임상적으로 분리된 내성(CCARM) S. aureus (SA^WT, SA^CIP, SA^OXA, 및 SA^CCARM), K. pneumoniae (KP^WT, KP^CIP, 및 KP^CCARM), 및 S. Typhimurium (ST^WT, ST^CIP, 및 ST^CCARM)의 항생제 감수성을 시프로플록사신 또는 옥사실린에 의한 내성 유도 후 결정하였다(표 1)

야생형 균주는 ST^WT의 경우 에리스로마이신 및 노보비오신, KP^WT의 경우 암피실린, 에리스로마이신 및 노보비오신, SA^WT의 경우 세포탁심 및 폴리믹신 B를 제외하고 본 발명에 사용된 모든 항생제에 민감하였다. SA^CCARM, KP^CCARM 및 ST^CCARM은 대부분의 항생제에 대해 높은 내성을 보였으며, 512 μg /ml 이상의 MIC를 보여주었다 (표 1).

Antibiotic	SAWT	SACIP	SAOXA	SACCARM	KPWT	KPCIP	KPCCARM	STWT	STCIP	STCCARM
Tobramycin	4	4	16	>512	4 (S)	2 (S)	256(R)	4(S)	2(S)	16(R)
Chloramphenicol	8(S)	16(I)	8(S)	16(I)	8(S)	256(R)	512(R)	8(S)	32(R)	4(S)
Erythromycin	0.5(S)	0.5(S)	0.5(S)	>512(R)	256(R)	256(R)	256(R)	128(R)	128(R)	128(R)
Ciprofloxacin	0.5(S)	32(R)	16(R)	32(R)	0.125(S)	8(R)	16(R)	0.0156(S)	4(R)	0.0156(S)
Norfloxacin	1(S)	32(R)	16(R)	32(R)	0.25(S)	16(R)	16(R)	0.0625(S)	16(R)	0.125(S)
Tetracycline	1(S)	0.5(S)	0.5(S)	64(R)	4(S)	8(I)	4(S)	1(S)	4(S)	512(R)
Ampicillin	16	16	128	64	>512(R)	>512(R)	>512(R)	8(S)	16(I)	>512 (R)
Cefotaxime	2	2	16	>512	0.125(S)	0.5(S)	8(R)	0.125(S)	0.5(S)	0.125(S)
Novobiocin	0.5	0.25	0.25	1	128	>512	256	512	>512	512
Polymyxin B	256	256	128	256	2	8	8	2	2	2

표 1은 Staphylococcus aureus (SA^WT, SA^CIP, SA^OXA, 및 SA^CCARM)^*, Klebsiella pneumoniae (KP^WT, KP^CIP, 및 KP^CCARM)^*, 및 Salmonella Typhimurium (ST^WT, ST^CIP, 및 ST^CCARM)^*의 최소 저해 농도(MICs, μg /ml)를 나타낸 표이다.표에서 ST^WT, KP^WT, 및 SA^WT 는 각각 S. Typhimurium ATCC 19585, K. pneumoniae ATCC 23357, 및 S. aureus ATCC 15564 야생형 균주를 나타내고, ST^CIP, KP^CIP, SA^CIP, 및 SA^OXA 는 각각 ciprofloxacin-유도된 S. Typhimurium, K. pneumoniae, S. aureus, 및 oxacillin-유도된 S. aureus을 나타내고, ST^CCARM, KP^CCARM, 및 SA^CCARM 는 각각 임상적으로 얻어진 항생제 내성 S. Typhimurium, K. pneumoniae, 및 S. aureus,를 나타내며, S, I, 및 R는 각각 감수성, 중간(intermediate), 및 내성 균주를 나타낸다

항생제 내성 균주에서 독특하게 발현되고 고도로 발현된 단백질들을 항생제 내성 병원체를 검출하기 위해 표적화되었다. 그 프라이머들은 프로테오믹스 결과에 기반하여 고안되고 감도 및 정확성을 검증하였다. 타겟 유전자는 다음과 같다:

Staphylococcus aureus -

.chaperone protein (dnaK), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapA), chaperonin GroEL protein (groEL), leucyl-tRNA synthetase (leuS), formate acetyltransferase (pflB), DNA-directed RNA polymerase beta subunit (rpoB), threonyl-tRNA synthetase 1 (thrS), elongation factor TS (tsf), elongation factor G (fusA), peptidylprolyl isomerase (prsA), Alkyl hydroperoxide reductase protein F (ahpF), phosphoglucosamine-mutase (GlmM), cell division protein (FtsZ), 및 alkyl hydroperoxide reductase protein C (ahpC),

Klebsiella pneumoniae-

alcohol dehydrogenase (KPHS_20050), GTP-binding elongation factor family protein (KPHS_39660), heat shock protein 90 (KPHS_07240), succinyl-CoA synthetase alpha subunit (KPHS_15690), 50S ribosomal protein L23 (KPHS_48650), cysteine transport protein (KPHS_10350), outer membrane protein A precursor (KPHS_18650), putative glycerol dehydrogenase ( KPHS_46250), putative small heat shock protein (pKPNCZ_0056), 및 ferrous iron transporter B, partial (KPHS_49310), 및

Salmonella Typhimurium-

outer membrane protein X (ompX), molecular chaperone (dnaK), Rho factor (rho), DNA starvation/stationary phase protection protein (dps), posphopyruvate hydrtase (eno), succinyl-CoA ligase (sucC), ribose-phosphate pyrophosphokinase (prsA), adenylate kinase (adk), Mn-superoxide dismutase (sodB), DNA-directed RNA polymerase subunit beta (rpoB), alcohol dehydrogenase (adhE), catalase hpII (KatE), pyruvate formate lyase-activating protein (pflE), succinate--CoA ligase subunit alpha (sucC), alkyl hydroperoxide reductase subunit F (ahpF), anaerobic glycerol-3-phosphate dehydrogenase subunit A (glpA), serine protein kinase PrkA (YeaG), 및 putative oxidoreductase (yhhX).

본 발명에서, 본 발명에 사용된 유전자의 상대적인 발현 수준은 비교 방법을 사용하여 계산되었다. 표적 유전자의 CT 값을 각각 항생제 감수성 및 항생제 내성 균주간에 비교하였다.

S. 아우레우스에서, 레퍼런스 유전자(16s rRNA), 샤페론 단백질 (dnaK), 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (gapA), 샤페로닌 GroEL 단백질(groEL), 류실 -tRNA 합성효소(leuS), DNA-디렉티드 RNA 폴리머라제 베타 서브유닛(rpoB), 트레오닐-tRNA 합성효소 1(thrS), 신장 인자 TS(tsf), 신장 인자 G(fusA), 펩티딜프롤릴 이소머라제(prsA), 알킬 히드로퍼옥사이드 환원효소 단백질 F(ahpF), 포스 포글루코사민-뮤타제( GlmM), 세포 분열 단백질(FtsZ) 및 알킬 하이드로퍼옥사이드환원효소 단백질 C(ahpC) 유전자를 항생제 감수성 및 항생제 내성 균주 사이에서 비교하였다(도 1).

스트레스 관련 유전자 (dnaK, groEL, alhF 및 ahpC)는 다중 약제 내성 포도상구균 CCARM 3080(SACCARM)에서 상대적으로 과발현되었으며 (그림 1), 이것은 스트레스 관련 유전자의 활성화가 항생제 내성의 발생에 기인할 수 있음을 시사한다. SACCARM에서 GlmM의 과발현은 글루코사민-6-포스페이트의 글루코사민 -1- 포스페이트로의 전환을 촉매하는데 도움을 주며, 이는 펩티도글리칸 생합성의 초기 원형질 단계이다. 상향 조절된 GlmM은 높은 수준의 메티 실린 내성을 유발할 수 있다.

fusA의 과발현은 S. 아우레우스의 메티실린, 리네졸리드 및 답토마이신 내성에 관여한다. 항생제 민감성 및 항생제 내성 균주 사이에서 유전자 발현의 LeuS, rpoB, ahpF 및 tsf의 현저한 변화가 관찰되지 않았다.

prsA 유전자는 다중 약제 내성 포도상 구균 아우레우스 CCARM 3080 (SACCARM)에서 고도로 과발현되고,이어서 옥사실린-유도 스타필로코커스 아우레 우스 ATCC 15564 (SAOXA) 및 시프로플록사신-유도 스타필로코커스 아우레 우스 ATCC 15564 (SACIP)와 야생형 스타필로코커스 아우레우스 ATCC 15564(SAWT)가 뒤 따랐다 (그림 1). prsA는 PPB2a를 안정화시킬 수 있는 막-고정된 펩 티딜-프롤릴 시스-트랜스 이성질화 효소 단백질이다. PBP2a는 모바일 SCCmec 카세트 염색체에서 mecA 유전자에 의해 암호화된다. PBP2a의 획득 및 안정화는 메티실린 내성 S. 아우레 우스 (MRSA)에서 β-락탐 항생제의 낮은 친화성을 초래한다. prsA는 또한 옥사실린-및 글리코 펩타이드-내성 S. 아우레우스에서 검출된다. prsA의 발현은 항생제 내성 스타필로코쿠스 아우레 우스에서 독특한 현상이다. 따라서, prsA 유전자는 다중 약제 내성 황색 포도상 구균의 검출을위한 저항 마커로서 사용될 수 있다.

알코올 탈수소효소 (KPHS_20050), GTP 결합 신장 인자 계열 단백질 (KPHS_39660), 열충격 단백질 90 (KPHS_07240), 숙시닐 -CoA 합성효소 알파 서브 유닛 (KPHS_15690), 50S 리보솜 단백질 L23 (KPHS_48650), 시스테인 수송 단백질(KPHS_10350), 외막 단백질 A 전구체(KPHS_18650), 추정 글리세롤 탈수소효소 (KPHS_46250), 추정 스몰 열충격 단백질(pKPNCZ_0056) 및 철 이온 수송체 B, 부분(KPHS_49310)의 상대적 발현은 KPATCC, KPCIP 및 KPCCARM에서 관찰되었다(도 2).

표적 유전자의 발현 패턴은 항생제 감수성 및 항생제 내성 균주 사이에서 다양하였다. 유전자 KPHS_39660의 발현은 KPWT와 비교하여 KPCCARM에서 상대적으로 과발현되었다(도 2). 박테리아는 손상된 단백질과 DNA를 복구하거나 세포에서 항생제를 펌핑하기 위해 높은 에너지가 필요하다. 유전자 KPHS_07240, KPHS_48650, KPHS_10350 및 KPHS_49310의 발현은 항생제 감수성 및 항생제 내성 균주간에 유의 한 차이를 나타내지 않았다. 유전자 KPHS_20050 및 KPHS_18650은 KPCCARM에 대해 유의한 발현을 나타내지 않았다. 그러나, 추정된 스몰 열 충격 단백질 (pKPNCZ_0056)은 KPCCARM에서만 발현되었다. KPCCARM에서 고도로 상향 조절된 유전자 (pKPNCZ_0056)는 항생제 내성 K. 뉴모니애를 검출하기 위한 바이오 마커로서 사용될 수 있다.

외막 단백질 X (ompX), 분자 샤페론(dnaK), Rho 인자(rho), DNA 기아/정상 phase 보호 단백질(dps), 포스포피루베이트 하이드타제(eno), 숙시닐 -CoA 리가제 (sucC), 리보스-포스페이트 피로포스포키나제 (prsA), 아데닐레이트 키나제(adk), Mn-superoxide dismutase (sodB), DNA-디렉티드 RNA 중합효소 서브 유닛 베타 (rpoB), 알코올 탈수소효소(adhE), 카탈라제 hpII(KatE), 피루베이트 포르메이트 분해 효소-활성화 단백질(pflE), 숙시네이트 -CoA 리가제 서브 유닛 알파(sucC), 알킬 하이드로퍼옥사이드 리덕타제 서브 유닛 F (ahpF), 혐기성 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 서브 유닛 A(glpA), 세린 단백질 키나제 PrkA (YeaG) 및 추정 산화환원효소 (yhhX) ) 유전자의 상대적 발현을 STWT, STCIP 및 STCA에서 관찰하였다 (도 3).

STWT, STCIP 및 STCCARM 사이에 유전자 발현의 유의미한 차이가 관찰되지 않았다(도 3). 항생제 내성 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에 대한 바이오 마커의 검출을 위해, 본 발명자들은 항생제 노출 실험을 수행하였다.

본 발명에서는 또한 항생제 내성 세균을 검출하는 데 도움이 될 수 있게 30분 동안 8*MIC 시프로플록사신에 노출시킨 후 유전자들의 상대적인 발현을 조사하였다. 스트레스 관련 유전자 (dnaK 및 groEL)는 ciprofloxacin에 노출된 후 다중 약제 내성 포도상 구균 CCARM 3080 (SACCARM)에서 과발현되었으며(그림 4), 이것은 스트레스 관련 단백질의 활성화가 항생제 저항성의 발생에 기인할 수 있음을 시사한다.

그러나 leuS 유전자는 야생형 황색 포도상 구균 ATCC 15564 (SAWT)과 비교하여 다중 약제 내성 황색 포도상 구균 CCARM 3080 (SACCARM)에서 과발현되고, 옥사 실린-유도 황색 포도상 구균 ATCC 15564 (SAOXA) 및 시프로플록사신-유도 황색 포도상 구균 ATCC 15564 (SACIP) 순서이었다(그림 4). 항생제에 노출된 후 차등적으로 발현된 leuS 유전자는 항생제 내성 황색 포도상 구균을 검출하기 위한 바이오 마커를 사용할 수 있다. rpoB, rpsE, thrS 및 tsf의 발현은 시프로플록사신에 노출 된 후 모든 균주에서 거의 동일하게 유지된다. 항생제 내성 유전자 aac(6')/aph(2”), qacA 및 qacB는 항생제에 노출된 후 항생제 내성 황색 포도상 구균 (SACIP, SAOXA 및 SACCARM)에서만 탐지되며 따라서 항생제 내성 황색 포도상 구균에 대한 검출 마커로 사용될 수 있다.

또한 유출 펌프 관련 유전자(acrA 및 acrB), β-락타마제 관련 유전자 (CTX-M) 및 철 수송체 B 유전자(KPHS_49310)의 상대적 발현은 KPWT와 비교하여 KPCIP 및 KPCCARM에서 상대적으로 과발현되었다(도 5) 30분 동안 8 * MIC로 시프로플록사신에 노출된 후. 유출 펌프 활성과 관련된 유전자 arcA 및 acrB는 항생제에 대한 내성을 향상시킨다. 증가된 CTX-M 유전자는 KPCIP 및 KPCCARM에서 β-락탐 항생제에 대한 감소된 감수성과 관련이 있다. 그러나, 독성 관련 유전자(vagC 및 vagD) 및 추정적 작은 열 충격 유전자(pKPNCZ_0056)의 발현은 시프로플록사신에 노출된 후 KPCCARM에서만 관찰되었다. 따라서, 항생제에 노출된 후 KPCCARM에서 고도로 발현 된(vagC, vagD 및 pKPNCZ_0056) 유전자는 다중 약제 내성 K. 뉴모니애를 검출하기위한 바이오 마커로서 사용될 수 있다.

유출 펌프(acrA, acrB 및 tolC), 외막 단백질(ompC 및 ompX), 스트레스 반응 (rpoS 및 sodB), 단백질 폴딩(dnaK 및 prsA) 및 에너지 생산(eno, sucC, adK, yhhX 및 yeaG ) 관련 유전자는 30분 동안 8 * MIC로 시프로플록사신에 노출된 후 STWT와 비교하여 STCCARM 및 STCIP에서 상대적으로 상향 조절되었다(도 6). ArcAB-TolC는 박테리아의 다중 항생제 내성에 관여하는 RND 계열에 속하는 유출 펌프 관련 유전자이다. 포린 관련 유전자의 변화는 항생제 내성 유전자를 암호화하는 플라스미드에 의해 지시되었다. 흥미롭게도, yhhX 유전자는 야생형 살모넬라 티피무리움 ATCC 19585 (STWT)와 비교하여 다중 약제 내성 살모넬라 티피무리움 CCARM 8009(STCCARM)에서 고도로 과발현되고,이어서 시프로플록사신-유도 살모넬라 티피무리움 ATCC 23357(STCIP) 순서이었다(도 5). STCCARM 및 STCIP에서 고도로 상향 조절된 유전자(yhhX)는 다중 약제 내성 살모넬라 티피무리움을 검출하기 위한 바이오 마커로서 사용될 수 있다.

표 2 및 3은 S. aureus에 대한 실시간 분석에 사용된 프라이머 서열

^* F, forward; R, reverse

표 4 및 5는 K. pneumoniae에 대한 실시간 분석에 사용된 프라이머 서열

^* F, forward; R, reverse

표 6 및 7은 Salmonella Typhimurium에 대한 실시간 분석에 사용된 프라이머 서열

^* F, forward; R, reverse

<110> University-Industry Cooperation Foundation, Kangwon National University <120> A COMPOSITION FOR DETECTING ANTIBIOTICS-RESISTANT BACTERIA AND A METHOD FOR DETECTING ANTIBIOTICS-RESISTANT BACTERIA USING THE SAME <130> P19-0147HS <160> 144 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cagaagaagc accggctaac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aatgcagttc ccaggttgag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgctgcatta gcgttcaaag 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 accgcagcag cgatatctc 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aggtgacatt gaaacaggtg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgagcgtgtt actttagttg g 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gggaagatgg aacaatgaca ac 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ttagctagtg gagactcacc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atacacctgg acacgtagac 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgatacgtgg aacaccataa g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtgacgttca ctactctcac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gctatcttct tcgtcagctg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tcaatggata ctggttcagc 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 acaacctctg atacttcacc a 21 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gtcctgctag tggtagtgc 19 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tgaagttctc aataccagca g 21 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 aagcgcttga acaagaagg 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gtccagattg ttctccacc 19 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 aagatgctgc agatgaagac g 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ttccgaatcc agtgctacca g 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tatcgaccca gacggtgttg 20 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 agctgggcat acttcgcca 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 acttacacat gggtggacgc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gcaacgtctc ttgctgcttc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ggaccaccag cgataactcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ccacacacaa ttactggccg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ttcggaccat agaatgccgc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 taaagaggca gcggatgagc 20 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tgccacacta tcataaccac tacc 24 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 acatgaatta cacgagggca 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cgcagaaagt gcagagttcg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 agctaatgca gtggcccttt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 caattgcacc cggattagcg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gccgtaccag ctccaactaa 20 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 ggacgggtga gtaatgtc 18 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tctcagacca gctagggatc g 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gaaagcctgg tagaagacct g 21 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 tctgcaccat cggcatacg 19 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 tcttgagtac gatccgaacc 20 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 tgcctgcttt gattgcagc 19 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gtgctatgat acgctgctgg 20 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 aaaccgttgt ggattgcatg g 21 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 tcgcgtcctc tcctatgac 19 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 cggttcgcct ttcttcacg 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 tgttgttctg ggctacacc 19 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 cctttagcaa ccaggtagtc 20 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 cagctcatca acgcatacc 19 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 cagcttcatc gtgtctttac c 21 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 actgagcctt aacgatgcct 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 ggtgatcagg tcgagatcgt 20 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gattgtggcg aataccgac 19 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 acgcttacgt ccaatcgct 19 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 tgtctgcatt gactccgtgg 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 aatgcgttct catcctcgct 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gagcagattg cctgccacta 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 agcgtcagat agaggttgcg 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 cggtgggaag aagaaaccga 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 cttggttccc aagcctttgc 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 atgtgacgat aaaccggctc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 ctggcagttc ggtggttatt 20 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 cgataacctg atgtacatgt cc 22 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 ccgacaacca tcaggaagct 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 atttgctgat ttcgctcggc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 cctgcttggc ccgaataaca 20 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 tcgatcaaac cgttcagtta gg 22 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 accgtagtgt cgcaatcatc 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 tgtgagaaaa acggcaacga 20 <210> 68 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 ctggcggcga aaagca 16 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 gaatggccgg tctctttctt 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 cctgtcgctg gaaaaagtgt 20 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 gcagcaccag taaagtgatg g 21 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 gcgatatcgt tggtggtgcc 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 tcgtctatcc cgacgtcttt 20 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 ccagtcgtag gaggtgtact ta 22 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 tccctgccct gctggtag 18 <210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 ctggtgtcgc cattggtgg 19 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 cgaagaaaga cctccctacc c 21 <210> 78 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 cgccgccaat gagataca 18 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 tgatgggctt tgtggcttc 19 <210> 80 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 cttgctgtca tagtcgct 18 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 gcataagcaa caccgacagg 20 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 ggcgaagtaa tcgcaacatc c 21 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 ctgcaacggc tgtttttaca 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 gtggttctct ttgcggtagg 20 <210> 85 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 aaggcgaatc cagcttgttc agc 23 <210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 tgacgttgca tgttcgcacc catca 25 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 gcaggcggcg ctggcgaata 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 agtcgccaga aagtcaggat 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 gctcaaagcg tccttcatcg 20 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 gggaagggga cagcatcatt c 21 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 cgaagcgcat ctcggcatac 20 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 gatgctcgac accaacatct g 21 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 aggccttcgg gttgtaaagt 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 gttagccggt gcttcttctg 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 caagcatcta cggtgtagtc 20 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 gtaagagaag tccagagcaa c 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 atggtgaaac tctggttggt c 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 gtacggcatg atagaaacgt c 21 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 atcatcaacg aaccgactgc 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 tcaggtgctt ctactggttc 20 <210> 101 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 tcgcgtcctc tcctatgac 19 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 ctggtcttta gcgtctttgc 20 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 cgcgattgaa cagattgtct c 21 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 acaggcataa cggatgatcg 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 aaccaacgac aacctgatgg 20 <210> 106 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 acaggaagtc agcgacaac 19 <210> 107 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 tgtgaaagac gtactgctg 19 <210> 108 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 cagtagagaa cacctggct 19 <210> 109 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 actctcctgc cataactgc 19 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 cgttacgttc ggtgatttcg 20 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 aagatgctgc agatgaagac g 21 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 tatcaccagt gcggaggttg 20 <210> 113 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 agacctgagc gacatcacg 19 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 cacgtacggt atcagcagac 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 ctcattcgtg aaggcgcaac 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 ccagatacct gccgcattga 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 117 cccaggaaga ctgccgtaac 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 atccacgaca atacccgctt 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 ctttaaacag ctctgccgcc 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 gatgagatca tggcgacggt 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 ttcccacaca tcaaccgtca 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 122 cggatggaca tggctggtaa 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 123 aagcgaagcg ccgtaaaatc 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 124 acccttgtta ccgtgacgac 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 accggctaac ttccttgacg 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 ccagaaccgc tttcacgttg 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 127 ggacgccaag tccgtagaaa 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 128 attgagagcg ggaaactggg 20 <210> 129 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 129 aaaacggcaa agcgaaggt 19 <210> 130 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 130 gtaccggact gcgggaatt 19 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 131 tgaaaaaaat ggaaccgttc ttc 23 <210> 132 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 132 cgaacggcgt ggtgtca 17 <210> 133 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 133 gcccgtgcgc aatatgat 18 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 134 ccgcgttatc caggttgttg 20 <210> 135 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 135 tcgcagcctg ctgaaccaga ac 22 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 136 acgggttgcg ttataggtct gag 23 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 137 catcgtcaaa tggttgttcg 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 138 atcttccagt gtcgcagctt 20 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 139 ttgcgagtct gatgtttgtc g 21 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 140 cacgctcacc ggagtaggat 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 141 accggctaac ttccttgacg 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 142 ccagaaccgc tttcacgttg 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 143 cccaggaaga ctgccgtaac 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 144 atccacgaca atacccgctt 20

Claims (3)

1. 서열번호 53 및 54의 프라이머 쌍, 서열번호 89 및 90의 프라이머 쌍, 그리고 서열번호 91 및 92의 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 다중 항생제 내성 폐렴 막대균(Klebsiella pneumoniae) 검출용 키트.
2. 제1항에 있어서, 상기 항생제는 토보브라마이신, 크로람페니콜, 에리스로마이신, 시프로플록사신, 노르프로사신, 앰피실린, 및 세포타심으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항생제인 것을 특징으로 하는 다중 항생제 내성 폐렴 막대균(Klebsiella pneumoniae) 검출용 키트
3. 박테리아를 포함하는 검체로부터 DNA를 추출하여 서열번호 53 및 54의 프라이머 쌍, 서열번호 89 및 90의 프라이머 쌍, 그리고 서열번호 91 및 92의 프라이머 쌍을 처리하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계를 포함하는 다중 항생제 내성 폐렴 막대균(Klebsiella pneumoniae)을 검출하는 방법.

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