KR102555540B1 - 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트 - Google Patents

마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트 및 검출 방법을 이용하는 경우, 한번의 PCR 반응으로 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아를 검출할 수 있다.

Description

마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트{Kits for Detecting Macrolide drug Resistant Mycoplasma pneumoniae}
본 발명은 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트에 관한 것이다.
마이코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae, MP)은 급성호흡기감염증을 유발하는 병원체 9종 중 하나로 2010년 12월 30일부터 지정감염병으로 분류-관리되고 있다. 마이코플라스마 뉴모니아는 호흡기계(인후， 폐， 기관지)의 내벽을 손상시켜 질병을 일으키는 폐렴원인균으로 감염 시 급성호흡기질환 증상으로 가벼운 질환(발열， 기침， 인후통 두통， 피로감 등)을 시작으로 상기도감염증(인후염)，기관지염 등을 유발하며 심한 경우 비정형 폐렴으로 발전하기도 한다.
마이코플라스마 뉴모니아 감염 진단방법으로는 급성호흡기감염증 환자의 검체에서 마이코플라스마 뉴모니아를 분리 동정할 수 있은 배양검사와 감염균의 특이 유전자를 증폭 검출할 수 있는 PCR(중합효소연쇄반응법)기반의 분자진단검사법이 시행되고 있다. 그 외 혈청학적 검사법 (항원-항체 검사) 또는 효소면역측정법(ELlSA 등)을 이용하여 급성기와 회복기의 항체 역가를 측정하기도 한다.
배양검사를 위한 검체는 감염 의심환자의 인후 도찰물(swab)， 호흡기 도찰물， 비강 흡인물，호흡기 흡인물, 폐포 세척액, 객담 등이 모두 사용가능 하지만 배양조건에 따라 성장 속도가 다르며 보통 2주 이상의 배양시간이 필요한 단점이 있다. 또한, 배양검사를 하더라도 PCR 검사 등의 분자기반 핵산증폭검사를 병행해야한다.
이러한 배앙검사 방식은 마이코플라스마 뉴모니아의 최종 확진까지 검출시간이 매우 오래 걸리고 검출방법이 복잡한 단점이 있으며, 마크로라이드계 항생제 내성 유무를 판별하지 못하는 문제가 있다.
대한민국 등록특허 제10-1038519호
본 발명자들은 마이코플라스마 뉴모니아를 검출함과 동시에 마크로라이드계 항생제 내성 유무를 함께 판별할 수 있는 검출용 키트를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 이용하여 한번의 PCR 반응으로 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아를 검출할 수 있는 검출용 키트를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 프라이머 조합; 및
(ii) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 항생제 내성 확인용 제1 프라이머 조합, 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 항생제 내성 확인용 제2 프라이머 조합을 포함하는 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머(primer)”는 핵산 가닥(템플레이트)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하에서, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재 시, 그리고 적합한 온도와 pH에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고 뉴클레오타이드를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 프라이머 조합 및 항생제 내성 확인용 프라이머 조합은 실시간 PCR용 프라이머 조합인 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 하기의 프로브를 추가적으로 포함하는 것이다:
(i) 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 프라이머 조합은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브; 또는
(ii) 상기 항생제 내성 확인용 제1 프라이머 조합은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브, 또는 상기 항생제 내성 확인용 제2 프라이머 조합은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 서열번호 4, 7 및 13의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM, TET, HEX, JOE, ROX, TMR, Cy5 및 Cal Red 610로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되고, 3'-말단은 BHQ-1, BHQ-2 또는 BHQ-3의 퀀처(quencher)로 변형된 것이다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 Cy5로 표지되고, 3'-말단은 BHQ3으로 변형되며; 상기 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM으로 표지되고, 3'-말단은 BHQ1으로 변형되며; 상기 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM으로 표지되고, 3'-말단은 BHQ1으로 변형된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항생제는 마크로라이드계 항생제이다.
마크로라이드계 항생제는 마크로사이클릭 락톤 고리(macrocyclic lactone ring)를 가지고 있는 항생제로 에리스로마이신(erythromycin), 올렌도마이신(oleandomycin), 키타사마이신(kitasamycin), 요사마이신(josamycin), 미데카마이신(midecamycin), 스피라마이신(spiramycin), 카보마이신(carbomycin), 암포마이신(amphomycin), 블레운소마이신(bleunsomycin), 뉴트라마이신(neutramycin), 렐로마이신(relomycin), 리프아미드(rifamide), 클라리스로마이신(clarithromycin), 아지스로마이신(azithromycin) 등이 있다.
본 발명의 상기 프라이머 및 프로브는 마이코플라스마 뉴모니아 및 마크로라이드계 항생제 내성 여부를 확인하기 위해 마이코플라스마 뉴모니아의 P1 유전자(서열번호 1 내지 4의 프라이머 및 프로브), A2063G(서열번호 5 내지 7의 프라이머 및 프로브), A2064G(서열번호 11 내지 13의 프라이머 및 프로브)를 검출대상으로 한다.
본 발명의 상기 A2063G 및 A2064G는 마이코플라스마 뉴모니아의 23s rRNA 유전자의 SNP이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브(probe)"는 타겟 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다. 상기 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 서열"은 검출하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링, 또는 증폭 조건 하에서 프라미어 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
보다 구체적으로는 프로브 및 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍 시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 템플레이트 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 템플레이트 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 일치하거나 일부 미스매치로 실질적으로 일치하는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 조성물을 포함하는 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시되는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것이다.
본 발명의 키트는 상기 프라이머 및 프로브를 이용하여 중합효소연쇄반응방식을 통해 마이코플라스마 뉴모니아 및 항생제 내성 여부를 동시에 멀티플렉스 검출(multiplex detection or multiplexing detection)한다.
상기 "멀티플렉스 검출" 또는 "멀티플렉싱 검출"은 반응 용기(예컨대, 반응 튜브)에서 복수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출하는 것을 의미한다.
상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)"은 반응 용기에서 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에 의하여 복수의 타겟이 동시적으로 증폭되는 것을 의미한다.
상기 중합효소연쇄반응에는 다양한 DNA 중합효소가 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 '클레나우' 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 Taq DNA 중합효소 또는 Pfu DNA 중합효소를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 Taq DNA 중합효소를 포함한다.
본 발명의 키트는 중합효소연쇄반응 산물에 의한 캐리오버(carryover) 또는 크로스오버(crossover) 오염을 차단하기 위해 dUTP(deoxyuridine triphosphate) 및 UDG(Uracil DNA Glycosilase)를 추가적으로 포함할 수 있다. UDG는 이전 증폭산물 DNA 주형가닥에 포함된 우라실(Uracil)을 인식하고 잘라내며, 잘려진 DNA 주형가닥은 더 이상 주형가닥으로의 역할을 상실하게 됨으로써 증폭반응이 일어나지 않게 된다. 본 발명은 dUTP 및 UDG를 사용함으로써 이전 증폭산물의 오염에 의한 증폭산물의 생성을 원천 차단하여, 이전 증폭생성물의 검사실 오염에 따른 위양성 결과를 배제하여 검사의 정확도를 향상시킨다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 유전자 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시된다.
상기 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링 할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. Interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.
먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat., Vol 23(5): 513-521(2004)).
Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 △Rn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, △Rn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어 어닐링할 수 있도록 고안된다. 예를들어, TaqMan 프로브는 서열번호 1 내지 3에 의해 증폭되는 마이코플라스마 뉴모니아 P1 유전자 절편의 내부서열로 고안될 수 있다.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다.
본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM(506), YOPROTM-1(509), YOYOTM-1 (509), Calcein(517), FITC(518), FluorXTM(519), AlexaTM(520), rhodamine 110(520), 5-FAM(522), Oregon GreenTM500(522), Oregon GreenTM488(524), RiboGreenTM(525), RhodamineGreenTM(527), Rhodamine 123(529), Magnesium GreenTM(531), Calcium GreenTM(533), TO-PROTM-1(533), TOTO1(533), JOE(548), BODIPY530/550(550), Dil(565), BODIPY TMR(568), BODIPY558/568(568), BODIPY564/570(570), Cy3TM(570), AlexaTM546(570), TRITC(572), Magnesium OrangeTM(575), Phycoerythrin R&B(575), Rhodamine Phalloidin(575), Calcium OrangeTM(576), Pyronin Y(580), RhodamineB(580), TAMRA(582), Rhodamine RedTM(590), Cy3.5TM(596), ROX(608), Calcium CrimsonTM(615), AlexaTM594(615), Texas Red(615), Nile Red(628), YO-PROTM-3(631), YOYOTM-3(631), R-phycocyanin(642), CPhycocyanin(648), TO-PROTM-3(660), TOTO3(660), DiD DilC(5)(665), Cy5TM(670), Thiadicarbocyanine(671), Cy5.5(694), HEX(556), TET(536), VIC(546), BHQ-1(534), BHQ-2(579), BHQ-3(672), BiosearchBlue(447), CAL Fluor Gold 540(544), CAL Fluor Orange 560(559), CAL Fluor Red 590(591), CAL FluorRed 610(610), CAL Fluor Red 635(637), FAM(520), Fluorescein(520), Fluorescein-C3(520), Pulsar 650(566), Quasar 570(667), Quasar 670(705) 및 Quasar 705(610).
본 발명의 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트는 중합효소연쇄반응이 정상적으로 실시되었는지 확인하기 위한 PCR 대조군 세트를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아의 검출 방법을 제공한다:
(a) 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계;
(b) (i) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 프라이머 조합; 및
(ii) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 항생제 내성 확인용 제1 프라이머 조합, 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 항생제 내성 확인용 제2 프라이머 조합을 포함하는 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 조성물을 이용하여 상기 검체시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.
이하 상기 방법을 단계별로 설명한다.
(a) 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계;
본 명세서에서 용어 "검체시료"는 다양한 시료를 포함하며, 검체시료는 본 발명의 방법을 이용하여 분석된다. 보다 구체적으로는 본 발명에 기재된 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아를 분리 배양한 시료이거나, 상기 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아에 감염된 대상체에서 분리한 시료일 수 있다. 대상체로부터 분리한 시료는 세포, 조직, 체액일 수 있으며, 상기 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 안구 유액, 타액, 조직 추출물, 인후 도찰물， 호흡기 도찰물， 비강 흡인물, 호흡기 흡인물, 폐포 세척액 및 객담일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계는 상기 검체시료를 PCR 방법에 적용하기 위해 처리하는 단계이다. 상기 검체시료의 처리 방식은 DNA 추출 또는 RNA 추출방식을 적용할 수 있으며 보다 구체적으로는 DNA 추출방식을 적용할 수 있다. 상기 시료로부터 DNA 또는 RNA를 추출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)).
(b) 상술된 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 서열을 증폭하는 단계
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시된다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시된다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 실시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 표지가 결합되어 있고, 상기 단계 (c)의 확인은 상기 프로브로부터 발생되는 시그널을 검출하여 실시된다.
본 발명의 방법은 상기 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
(c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.
전통적인 PCR 방식을 이용하여 서열을 증폭하는 경우에는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동에 의해 증폭 결과를 확인할 수 있으며, 보다 구체적으로는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 전기영동 후에는 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색 등의 방식으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다.
실시간 PCR 방식을 이용하여 서열을 증폭하는 경우 미지시료의 양성, 음성여부에 관계없이 증폭되는 인터널 콘트롤의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻을 수 있다. 이러한 인터널 콘트롤의 Cp값 또는 Ct값과 형광 세기의 표준 곡선은 음성 대조군의 Cp값 또는 Ct값과 형광세기의 곡선 패턴과 명확하게 구별되어 미지시료의 양성 또는 음성 여부를 판단하는 기준을 제공할 수 있다. 따라서, 검체시료를 PCR 증폭하여 전체 PCR 증폭 기간에 대한 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻은 후, 인터널 콘트롤 및 음성 대조군의 Cp값 또는 Ct값과 형광세기의 곡선 패턴과 비교하여 시료 내에 표적 유전자가 포함되어 있는지 여부를 확인할 수 있다.
상기 방법은 증폭 결과를 확인하는 예시적인 방법으로, 상기 증폭 결과를 확인하는 방법은 이에 한정되지 않고 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 검출 방법은 다음의 단계를 포함하는 것이다:
(a) 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계;
(b) (i) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머. 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 조성물; 및
(ii) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머, 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브를 포함하는 항생제 내성 검출용 조성물 1, 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머, 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브를 포함하는 항생제 내성 검출용 조성물 2를 이용하여 상기 검체시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트를 제공한다.
(c) 본 발명은 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아의 검출 방법을 제공한다.
(d) 본 발명의 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트 및 검출 방법을 이용하는 경우, 한번의 PCR 반응으로 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아를 검출할 수 있다.
도 1은 마이코플라스마 뉴모니아에 대한 검출민감도를 측정하기 위해 실시한 PCR 결과를 나타낸다.
도 2는 A2063G에 대한 검출민감도를 측정하기 위해 실시한 PCR 결과를 나타낸다.
도 3은 A2064G에 대한 검출민감도를 측정하기 위해 실시한 PCR 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 검출특이도를 검증하기 위해 음성표준물질 102종 및 양성표준물질 1종을 대상으로 실시한 PCR 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 분석적 특이도를 검증하기 위해 간섭물질의 존재 하에 양성표준물질(MP, A2063G, A2064G)을 대상으로 실시한 PCR 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 정밀도를 검증하기 위해 검출대상을 10X LOD(최소검출한계), 3X LOD 및 1X LOD로 희석하여 실시한 PCR 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 정밀도를 검증하기 위해 검출대상을 10X LOD(최소검출한계), 3X LOD 및 1X LOD로 희석하고 실험장소를 달리하여 실시한 PCR 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 정밀도를 검증하기 위해 검출대상을 10X LOD(최소검출한계), 3X LOD 및 1X LOD로 희석하고 실험자를 달리하여 실시한 PCR 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 정밀도를 검증하기 위해 검출대상을 10X LOD(최소검출한계), 3X LOD 및 1X LOD로 희석하고 실험장비를 달리하여 실시한 PCR 결과를 나타낸다.
도 10은 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출에 대한 검출모식도를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
시험대상 양성, 음성 표준물질의 준비
본 성능시험을 위해 항생제 내성 균주 은행, 한국 미생물 보존센터， 한국생명공학연구원(KCTC), ATCC(American Type Culture Collection) 등의 균주 분양기관으로부터 다양한 음성 병원성 미생물 및 유전자를 확보하였다. 확보한 양성 표준물질 마이코플라스마 뉴모니아e(ATCC qCRM-15531 D) 1 종과 음성표준물질 102 종은 표1에 기재하였다. 또한, A2063G 및 A2064G는 합성하여 염기서열분석이 완료된 양성 플라스미드 DNA를 사용하였다.
No. 자원명 자원번호 No. 자원명 자원번호
1 Streptococcus pneumoniae NCCP14585 53 Mycobacterium kansasii NCCP15672
2 NCCP14774 54 Corynebacterium ammoniagenes KCTC1018
3 Legionella pneumophila NCCP16506 55 Staphylococcus arlettae KCTC 3588
4 NCCP16509 56 Staphylococcus equorum subsp. equorum KCTC 3589
5 Bordetella pertussis NCCP13671 57 Staphylococcus kloosii KCTC 3590
6 Haemophilus influenzae NCCP14785 58 Staphylococcus pasteuri KCTC 13167
7 NCCP14676 59 Streptococcus alactolyticus KCTC3644
8 Mycoplasma pneumoniae ATCC qCRM-15531D 60 Streptococcus criceti KCTC 3292
9 Chlamydophila penumoniae ATCC 53592DQ 61 Streptococcus downei KCTC 3634
10 Moraxella catarrhalis CCARM 9004 62 Streptococcus ferus KCTC 3637
11 Staphylococcus chromogenes KCTC 3579 63 Streptococcus gallinaceus KCTC 3876
12 Staphylococcus delphini KCTC 3592 64 Streptococcus hyointestinalis KCTC 3660
13 Staphylococcus gallinarum KCTC 3585 65 Streptococcus vestibularis KCTC 3650
14 Klebsiella pneumoniae NCCP14764 66 Streptococcus macacae KCTC3659
15 pseudomonas aeruginosa NCCP14640 67 Streptococcus parauberis KCTC3651
16 Acinetobacter baumannii NCCP14607 68 Mycobacterium tuberculosis KMRC 00110-00001
17 Acinetobacter baumannii NCCP 14654 69 Mycobacterium abscessus KMRC 00136-61038
18 Staphylococcus aureus NCCP14647 70 Mycobacterium arupense KMRC 00136-15004
19 Bacillus cereus NCCP14043 71 Mycobacterium aubagnense KMRC 00136-72001
20 Bacillus subtilis NCCP16297 72 Mycobacterium avium KMRC 00136-41014
21 Campylobacter jejuni NCCP11192 73 Mycobacterium bolletii KMRC 00136-52005
22 Citrobacter freundii NCCP14611 74 Mycobacterium colombiense KMRC 00136-86001
23 Enterobacter aerogenes NCCP14761 75 Mycobacterium conceptionense KMRC 00136-79001
24 Enterobacter cloacae NCCP14620 76 Mycobacterium chitae KMRC 00136-80001
25 Enterococcus faecium NCCP14674 77 Mycobacterium fortuitum KMRC 00136-60003
26 Klebsiella oxytoca NCCP14710 78 Mycobacterium gordonae KMRC 00136-32003
27 Propionibacterium acnes NCCP14784 79 Mycobacterium goodii KMRC 00136-28002
28 Proteus mirabilis NCCP14683 80 Mycobacterium heraklionense KMRC 00136-81001
29 Proteus vulgaris NCCP14765 81 Mycobacterium intracellulare KMRC 00136-43007
30 Serratia marcescens NCCP14721 82 Mycobacterium kansasii KMRC 00136-20004
31 Sphingomonas paucimobilis NCCP 15635 83 Mycobacterium massiliense KMRC 00136-13017
32 Staphylococcus capitis NCCP 14664 84 Mycobacterium marinum KMRC 00136-21108
33 Staphylococcus caprae NCCP15629 85 Mycobacterium neoaurum KMRC 00136-18001
34 Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum NCCP15851 86 Mycobacterium peregrinum KMRC 00136-75003
35 Staphylococcus epidermidis NCCP14768 87 Mycobacterium phocaicum KMRC 00136-22005
36 Staphylococcus haemolyticus NCCP14692 88 Mycobacterium phlei KMRC 00136-19002
37 Staphylococcus warneri NCCP15692 89 Mycobacterium xenopi KMRC 00136-42003
38 Streptococcus intermedius NCCP15853 90 Mycobacterium tuberculosis L511P KMRC 00116-00009
39 Streptococcus anginosus NCCP14730 91 Mycobacterium tuberculosis D516V KMRC 00116-00021
40 Streptococcus pyogenes NCCP14783 92 Mycobacterium tuberculosis D516Y KMRC 00116-00001
41 Streptococcus suis NCCP15852 93 Mycobacterium tuberculosis S522L KMRC 00116-00112
42 Streptococcus parasanguinis CCARM4525 94 Mycobacterium tuberculosis H526D KMRC 00116-00043
43 Streptococcus oralis CCARM4546 95 Mycobacterium tuberculosis H526Y KMRC 00116-00032
44 Staphylococcus xylosus CCARM0086 96 Mycobacterium tuberculosis H526L KMRC 00116-00104
45 Corynebacterium glutamicum CCARM 0318 97 Mycobacterium tuberculosis H526R KMRC 00116-00191
46 Stenotrophomonas maltophilia NCCP14648 98 Mycobacterium tuberculosis S531L KMRC 00116-00017
47 Streptococcus gordonii NCCP15691 99 Mycobacterium tuberculosis S531W KMRC 00116-00189
48 Streptococcus lutetiensis NCCP16230 100 Mycobacterium tuberculosis L533P KMRC 00203-00046
49 Streptococcus mitis NCCP14733 101 Mycobacterium tuberculosis S315T(ACC) KMRC 00116-00039
50 Mycobacterium tuberculosis NCCP15986 102 Mycobacterium tuberculosis inhA-15 C>T KMRC 00116-00018
51 Mycobacterium avium NCCP15717 103 Helicobacter pylori ATCC 700392DQ
52 Mycobacterium gordonae NCCP15730
실시간 PCR을 위한 프라이머 설계 및 PCR 조건
1) 프라이머 및 프로브의 설계
마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 다음과 같이 설계하였다 (표 2 및 표 3).
올리고 믹스-1
프라이머명 Mer 서열 서열번호
MP P1 F1 21 CAATCTGGCGTGGATCTCTCC 1
MP P1 F2 21 ACCAATTCGGTGGACCTCTCC 2
MP P1 R 23 TATTAGTATTAGGCGCGAGGTTG 3
MP P1 P 25 CY5-TGGAGGAGGTGTTTCCGTCACTCGT-BHQ3 4
361 outer R 25 GATAACAGTTACCAATTAGAACAGC 5
2063G SNP F4 20 GTTAGGCGCAACGGGACGCG 6
2063G Probe P 28 FAM-TATTGATCAGGACATTATCATGTAGAGA-BHQ1 7
PCRC F 22 CTCTGCTGAACTATTGCCTGGC 8
PCRC R 22 GAATGCTGCGACTACGATCTGC 9
PCRC P 26 TEXAS RED-CAGCTGATATAGGGCCATCAACATTG-BHQ2 10
올리고 믹스-2
프라이머명 Mer 서열 서열번호
MP P1 F1 21 CAATCTGGCGTGGATCTCTCC 1
MP P1 F2 21 ACCAATTCGGTGGACCTCTCC 2
MP P1 R 23 TATTAGTATTAGGCGCGAGGTTG 3
MP P1 P 25 CY5-TGGAGGAGGTGTTTCCGTCACTCGT-BHQ3 4
361 outer R4 21 AGAAGGAGGTTAGCGCAAGCG 11
2064G SNP F4 21 AGTAAAGCTTCACGGGGTCGC 12
2064G Probe P 23 FAM-CCTGGATTTCACCGAGTCTATAG-BHQ1 13
PCRC F 22 CTCTGCTGAACTATTGCCTGGC 8
PCRC R 22 GAATGCTGCGACTACGATCTGC 9
PCRC P 26 TEXAS RED-CAGCTGATATAGGGCCATCAACATTG-BHQ2 10
2) PCR 혼합물의 제조 및 검사과정
검사 전 준비사항은 다음과 같았다: i) 냉동 또는 냉장 보관한 MP-MDR의 표준물질 및 간섭물질들을(15~25 ℃)에 두어 완전히 해동하고， 가볍게 흔들어 혼합, ii) 모든 시약 및 성능시험용 표준물질은 실험 시작 30 분 전에 상온(15-25 ℃)에 두고 시약은 가볍게 흔들어 균질화 후 사용, iii) 표준물질은 1 fg/μL(10 fg/rxn) 농도부터 1 ag/μL(10 ag/rxn)까지 10 배씩 희석하여 준비하였으며, 성능시험에는 10 ag/rxn, 100 ag/rxn, 1 fg/rxn, 10 fg/rxn를 사용, iv) 간섭물질을 이용한 실험의 경우，50 pg/μL의 표준물질을 가지고 실험하고자하는 최종농도의 간섭물질을 이용하여 10 배씩 희석하여 준비하였으며, 간섭물질의 성능시험에는 100 ag/rxn, 1 fg/rxn, 10 fg/rxn의 표준물질을 사용.
PCR 반응 수보다 1.1 배 증가시킨 배율로 계산하여， 표 4의 내용물 순서대로 시료를 1.5 ml 튜브에 담았다. 해당 반응액을 PCR 튜브 또는 96-웰 PCR 플플레이트에 15 μL씩 분주하였다. 준비된 템플레이트(template)를 5 μL씩 각 PCR 웰에 첨가하였다. PCR 수행조건(표 5)에 맞게 BIO-RAD CFX96 PCR를 세팅하고 PCR을 수행하였다(PCR 반응 용량은 20 μL로 세팅).
PCR 내용물 용량 (μL)
2X PCR Enzyme Mix 10
올리고 믹스-1 또는 올리고 믹스-2 5
템플레이트 5
총량 20
No. 단계 온도 시간 사이클
1 UDG 반응 50 ℃ 3 분 1
2 초기 PCR 활성화 95 ℃ 15 분 1
3 변성 95 ℃ 20 초 45
4 어닐링 & 연장 60 ℃ 30 초
6 최종 연장 72 ℃ 5 분 1
실시예 1: 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR의 검출 민감도 검증
본 발명에서 설계된 프라이머 및 프로브의 검출 민감도를 평가하기 위해 분양된 마이코플라스마 뉴모니아 표준물질과 합성된 플라스미드 DNA(A2063G, A2064G)를 사용하여 PCR 검사를 수행하였다.
검증 범위는 103 Copies/rxn부터 100 copy/rxn까지 10 배씩 단계별로 연속 희석하여 각 희석 구간별 20회 반복하여95% 이상 검출된 희석율을 최소검출한계(LOD, limit of detection)로 지정하였다. 본 발명의 목표 최소검출한계를 100-10 copies 설정하였으므로 마이코플라스마 뉴모니아, A2063G 및 A2064G의 목표 최소검출한계 희석구간의 검출률은 95% 이상을 만족해야 한다.
PCR 수행 결과 마이코플라스마 뉴모니아, A2063G 및A2064G 모두 101 구간에서 모두 100 %의 검출률을 확인하였으며 100에서는 각각 15%, 40% 및 50%의 검출률을 보였다. 이때 모든 타켓은 Ct 값 42 이하의 값을 보였다. 따라서 본 발명의 민감도 검출한계는 10 copies/rxn 이상으로 확인하였다(도 1 내지 도 3, 표 6 및 표 7).
희석구간별 검출률
표적 103 Copies/rxn 102 Copies/rxn 101 Copies/rxn 100 Copies/rxn
MP 100% (20/20) 100% (20/20) 100% (20/20) 15% (3/20)
A2063G 100% (20/20) 100% (20/20) 100% (20/20) 40% (8/20)
A2064G 100% (20/20) 100% (20/20) 100% (20/20) 50% (10/20)
[표 7]
검출목표별 결과 값
Figure 112021044717831-pat00001
실시예 2: 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR의 검출 특이도 검증
본 발명에서 설계된 프라이머 및 프로브의 검출 특이도를 평가하기 위해 분양된 마이코플라스마 뉴모니아 양성표준물질과 음성표준물질 102종을 이용하여 PCR을 수행하였다.
PCR 수행 결과 양성표준물질만이 검출되는 것을 확인하였으며, 음성표준물질에 대한 특이적 반응이 없음을 확인하였다(도 4 및 표 8).
검출 특이도 결과
No. 자원명 자원번호 시험 농도 검출 여부
MP A2063G A2064G
1 Streptococcus pneumoniae NCCP14585 10^3 / rxn N/D N/D N/D
2 Streptococcus pneumoniae NCCP14774 10^3 / rxn N/D N/D N/D
3 Legionella pneumophila NCCP16506 10^3 / rxn N/D N/D N/D
4 Legionella pneumophila NCCP16509 10^3 / rxn N/D N/D N/D
5 Bordetella pertussis NCCP13671 10^3 / rxn N/D N/D N/D
6 Haemophilus influenzae NCCP14785 10^3 / rxn N/D N/D N/D
7 Haemophilus influenzae NCCP14676 10^3 / rxn N/D N/D N/D
8 Mycoplasma pneumoniae ATCC qCRM-15531D 10^3 / rxn 29.88 N/D N/D
29.98 N/D N/D
9 Chlamydophila penumoniae ATCC 53592DQ 10^3 / rxn N/D N/D N/D
10 Moraxella catarrhalis CCARM 9004 10^3 / rxn N/D N/D N/D
11 Staphylococcus chromogenes KCTC 3579 10^3 / rxn N/D N/D N/D
12 Staphylococcus delphini KCTC 3592 10^3 / rxn N/D N/D N/D
13 Staphylococcus gallinarum KCTC 3585 10^3 / rxn N/D N/D N/D
14 Klebsiella pneumoniae NCCP14764 10^3 / rxn N/D N/D N/D
15 pseudomonas aeruginosa NCCP14640 10^3 / rxn N/D N/D N/D
16 Acinetobacter baumannii NCCP14607 10^3 / rxn N/D N/D N/D
17 Acinetobacter baumannii NCCP 14654 10^3 / rxn N/D N/D N/D
18 Staphylococcus aureus NCCP14647 10^3 / rxn N/D N/D N/D
19 Bacillus cereus NCCP14043 10^3 / rxn N/D N/D N/D
20 Bacillus subtilis NCCP16297 10^3 / rxn N/D N/D N/D
21 Campylobacter jejuni NCCP11192 10^3 / rxn N/D N/D N/D
22 Citrobacter freundii NCCP14611 10^3 / rxn N/D N/D N/D
23 Enterobacter aerogenes NCCP14761 10^3 / rxn N/D N/D N/D
24 Enterobacter cloacae NCCP14620 10^3 / rxn N/D N/D N/D
25 Enterococcus faecium NCCP14674 10^3 / rxn N/D N/D N/D
26 Klebsiella oxytoca NCCP14710 10^3 / rxn N/D N/D N/D
27 Propionibacterium acnes NCCP14784 10^3 / rxn N/D N/D N/D
28 Proteus mirabilis NCCP14683 10^3 / rxn N/D N/D N/D
29 Proteus vulgaris NCCP14765 10^3 / rxn N/D N/D N/D
30 Serratia marcescens NCCP14721 10^3 / rxn N/D N/D N/D
31 Sphingomonas paucimobilis NCCP 15635 10^3 / rxn N/D N/D N/D
32 Staphylococcus capitis NCCP 14664 10^3 / rxn N/D N/D N/D
33 Staphylococcus caprae NCCP15629 10^3 / rxn N/D N/D N/D
34 Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum NCCP15851 10^3 / rxn N/D N/D N/D
35 Staphylococcus epidermidis NCCP14768 10^3 / rxn N/D N/D N/D
36 Staphylococcus haemolyticus NCCP14692 10^3 / rxn N/D N/D N/D
37 Staphylococcus warneri NCCP15692 10^3 / rxn N/D N/D N/D
38 Streptococcus intermedius NCCP15853 10^3 / rxn N/D N/D N/D
39 Streptococcus anginosus NCCP14730 10^3 / rxn N/D N/D N/D
40 Streptococcus pyogenes NCCP14783 10^3 / rxn N/D N/D N/D
41 Streptococcus suis NCCP15852 10^3 / rxn N/D N/D N/D
42 Streptococcus parasanguinis CCARM4525 10^3 / rxn N/D N/D N/D
43 Streptococcus oralis CCARM4546 10^3 / rxn N/D N/D N/D
44 Staphylococcus xylosus CCARM0086 10^3 / rxn N/D N/D N/D
45 Corynebacterium glutamicum CCARM 0318 10^3 / rxn N/D N/D N/D
46 Stenotrophomonas maltophilia NCCP14648 10^3 / rxn N/D N/D N/D
47 Streptococcus gordonii NCCP15691 10^3 / rxn N/D N/D N/D
48 Streptococcus lutetiensis NCCP16230 10^3 / rxn N/D N/D N/D
49 Streptococcus mitis NCCP14733 10^3 / rxn N/D N/D N/D
50 Mycobacterium tuberculosis NCCP15986 10^3 / rxn N/D N/D N/D
51 Mycobacterium avium NCCP15717 10^3 / rxn N/D N/D N/D
52 Mycobacterium gordonae NCCP15730 10^3 / rxn N/D N/D N/D
53 Mycobacterium kansasii NCCP15672 10^3 / rxn N/D N/D N/D
54 Corynebacterium ammoniagenes KCTC1018 10^3 / rxn N/D N/D N/D
55 Staphylococcus arlettae KCTC 3588 10^3 / rxn N/D N/D N/D
56 Staphylococcus equorum subsp. equorum KCTC 3589 10^3 / rxn N/D N/D N/D
57 Staphylococcus kloosii KCTC 3590 10^3 / rxn N/D N/D N/D
58 Staphylococcus pasteuri KCTC 13167 10^3 / rxn N/D N/D N/D
59 Streptococcus alactolyticus KCTC3644 10^3 / rxn N/D N/D N/D
60 Streptococcus criceti KCTC 3292 10^3 / rxn N/D N/D N/D
61 Streptococcus downei KCTC 3634 10^3 / rxn N/D N/D N/D
62 Streptococcus ferus KCTC 3637 10^3 / rxn N/D N/D N/D
63 Streptococcus gallinaceus KCTC 3876 10^3 / rxn N/D N/D N/D
64 Streptococcus hyointestinalis KCTC 3660 10^3 / rxn N/D N/D N/D
65 Streptococcus vestibularis KCTC 3650 10^3 / rxn N/D N/D N/D
66 Streptococcus macacae KCTC3659 10^3 / rxn N/D N/D N/D
67 Streptococcus parauberis KCTC3651 10^3 / rxn N/D N/D N/D
68 Mycobacterium tuberculosis KMRC 00110-00001 10^3 / rxn N/D N/D N/D
69 Mycobacterium abscessus KMRC 00136-61038 10^3 / rxn N/D N/D N/D
70 Mycobacterium arupense KMRC 00136-15004 10^3 / rxn N/D N/D N/D
71 Mycobacterium aubagnense KMRC 00136-72001 10^3 / rxn N/D N/D N/D
72 Mycobacterium avium KMRC 00136-41014 10^3 / rxn N/D N/D N/D
73 Mycobacterium bolletii KMRC 00136-52005 10^3 / rxn N/D N/D N/D
74 Mycobacterium colombiense KMRC 00136-86001 10^3 / rxn N/D N/D N/D
75 Mycobacterium conceptionense KMRC 00136-79001 10^3 / rxn N/D N/D N/D
76 Mycobacterium chitae KMRC 00136-80001 10^3 / rxn N/D N/D N/D
77 Mycobacterium fortuitum KMRC 00136-60003 10^3 / rxn N/D N/D N/D
78 Mycobacterium gordonae KMRC 00136-32003 10^3 / rxn N/D N/D N/D
79 Mycobacterium goodii KMRC 00136-28002 10^3 / rxn N/D N/D N/D
80 Mycobacterium heraklionense KMRC 00136-81001 10^3 / rxn N/D N/D N/D
81 Mycobacterium intracellulare KMRC 00136-43007 10^3 / rxn N/D N/D N/D
82 Mycobacterium kansasii KMRC 00136-20004 10^3 / rxn N/D N/D N/D
83 Mycobacterium massiliense KMRC 00136-13017 10^3 / rxn N/D N/D N/D
84 Mycobacterium marinum KMRC 00136-21108 10^3 / rxn N/D N/D N/D
85 Mycobacterium neoaurum KMRC 00136-18001 10^3 / rxn N/D N/D N/D
86 Mycobacterium peregrinum KMRC 00136-75003 10^3 / rxn N/D N/D N/D
87 Mycobacterium phocaicum KMRC 00136-22005 10^3 / rxn N/D N/D N/D
88 Mycobacterium phlei KMRC 00136-19002 10^3 / rxn N/D N/D N/D
89 Mycobacterium xenopi KMRC 00136-42003 10^3 / rxn N/D N/D N/D
90 Mycobacterium tuberculosis L511P KMRC 00116-00009 10^3 / rxn N/D N/D N/D
91 Mycobacterium tuberculosis D516V KMRC 00116-00021 10^3 / rxn N/D N/D N/D
92 Mycobacterium tuberculosis D516Y KMRC 00116-00001 10^3 / rxn N/D N/D N/D
93 Mycobacterium tuberculosis S522L KMRC 00116-00112 10^3 / rxn N/D N/D N/D
94 Mycobacterium tuberculosis H526D KMRC 00116-00043 10^3 / rxn N/D N/D N/D
95 Mycobacterium tuberculosis H526Y KMRC 00116-00032 10^3 / rxn N/D N/D N/D
96 Mycobacterium tuberculosis H526L KMRC 00116-00104 10^3 / rxn N/D N/D N/D
97 Mycobacterium tuberculosis H526R KMRC 00116-00191 10^3 / rxn N/D N/D N/D
98 Mycobacterium tuberculosis S531L KMRC 00116-00017 10^3 / rxn N/D N/D N/D
99 Mycobacterium tuberculosis S531W KMRC 00116-00189 10^3 / rxn N/D N/D N/D
100 Mycobacterium tuberculosis L533P KMRC 00203-00046 10^3 / rxn N/D N/D N/D
101 Mycobacterium tuberculosis S315T(ACC) KMRC 00116-00039 10^3 / rxn N/D N/D N/D
102 Mycobacterium tuberculosis inhA-15 C>T KMRC 00116-00018 10^3 / rxn N/D N/D N/D
103 Helicobacter pylori ATCC 700392DQ 10^3 / rxn N/D N/D N/D
실시예 3: 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR의 분석적 특이도 검증
본 발명에서 설계된 프라이머 및 프로브가 간섭반응을 일으키지 않음을 검증하기 위해 간섭물질의 존재 하에 양성표준물질(MP, A2063G, A2064G)을 대상으로 PCR을 수행하였다.
간섭물질은 CLSI 가이드라인을 참고하여 선정하였으며(Hemoglobin, Bilirubin, Immunoglobulin G, BSA, Collagen, Clarithromycin, Amoxicillin)(표 9), 제시한 간섭물질 농도 범위 내에서 최소검출한계(LOD)인 10 copies에서 양성표준물질의 검출여부를 평가하였다.
실험을 통해, 간섭물질 7종 (Hemoglobin, Bilirubin, Immunoglobulin G, Glucose, BSA, Clarithromycin, Amoxicillin)을 포함한 상태에서의 각 검출목표 양성표준물질(10 copies/rxn: 최소검출한계)로 검출확인한 결과, 간섭물질에 의한 측정값에 큰 차이가 없는 것을 확인하였다. 따라서 간섭물질 7종의 간섭효과는 매우 미미함을 증명하였다 (도 5 및 표 10).
No. 간섭물질 간섭물질
유래		 고농도 저농도
1 Hemoglobin 혈액 2.5ug/rxn 0.15ug/rxn
2 Bilirubin 혈액 40μM 17μM
3 Immunoglobulin G (IgG) 혈액 4.1ug/ml 0.1ug/ml
4 BSA 조직 5% 3.5%
5 Glucose 조직 0.12% 0.08%
6 Clarithromycin 항생제 10ug/ml 0.2ug/ml
7 Amoxicillin 항생제 20ug/ml 0.4ug/ml
간섭반응 결과
No. 간섭물질 농도.(rxn) 표적 검출 값(Ct 값)
1반복 2반복 3반복
1 Control (Non spiking) 0 MP 35.28 34.40 35.94
A2063G 38.24 36.36 38.87
A2064G 38.62 37.74 39.25
2 Hemoglobin 0.15 ug MP 35.62 35.12 35.63
A2063G 38.52 37.90 38.59
A2064G 38.90 38.28 38.97
2.5 ug MP 34.34 35.06 35.32
A2063G 37.30 38.02 38.28
A2064G 37.68 38.40 38.66
3 Bilirubin 17 μM MP 35.19 35.42 34.83
A2063G 37.93 36.94 38.79
A2064G 38.31 37.32 39.17
40 μM MP 35.23 34.80 34.26
A2063G 37.72 38.76 37.22
A2064G 38.10 39.14 37.60
4 Immunoglobulin G (IgG) 0.1 ug/ml MP 35.16 34.93 35.50
A2063G 37.52 36.94 38.46
A2064G 37.90 37.32 38.84
0.41 ug/ml MP 35.99 35.50 35.08
A2063G 37.84 37.42 37.85
A2064G 38.22 37.80 37.66
5 BSA 3.50% MP 34.40 35.94 36.90
A2063G 36.36 38.87 38.52
A2064G 36.74 39.25 38.90
5% MP 35.12 35.63 34.34
A2063G 37.90 38.59 37.30
A2064G 38.28 38.97 37.68
6 Glucose 0.08% MP 35.06 35.32 35.19
A2063G 38.02 38.28 37.93
A2064G 38.40 38.66 38.31
0.12% MP 35.42 35.83 35.23
A2063G 36.94 38.79 37.72
A2064G 37.32 39.17 38.10
7 Clarithromycin 0.2 ug/ml MP 35.80 34.26 35.16
A2063G 38.76 37.22 37.52
A2064G 39.14 37.60 37.90
0.4 ug/ml MP 35.93 35.50 35.99
A2063G 36.94 38.46 37.84
A2064G 37.32 38.84 38.22
8 Amoxicillin 0.4 ug/ml MP 35.50 35.32 35.19
A2063G 37.42 37.85 38.28
A2064G 37.80 35.66 37.90
20 ug/ml MP 35.42 34.83 35.23
A2063G 34.85 38.76 37.90
A2064G 38.40 37.32 38.28
실시예 4: 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR의 정밀도 검증
본 발명에서 설계된 프라이머 및 프로브의 정밀도를 검증하기 위해 검출대상을 10X LOD, 3X LOD 및 1X LOD로 희석하여 3회 반복실험을 진행하고(표 11) 3 인의 실험자(표 12), 3 개의 실험장소(표 13) 또는 3 개의 실험장비(표 14)에서 2 회 반복실험을 진행하여 제품의 정밀도를 검증하였으며 각 실험구간별 표준편차가 오차범위 1.000 미만, %CV 5 % 미만을 기준으로 하였다.
실험결과, 각 실험구간별 표준편차가 오차범위 1.000 미만， %CV 5 % 미만을 기준을 만족하여, 본 발명의 정밀도가 높음을 검증하였다(도 6 내지 도 9, 및 표 11 내지 표 14).
표적 농도 완제품(LOT)간 정밀도
검출률(%) Ct value 분석결과
LOT 1 LOT 2 LOT 3 AVG SD %CV
MP 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 31.92 0.54 1.68
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 33.24 0.65 1.96
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.93 0.85 2.31
A2063G 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 34.79 0.34 0.98
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.48 0.89 2.43
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 38.87 0.64 1.64
A2064G 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 35.01 0.34 0.97
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.59 0.41 1.13
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 39.24 0.92 2.35
표적 농도 실험실 분석결과
검출률(%) Ct value 분석결과
실험실 1 실험실 2 실험실 3 AVG SD %CV
MP 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 31.92 0.54 1.68
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 33.24 0.65 1.96
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.93 0.85 2.31
A2063G 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 34.79 0.34 0.98
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.48 0.89 2.43
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 38.87 0.64 1.64
A2064G 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 35.01 0.34 0.97
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.59 0.41 1.13
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 39.24 0.92 2.35
표적 농도 시험자간 분석결과
검출률(%) Ct value 분석결과
시험자 1 시험자 2 시험자 3 AVG SD %CV
MP 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 31.87 0.52 1.62
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 33.13 0.65 1.96
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.83 0.93 2.54
A2063G 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 34.79 0.36 1.05
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.44 1.01 2.77
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 38.86 0.67 1.71
A2064G 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 35.02 0.37 1.05
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.60 0.43 1.17
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 39.20 0.91 2.33
표적 농도 분석결과
검출률(%) Ct value 분석결과
장비A 장비B 장비C AVG SD %CV
MP 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 31.89 0.53 1.67
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 33.22 0.65 1.95
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.87 0.87 2.37
A2063G 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 34.77 0.35 1.02
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.45 0.94 1.95
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 38.86 0.66 1.69
A2064G 10 x LOD 100.0 100.0 100.0 35.00 0.36 1.02
3 x LOD 100.0 100.0 100.0 36.61 0.42 1.15
1 x LOD 100.0 100.0 100.0 39.21 0.94 2.39
결론적으로, 본 발명의 프라이머 및 프로브는 i) 마이코플라스마 뉴모니아, A2063G 및 A2064G의 101 Copies/rxn 구간에서 100 %의 검출률을 나타냈으며, 100 Copies/rxn 구간에서 15 %, 40 % 및 50 %의 검출률을 나타내었고, ii) 양성표준물질을 제외한 모든 음성표준물질(102 종)에서 특이적 반응을 나타내지 않았으며, iii) 7종의 간섭물질(Hemoglobin, Bilirubin, Immunoglobulin G, BSA, Collagen, Clarithromycin, Amoxicillin)에 의한 간섭효과가 미미하였고, iv) 다양한 실험조건에서도 정밀도가 높게 나타났다.
<110> EONE Life Science Institute <120> Kits for Detecting Macrolide drug Resistant Mycoplasma pneumoniae <130> PN210159 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP P1 F1 primer <400> 1 caatctggcg tggatctctc c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP P1 F2 primer <400> 2 accaattcgg tggacctctc c 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP P1 R primer <400> 3 tattagtatt aggcgcgagg ttg 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP P1 P probe <400> 4 tggaggaggt gtttccgtca ctcgt 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 361 outer R primer <400> 5 gataacagtt accaattaga acagc 25 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2063G SNP F4 primer <400> 6 gttaggcgca acgggacgcg 20 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2063G Probe P probe <400> 7 tattgatcag gacattatca tgtagaga 28 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCRC F primer <400> 8 ctctgctgaa ctattgcctg gc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCRC R primer <400> 9 gaatgctgcg actacgatct gc 22 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCRC P probe <400> 10 cagctgatat agggccatca acattg 26 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 361 outer R4 primer <400> 11 agaaggaggt tagcgcaagc g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2064G SNP F4 primer <400> 12 agtaaagctt cacggggtcg c 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2064G Probe P probe <400> 13 cctggatttc accgagtcta tag 23

Claims (14)

  1. (i) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 프라이머 조합; 및
    (ii) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아 23S rRNA의 돌연변이 검출용 제1 프라이머 조합, 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아 23S rRNA의 돌연변이 검출용 제2 프라이머 조합을 포함하는 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 프라이머 조합 및 마이코플라스마 뉴모니아 23S rRNA의 돌연변이 검출용 프라이머 조합은 실시간 PCR용 프라이머 조합인 것인, 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 하기의 프로브를 추가적으로 포함하는 것인, 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 조성물:
    (i) 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 프라이머 조합은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브; 또는
    (ii) 상기 마이코플라스마 뉴모니아 23S rRNA의 돌연변이 검출용 제1 프라이머 조합은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브, 또는 상기 마이코플라스마 뉴모니아 23S rRNA의 돌연변이 검출용 제2 프라이머 조합은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브.
  4. 제3항에 있어서, 상기 서열번호 4, 7 및 13의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM, TET, HEX, JOE, ROX, TMR, Cy5 및 Cal Red 610로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되고, 3'-말단은 BHQ-1, BHQ-2 또는 BHQ-3의 퀀처(quencher)로 변형된 것인, 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시되는 것인, 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것인, 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트.
  8. 제6항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것인, 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 키트.
  9. 다음의 단계를 포함하는 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아의 검출 방법:
    (a) 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계;
    (b) (i) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 프라이머 조합; 및
    (ii) 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아 23S rRNA의 돌연변이 검출용 제1 프라이머 조합, 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 마이코플라스마 뉴모니아 23S rRNA의 돌연변이 검출용 제2 프라이머 조합을 포함하는 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 조성물을 이용하여 상기 검체시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 검출용 조성물은 하기의 프로브를 추가적으로 포함하는 것인, 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아의 검출 방법:
    (i) 마이코플라스마 뉴모니아 검출용 프라이머 조합은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브; 또는
    (ii) 상기 마이코플라스마 뉴모니아 23S rRNA의 돌연변이 검출용 제1 프라이머 조합은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브, 또는 상기 마이코플라스마 뉴모니아 23S rRNA의 돌연변이 검출용 제2 프라이머 조합은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로브.
  11. 제9항에 있어서, 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것인, 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아의 검출 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것인, 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아의 검출 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 실시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것인, 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아의 검출 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 프로브는 표지가 결합되어 있고, 상기 단계 (c)의 확인은 상기 프로브로부터 발생되는 시그널을 검출하여 실시하는 것인, 마크로라이드계 항생제 내성 마이코플라스마 뉴모니아의 검출 방법.
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