KR101380414B1 - 다중 호흡기 바이러스의 동시 검출 방법, 및 이의 용도 - Google Patents

다중 호흡기 바이러스의 동시 검출 방법, 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다양한 프라이머 및 프로브를 이용하여 타겟 유전자들을 증폭시켜 다중 호흡기 바이러스를 동시에 특이적으로 검출하는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 타겟 유전자(구체적으로는, 리노바이러스의 5'-UTR, 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 유전자, 메타뉴모바이러스의 F 유전자, 파라인플루엔자의 HN 당단백질 유전자, RSV의 접촉 G 유전자, 엔테로바이러스의 5'-UTR, 보카바이러스의 NS1 유전자, 아데노바이러스의 헥손 단백질 유전자 또는 코로나바이러스의 레플리카제 폴리단백질 1b 유전자)-특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 이용한 멀티플렉스 실-시간 PCR(multiplex real-time polymerase chain reaction)을 통해 다중 호흡기 바이러스를 매우 높은 효율로 선택적으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 시료 내 타겟 유전자들을 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 다양한 호흡기 바이러스들의 시료 내 감염 여부를 선택적으로 용이하게 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 치료에 적용될 수 있다.

Description

다중 호흡기 바이러스의 동시 검출 방법, 및 이의 용도{Methods for Simultaneously Detecting Multiple Respiratory Viruses and Uses Thereof}
본 발명은 다중 호흡기 바이러스의 동시 검출 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
바이러스에 의한 급성 호흡기 감염증은 노약자, 면역기능저하환자, 신생아 및 미숙아에서 높은 이환율과 사망률을 보인다. 호흡기 바이러스는 전염력이 매우 높아 단기간에 폭발적으로 전파될 수 있기 때문에, 호흡기 바이러스의 감염을 조기에 진단하는 것이 매우 중요한 문제이다.
호흡기 바이러스에 대한 진단방법은 전통적인 바이러스 배양법, 면역형광염색법, 신속항원검출법, 핵산증폭법 등이 알려져 있다. 상기 바이러스 배양법은 민감도와 특이도가 높지 않고 검사결과를 얻기까지 오랜 시간(예컨대, 바이러스 배양은 2-14일의 시간이 소요됨)이 걸린다. 또한, 면역형광법은 수시간 이내에 결과를 확인할 수 있고 동시에 다중 바이러스를 동정할 수 있다는 장점이 있으나, 숙련된 검사자가 필요하고 재현성이 다소 떨어진다는 단점이 있다. RSV(respiratory syncytial virus) 또는 인플루엔자 바이러스의 동정을 위해 개발된 신속항원검출법은 빠른 시간(약 15-30분) 안에 검사결과를 알 수 있다는 장점이 있지만, 민감도(약 40-95%) 및 음성예측도(약 70-90%)가 낮아서 추가적인 검사를 필요로 한다는 단점을 가진다.
이에 반해, 핵산증폭검사법은 다양한 호흡기 바이러스를 신속하게 검출할 수 있는 장점 때문에 최근에 병원검사실에서 주로 사용된다. 특히, 바이러스 배양법과 항원 검출법에 비해 민감도와 특이도가 우수하다. 핵산증폭검사법으로는 PCR(polymerase chain reaction) 방법이 가장 많이 이용되고 있다. 최근에는, 증폭반응 후 전기영동이 필요하지 않아 오염가능성이 낮고 수행 상의 부담이 적은 실-시간(real-time) PCR 방법이 선호되고 있지만, 보다 정확하고 효율적으로 호흡기 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트 및/또는 프로브 및 이를 이용한 신속하고 정확한 호흡기 바이러스 동시 검출 방법이 당업계에서 시급히 요구되고 있는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 호흡기 바이러스 감염을 간편하고 효율적으로 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트를 제작하여 멀티플렉스 실-시간 PCR을 실시함으로써 시료(예를 들어, 임상검체로부터 유래된 DNA 시료)로부터 최소 2종의 호흡기 바이러스를 특이적이고 간단하게 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 호흡기 바이러스 동시 검출방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 호흡기 바이러스 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 동시 검출방법을 제공한다: (a) 시료를 준비하는 단계; (b) (i) 리노바이러스(Rhinovirus) 검출 세트, 인플루엔자(Influenza) 바이러스 검출 세트, 메타뉴모바이러스(metapneumovirus) 검출 세트, 파라인플루엔자 (parainfluenza) 바이러스 검출 세트, RSV(respiratory syncytial virus) 검출 세트, 엔테로바이러스(Enterovirus) 검출 세트, 보카바이러스(Bocavirus) 검출 세트, 아데노바이러스 검출 세트 및 코로나바이러스(Coronavirus) 검출 세트로 구성된 군으로부터 최소 2종의 검출 세트를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; 및 (ii) 서열목록 제56서열 및 서열목록 제57서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제58서열의 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 리노바이러스(Rhinovirus) 검출 세트, 인플루엔자(Influenza) 바이러스 검출 세트, 메타뉴모바이러스(metapneumovirus) 검출 세트, 파라인플루엔자 (parainfluenza) 바이러스 검출 세트, RSV(respiratory syncytial virus) 검출 세트, 엔테로바이러스(Enterovirus) 검출 세트, 보카바이러스(Bocavirus) 검출 세트, 아데노바이러스 검출 세트 및 코로나바이러스(Coronavirus) 검출 세트로 구성된 군으로부터 최소 2종의 검출 세트를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; 및 (ii) 서열목록 제56서열 및 서열목록 제57서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제58서열의 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 호흡기 바이러스 감염을 간편하고 효율적으로 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트를 제작하여 멀티플렉스 실-시간 PCR을 실시함으로써 시료(예를 들어, 임상검체로부터 유래된 DNA 시료)로부터 최소 2종의 호흡기 바이러스를 특이적이고 간단하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 방법은 시료 내에서 다중 호흡기 바이러스를 단일 튜브 내에서 매우 효과적이고 간편하게 검출할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현 예에 따르면, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 본 발명의 어떤 구현 예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.
본 명세서에 기재된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR; 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 및 제4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR; Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification, TMA; WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication; WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences; 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction, CP-PCR; 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR; 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA; 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 멀티플렉스 PCR, 실-시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 방법이 프라이머를 이용하여 실시되는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상(예컨대, 임상검체-유래된 시료)에서 타겟 유전자들을 동시에 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 시료에서 추출한 DNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
본 발명의 어떤 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 시료는 임상검체-유래된 시료로, 상기 임상검체는 객담, 타액, 혈액 및 소변을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
시료에서 DNA를 추출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)).
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow)" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
이렇게 증폭된 타겟 유전자(예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 유전자, 메타뉴모바이러스의 F 유전자, 보카바이러스의 NS1 유전자, 등)를 적합한 방법으로 분석하여 다양한 호흡기 바이러스를 동시에 특이적으로 검출하는 것이다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 타겟 유전자를 검출할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 DNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에 있어서 (i) 리노바이러스 검출 세트, 인플루엔자 A 검출 세트, 인플루엔자 B 검출 세트 및 메타뉴모바이러스 검출 세트를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 형광을 통해 분석하는 단계를 포함하며 이를 통해 시료로부터 추출한 DNA에서 상기 4종의 호흡기 바이러스를 동시에 효과적이고 간편하게 검출 또는 정량할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 호흡기 바이러스는 리노바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 메타뉴모바이러스, 파라인플루엔자 제1형, 파라인플루엔자 제2형, 파라인플루엔자 제3형, 파라인플루엔자 제4형, RSV A, RSV B, 엔테로바이러스, 보카바이러스, 아데노바이러스 1, 아데노바이러스 2, 코로나바이러스 229E/NL63 및 코로나바이러스 OC43/HKU1을 포함한다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 동시에 검출될 수 있는 다중 호흡기 바이러스는 (i) 리노바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 및 메타뉴모바이러스; (ii) 파라인플루엔자 제1형, 파라인플루엔자 제2형, 파라인플루엔자 제3형 및 파라인플루엔자 제4형; (iii) RSV A, RSV B, 엔테로바이러스 및 보카바이러스; 또는 (iv) 아데노바이러스 1, 아데노바이러스 2, 코로나바이러스 229E/NL63 및 코로나바이러스 OC43/HKU1으로 구성된 군으로부터 선택된 4종의 호흡기 바이러스를 포함하지만, 상기 조합만으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법을 통해 검출될 수 있는 호흡기 바이러스의 감염에 의해 유발될 수 있는 바이러스-감염 호흡기 질환은 코감기, 천식, 알러지성 및 계절성 비염, 인두염, 위막성 후두염(croup), 후두염의 상기도 감염과 이로 인한 부비동염, 중이염 합병증, 기관지염, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 폐기종(emphysema), 폐렴, 폐렴의 하기도 감염에 의한 호흡기 질환 및 염증성 기도 질환을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화(hybridization)"는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 다양한 호흡기 바이러스를 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트에서 이용될 수 있는 다중 호흡기 바이러스 검출 세트는 리노바이러스 검출 세트, 인플루엔자 A 바이러스 검출 세트, 인플루엔자 B 바이러스 검출 세트, 메타뉴모바이러스 검출 세트, 파라인플루엔자 제1형(parainfluenza type 1) 바이러스 검출 세트, 파라인플루엔자 제2형 바이러스 검출 세트, 파라인플루엔자 제3형 바이러스 검출 세트, 파라인플루엔자 제4형 바이러스 검출 세트, RSV(respiratory syncytial virus) A 검출 세트, RSV B 검출 세트, 엔테로바이러스 검출 세트, 보카바이러스 검출 세트, 아데노바이러스 1 검출 세트, 아데노바이러스 2 검출 세트, 코로나바이러스 229E/NL63 검출 세트 및 코로나바이러스 OC43/HKU1 검출 세트로 구성된 군으로부터 선택된 최소 2종의 다중 호흡기 바이러스 검출 세트, 보다 구체적으로는 최소 3종의 다중 호흡기 바이러스 검출 세트, 그리고 가장 구체적으로는 최소 4종의 다중 호흡기 바이러스 검출 세트를 포함한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 (i) 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제4서열의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제5서열의 프로브로 이루어진 리노바이러스 검출 세트; 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제8서열 및 서열목록 제9서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 인플루엔자 A 검출 세트; 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 인플루엔자 B 검출 세트; 및 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제15서열의 프로브로 이루어진 메타뉴모바이러스 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; (ii) 서열목록 제16서열 및 서열목록 제17서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제18서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 1 검출 세트; 서열목록 제19서열 및 서열목록 제20서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제21서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 2 검출 세트; 서열목록 제22서열 및 서열목록 제23서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제24서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 3 검출 세트; 및 서열목록 제25서열 및 서열목록 제26서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제27서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 4 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; (iii) 서열목록 제28서열 및 서열목록 제29서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제30서열의 프로브로 이루어진 RSV A 검출 세트; 서열목록 제31서열 및 서열목록 제32서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제33서열의 프로브로 이루어진 RSV B 검출 세트; 서열목록 제34서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제35서열 및 서열목록 제36서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제37서열의 프로브로 이루어진 엔테로바이러스 검출 세트; 및 서열목록 제38서열 및 서열목록 제39서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제40서열의 프로브로 이루어진 보카바이러스 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; 또는 (iv) 서열목록 제41서열 및 서열목록 제42서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제43서열의 프로브로 이루어진 아데노바이러스 1 검출 세트; 서열목록 제44서열 및 서열목록 제45서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제46서열의 프로브로 이루어진 아데노바이러스 2 검출 세트; 서열목록 제47서열 및 서열목록 제48서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제49서열 및 서열목록 제50서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제51서열의 프로브로 이루어진 코로나바이러스 229E/NL63 검출 세트; 및 서열목록 제52서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제53서열 및 서열목록 제54서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제55서열의 프로브로 이루어진 코로나바이러스 OC43/HKU1 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트를 포함한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트에서 이용되는 타겟 유전자는 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제4서열의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제5서열의 프로브에 의해 검출되는 리노바이러스의 5'-UTR(untranslated region); 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제8서열 및 서열목록 제9서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브, 또는 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브에 의해 검출되는 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 유전자; 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제15서열의 프로브에 의해 검출되는 메타뉴모바이러스의 F 유전자; 서열목록 제16서열 및 서열목록 제17서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제18서열의 프로브, 서열목록 제19서열 및 서열목록 제20서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제21서열의 프로브, 서열목록 제22서열 및 서열목록 제23서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제24서열의 프로브, 또는 서열목록 제25서열 및 서열목록 제26서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제27서열의 프로브에 의해 검출되는 파라인플루엔자의 HN(hemagglutinin-neuraminidase) 당단백질 유전자; 서열목록 제28서열 및 서열목록 제29서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제30서열의 프로브, 또는 서열목록 제31서열 및 서열목록 제32서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제33서열의 프로브에 의해 검출되는 RSV의 접촉 G 유전자; 서열목록 제34서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제35서열 및 서열목록 제36서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제37서열의 프로브에 의해 검출되는 엔테로바이러스의 5'-UTR; 서열목록 제38서열 및 서열목록 제39서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제40서열의 프로브에 의해 검출되는 보카바이러스의 NS1 유전자; 및 서열목록 제41서열 및 서열목록 제42서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제43서열의 프로브, 또는 서열목록 제44서열 및 서열목록 제45서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제46서열의 프로브에 의해 검출되는 아데노바이러스의 헥손(hexon) 단백질 유전자; 서열목록 제47서열 및 서열목록 제48서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제49서열 및 서열목록 제50서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제51서열의 프로브, 또는 서열목록 제52서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제53서열 및 서열목록 제54서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제55서열의 프로브에 의해 검출되는 코로나바이러스의 레플리카제 폴리단백질(replicase polyprotein) 1b 유전자를 포함한다.
실-시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실-시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 C t 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실-시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실-시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실-시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 C t 값이 산출된다.
실-시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.
먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실-시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat., Vol 23(5): 513-521(2004)).
C t (cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 C t 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. C t 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. C t 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. C t 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(http://www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 구체적으로는, TaqMan 프로브는 본원발명의 타겟 유전자 절편 또는 바이러스 게놈 절편(예를 들어, 리노바이러스의 5'-UTR, 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 유전자, 메타뉴모바이러스의 F 유전자, 파라인플루엔자의 HN 당단백질 유전자, RSV의 접촉 G 유전자, 엔테로바이러스의 5'-UTR, 보카바이러스의 NS1 유전자, 아데노바이러스의 헥손 단백질 유전자 또는 코로나바이러스의 레플리카제 폴리단백질 1b 유전자)의 내부서열로 고안될 수 있다.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM (506), YO-PROTM-1 (509), YOYOTM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorXTM (519), AlexaTM (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon GreenTM 500 (522), Oregon GreenTM 488 (524), RiboGreenTM (525), Rhodamine GreenTM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium GreenTM (531), Calcium GreenTM (533), TO-PROTM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3TM (570), AlexaTM 546 (570), TRITC (572), Magnesium OrangeTM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium OrangeTM (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine RedTM (590), Cy3.5TM (596), ROX (608), Calcium CrimsonTM (615), AlexaTM 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PROTM-3 (631), YOYOTM-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PROTM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5TM (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC (546), BHQ-1 (534), BHQ-2 (579), BHQ-3 (672), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 Cy5, ROX, HEX, FAM, BHQ-1, BHQ-2 또는 Cy5.5-기반 표지를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 5'-말단은 Cy5, ROX, HEX, FAM 및 Cy5.5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되며, 3'-말단은 BHQ-1 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 퀀처(quencher)로 변형될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 타겟 핵산은 특별하게 제한되지 않으며, DNA(gDNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자를 모두 포함하며, 보다 구체적으로는 cDNA이다. 타겟 핵산이 RNA 분자인 경우에는 cDNA로 역전사 하여 사용한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 핵산은 임상검체로부터 유래된 핵산 시료를 포함하고, 보다 구체적으로는 임상검체로부터 유래된 바이러스 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 타겟 핵산을 연장 프라이머 및 프로브에 어닐링 또는 혼성화 시키는 방법은 당업계에 공지된 혼성화 방법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 반응 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 5' to 3' 뉴클레아제 활성을 가지는 효소이다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 바람직하게는 DNA 중합효소이다. 통상적으로 DNA 중합효소들은 5' to 3' 뉴클레아제 활성을 가지고 있다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 주형-의존성 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함한다.
주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 촉매되는 주형-의존성 연장반응은 주형의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 합성하는 반응을 의미한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 다양한 프라이머 및 프로브를 이용하여 타겟 유전자들을 증폭시켜 다중 호흡기 바이러스를 동시에 특이적으로 검출하는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 방법은 타겟 유전자(구체적으로는, 리노바이러스의 5'-UTR, 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 유전자, 메타뉴모바이러스의 F 유전자, 파라인플루엔자의 HN 당단백질 유전자, RSV의 접촉 G 유전자, 엔테로바이러스의 5'-UTR, 보카바이러스의 NS1 유전자, 아데노바이러스의 헥손 단백질 유전자 또는 코로나바이러스의 레플리카제 폴리단백질 1b 유전자)-특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 이용한 멀티플렉스 실-시간 PCR(multiplex real-time polymerase chain reaction)을 통해 다중 호흡기 바이러스를 매우 높은 효율로 선택적으로 검출할 수 있다.
(c) 또한, 본 발명의 키트는 시료 내 타겟 유전자들을 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다.
(d) 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 다양한 호흡기 바이러스들의 시료 내 감염 여부를 선택적으로 용이하게 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 치료에 적용될 수 있다.
도 1a-1e는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 검출된 호흡기 바이러스의 형광 결과이다. Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기(Norm. Fluoro.)를 나타낸다. 도 1a 내지 1e는 각각 진홍채널(내적 대조군, 인간 베타-액틴), 빨강채널(리노바이러스), 주황채널(인플루엔자 A), 노랑채널(인플루엔자 B) 및 녹색채널(메타뉴모바이러스)을 보여주는 결과이다.
도 2a-2e는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 검출된 호흡기 바이러스의 형광 결과이다. Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기를 나타낸다. 도 2a 내지 2e는 각각 진홍채널(내적 대조군, 인간 베타-액틴), 빨강채널(파라인플루엔자 제1형), 주황채널(파라인플루엔자 제3형), 노랑채널(파라인플루엔자 제2형) 및 녹색채널(파라인플루엔자 제4형)을 보여주는 결과이다.
도 3a-3e는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 검출된 호흡기 바이러스의 형광 결과이다. Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기를 나타낸다. 도 3a 내지 3e는 각각 진홍채널(내적 대조군, 인간 베타-액틴), 빨강채널(RSV A), 주황채널(RSV B), 노랑채널(엔테로바이러스) 및 녹색채널(보카바이러스)을 보여주는 결과이다.
도 4a-4e는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 검출된 호흡기 바이러스의 형광 결과이다. Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기를 나타낸다. 도 4a 내지 4e는 각각 진홍채널(내적 대조군, 인간 베타-액틴), 빨강채널(아데노바이러스 1), 주황채널(아데노바이러스 1), 노랑채널(코로나바이러스 OC43/HKU1) 및 녹색채널(코로나바이러스 229E/NL63)을 보여주는 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
핵산의 분리
본 발명은 임상 검체에서 분리된 100주의 바이러스 및 44주의 표준 바이러스(표 1)로부터 추출된 핵산 분자를 이용하였다. 바이러스/박테리아 미니 키트(Virus/bacteria mini kit; QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)와 바이러스 RNA 미니 키트(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 사용하여 상기 바이러스들로부터 핵산을 추출하였다.
본원발명에서 이용되는 44주의 표준 바이러스.
스트레인 및 소스(source) 종
KBPV*-VR-1 아데노바이러스 제1형
KBPV-VR-57 아데노바이러스 제1형
KBPV-VR-58 아데노바이러스 제2형
KBPV-VR-2 아데노바이러스 제3형
KBPV-VR-59 아데노바이러스 제2형
KBPV-VR-60 아데노바이러스 제4형
KBPV-VR-61 아데노바이러스 제5형
KBPV-VR-3 아데노바이러스 제8형
KBPV-VR-4 아데노바이러스 제18형
KBPV-VR-5 아데노바이러스 제23형
KBPV-VR-6 아데노바이러스 제40형
KBPV-VR-8 인간 코로나바이러스 OC43
KBPV-VR-9 인간 코로나바이러스 229E
KBPV-VR-10 콕사키바이러스(Coxsackievirus) A3
KBPV-VR-11 콕사키바이러스 A9
KBPV-VR-12 콕사키바이러스 A24
KBPV-VR-13 콕사키바이러스 B1
KBPV-VR-14 콕사키바이러스 B2
KBPV-VR-15 콕사키바이러스 B3
KBPV-VR-16 콕사키바이러스 B4
KBPV-VR-17 콕사키바이러스 B5
KBPV-VR-18 콕사키바이러스 B6
KBPV-VR-19 에코바이러스(Echovirus) 6
KBPV-VR-20 에코바이러스 7
KBPV-VR-21 에코바이러스 9
KBPV-VR-22 에코바이러스 11
KBPV-VR-23 에코바이러스 22
KBPV-VR-24 에코바이러스 25
KBPV-VR-25 에코바이러스 30
KBPV-VR-26 엔테로바이러스(Enterovirus) 70
KBPV-VR-32 인플루엔자 A 바이러스(H3N2)
KBPV-VR-33 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)
KBPV-VR-34 인플루엔자 B 바이러스
KBPV-VR-39 리노바이러스(Rhinovirus) 14
KBPV-VR-40 리노바이러스 21
KBPV-VR-41 RSV(Respiratory syncitial virus) A
KBPV-VR-42 RSV B
KBPV-VR-44 파라인플루엔자 제1형
KBPV-VR-45 파라인플루엔자 제2형
KBPV-VR-46 파라인플루엔자 제3형
KBPV-VR-69 파라인플루엔자 제4형
KBPV-VR-55 엔테로바이러스 70
KBPV-VR-56 엔테로바이러스 71
KBPV-VR-72 인플루엔자 A 바이러스(Brisbane H3N2)
*KBPV, 병원성 바이러스 은행(Korea Bank for Pathogenic viruses).
프라이머-프로브 믹스
서열 정렬에 기초하여, 본 발명자들은 목적 부위(regions of interest)를 찾고 the Primer 3 program(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 또는 수작업으로 프라이머들 및 프로브들을 제작하였다. 보다 상세하게는, NCBI의 데이터베이스에서 얻을 수 있는 바이러스의 타겟 유전자의 염기서열을 분석하여 해당 바이러스에 특이한 염기서열 부위를 동정하여 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 예를 들어, 리노바이러스 타입(A, B, C)에 따라 다양한 서브타입들(예컨대, 리노바이러스 A의 서브타입은 103종, 리노바이러스 B의 서브타입은 99종 등이 알려져 있음)에서 공지된 염기서열 데이터를 기반으로 정렬(alignment) 분석을 통해 보존성 높은 부위에 대한 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 상기 바이러스들에서 서브타입들 간에 매우 높은 변이성(variation)을 가진다는 사실이 잘 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 각 바이러스들에 존재하는 서브타입들에 대한 정렬 분석(약 1,000개의 염기서열 데이터로 분석됨)을 통해 본원발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 디자인하였다.
본 연구에서 고안되어 이용된 실-시간 PCR 프라이머 및 프로브들은 표 2에 제시되어 있다. 상기 제조된 프라이머 및 프로브들에서 4종류의 프라이머-프로브 믹스 튜브(예컨대, 리노바이러스, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 메타뉴모바이러스 및 내적 대조군을 타겟팅하는 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 검출 튜브 1; 파라인플루엔자 1, 파라인플로엔자 2, 파라인플루엔자 3, 파라인플로엔자 4 및 내적 대조군을 타겟팅하는 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 검출 튜브 2; RSV A, RSV B, 엔테로바이러스, 보카바이러스 및 내적 대조군을 타겟팅하는 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 검출 튜브 3; 또는 아데노바이러스 제1형, 아데노바이러스 제2형, 코로나바이러스 OC43/HKU1, 코로나바이러스 229E/NL63 및 내적 대조군을 타겟팅하는 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 검출 튜브 4)를 제조하였다. 각각의 튜브에는 해당 바이러스에 특이한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 및 프로브가 각각 동일한 량(5 pmole/l 및 2.5 pmole/l)으로 들어 있다.
바이러스 검출용 실-시간 PCR 프라이머 및 프로브.
대상유전자 서열(5'->3')
리노바이러스
(A, B, C) 		정방향 프라이머
(1, 2 및 3)		 GTGAAGAGCCCCGTGTG
GTGTGAAGACCCGCATGT
TGTGAAGATCCTATTGCGCTT
역방향 프라이머 TCCCGCAATTGCYCATTAC
프로브 Cy5-CCTCCGGCCCCTGAATG-BHQ2
인플루엔자 A 정방향 프라이머 GGCTCTCATGGAATGGCTAA
역방향 프라이머 CGGTGAGCGTGAACACAA
프로브
(1 및 2)		 ROX-CAAGACCAATYCTGTCACCTCTGAC-BHQ2
ROX-CAAGACCAATCYTGTCACCTCTGAC-BHQ2
인플루엔자 B 정방향 프라이머 AAGATGGAGAAGGCAAAGCA
역방향 프라이머 ATCCATTCCAAGGCAGAGTC
프로브 HEX-CACTGTTGGTTCGGTGGGAA-BHQ1
메타뉴모바이러스 정방향 프라이머 AAATGTTGTGCGGCAGTTTT
역방향 프라이머 CCTGCAGATGTTGGCATGT
프로브 FAM-AGACAATGCAGGRATAACACCAGC-BHQ1
파라인플루엔자 제1형 정방향 프라이머 CAGGAAACCCAGACTGCAACT
역방향 프라이머 GCGTACAGTGTGGTTGTAGCA
프로브 Cy5-TGTCCGAGAGAATGCATATCAGG-BHQ2
파라인플루엔자 제2형 정방향 프라이머 GCTTTATCCCCTCAGCAACA
역방향 프라이머 GAAATCGAGGCAATCTCCAA
프로브 HEX-CCCATTGGTGTTACACTCACAATG-BHQ1
파라인플루엔자 제3형 정방향 프라이머 TTACTCGAGGTTGTCAGGATATAGG
역방향 프라이머 TGCTAGAGAACATGACTTTCTATTGTC
프로브 ROX-TCAGACTTGGTACCTGACTTAAATCCC-BHQ2
파라인플루엔자 제4형 정방향 프라이머 ATCCCAATTTTATTCCAACTGC
역방향 프라이머 ACACCAATGAGTTTGACTTAAGGA
프로브 FAM-CATGGATGCATTCGAATTCCA-BHQ1
RSV A 정방향 프라이머 GGCAAACCACAAAGTCACAC
역방향 프라이머 TGGGGTTGTGTTCTTGATCTG
프로브 Cy5-TGCAATCATACAAGATGCAACGA-BHQ2
RSV A 정방향 프라이머 GGTTAGCCCATCCAAACAAC
역방향 프라이머 TTGTATGGTGTGTTTCTGATTTTG
프로브 ROX-CCACACCACCAATCCACACA-BHQ2
엔테로바이러스 정방향 프라이머 CATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGC
역방향 프라이머
(1 및 2)		 AGTCGGTTCCGCTGCAG
AGTCGGTTCCGCCACAG
프로브 HEX-CCCCTGAATGCGGCTAATC-BHQ1
보카바이러스 정방향 프라이머 TCTTGGGGTCCTTTGTCCTA
역방향 프라이머 AAGGTAACCACCGCAATCAG
프로브 FAM-ACTTCACGAAAACGGATACTGCA-BHQ1
아데노바이러스 1 정방향 프라이머 CGCAGTGGTCTTACATGCAC
역방향 프라이머 ACCGTGGGGTTYCTAAACTTG
프로브 Cy5-AGGACGCCTCGGAGTACCTGA-BHQ2
아데노바이러스 2 정방향 프라이머 GGGCRTACATGCACATCG
역방향 프라이머 CGCTACGGTGGGATTTCTAA
프로브 ROX-CTGGTGCAGTTCGCCCG-BHQ2
코로나바이러스 229E/NL63 정방향 프라이머 229E TGGCAAACAGCGTATAACCA
정방향 프라이머 NL63 GATGCATATGCTAATTTGGTTCC
역방향 프라이머 229E GATCCTCGCTCCAGGGTAAT
역방향 프라이머 NL63 TCCAAGTCCAATGGAACAATG
프로브 FAM-AATACAGGGTCCTCCTGGTAGTGG-BHQ1
코로나바이러스 OC43/HKU1 정방향 프라이머 CTGATGTWCAATTAAGGGCATTT
역방향 프라이머 OC43 TCCTTTATCACCGTTCTCATCA
역방향 프라이머 HKU1 TCCAATTTATTACCGTCGTCATC
프로브 HEX-AATTGTTGCCGTTTTCAGCGT-BHQ1
내적 대조군 정방향 프라이머 AAACTGGAACGGTGAAGGTG
역방향 프라이머 TTAGGATGGCAAGGGACTTC
프로브 Cy5.5-AGTCGGTTGGAGCGAGCATC-BHQ2
상기 제조된 프라이머쌍은 다음과 같은 유전자를 타겟팅한다: (a) 내적 대조군, 인간 액틴 mRNA; (b) 리노바이러스, 5'-UTR; (c) 인플루엔자 A 또는 B 바이러스, 매트릭스 유전자; (d) 메타뉴모바이러스, F 유전자; (e) 파라인플루엔자 제1형, 제2형, 제3형 또는 제4형, HN(hemagglutinin-neuraminidase) 당단백질 유전자; (f) RSV A 또는 B, 접촉(attachment) G 유전자; (g) 엔테로바이러스(A, B, C, D), 5'-UTR; (h) 보카바이러스, NS1 유전자; (i) 아데노바이러스(A, B, C, D, E), 헥손(hexon) 단백질 유전자; 및 (j) 코로나바이러스 OC43/HKU1 또는 229E/NL63, 레플리카제 폴리단백질(replicase polyprotein 1b) 유전자.
멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응법(multiplex real-time PCR)
멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응은 Rotor-Gene 멀티플렉스 PCR 키트(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 이용한 Rotor-Gene Q(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)로 실시하였다. 50℃에서 15분 동안 역전사 과정을 실시한 후, PCR을 다음과 같은 조건으로 실시하였다: (a) 전-변성(pre-denaturing) 단계, 95℃에서 5분; 및 (b) 40 사이클, 95℃에서 15초(변성 단계) 및 56℃에서 15초(어닐링 및 연장 단계)로 구성된 1사이클. 이때, 멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 반응물의 조성은 하기 표 3에 제시되어 있다. 하기 프라이머-프로브 혼합물(primer-probes mix)은 호흡기 바이러스의 대상유전자를 검출하기 위한 5 pmole/μl의 정방향 프라이머, 5 pmole/μl의 역방향 프라이머, 그리고 2.5 pmole/μl의 프로브를 포함하였다. 중합연쇄반응을 수행하는 반응물의 총 부피가 25 μl이기 때문에, 호흡기 바이러스 및 내적 대조군을 검출하는 프라이머 및 프로브의 농도는 각각 0.4 μM(12.5 pmoles/25 μl) 및 0.2 μM(62.5 pmole/25 μl)이었다.
중합연쇄반응을 수행하는 반응물의 구성 및 농도.
성분 부피
(μl) 		농도
2X Rotor-Gene 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스 12.5 1X
프라이머-프로브 혼합물 프라이머(5 pmole/μl) 2.0 0.4 μM
프로브(2.5 pmole/μl) 0.2 μM
Rotor-Gene RT 믹스 0.25 -
뉴클레아제-결핍 물 5.25 -
샘플 DNA 템플레이트 5 -
전체 25 -
멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응 중 결합 및 연장단계에서 프로브에 의해 생성된 형광을 Rotor-Gene Q(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)에서 측정한다. 상기 멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 실-시간 중합효소연쇄반응의 매 주기마다 실-시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 실-시간 모니터 상에서 FAMTM이 발색되는 경우 녹색채널(510 ± 5 nm), HexTM이 발색되는 경우 노랑채널(555 ± 5 nm), Cy5TM이 발색되는 경우 빨강채널(660 ± 10 nm), ROXTM이 발색되는 경우 주황채널(610 ± 5 nm) 및 Cy5.5TM이 발색되는 경우 진홍채널(712 log pass)에서 표시하도록 지정하였다. 녹색채널, 노랑채널, 빨강채널, 주황채널 및 진홍채널에서 형광을 관찰하였다.
실험결과
각 튜브에서 진홍채널의 역치(threshold) 값은 0.04로 지정하고 나머지 채널의 역치 값은 0.03으로 지정한 뒤 Ct 값을 확인한다. Ct 값이 <36에서 피크(peak)가 관찰되면 양성으로 판독한다.
4종의 호흡기 바이러스에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 검출 튜브 1 내지 튜브 4를 이용한 실-시간 PCR은 해당 형광채널에서 타겟 바이러스를 특이적으로 확인시켜 주었다(참고: 도 1 내지 도 4).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 다음의 단계를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 동시 검출방법:
    (a) 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계;
    (b) (i) 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제4서열의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제5서열의 프로브로 이루어진 리노바이러스 검출 세트; 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제8서열 및 서열목록 제9서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 인플루엔자 A 검출 세트; 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 인플루엔자 B 검출 세트; 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제15서열의 프로브로 이루어진 메타뉴모바이러스 검출 세트; 서열목록 제16서열 및 서열목록 제17서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제18서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제1형 검출 세트; 서열목록 제19서열 및 서열목록 제20서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제21서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제2형 검출 세트; 서열목록 제22서열 및 서열목록 제23서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제24서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제3형 검출 세트; 서열목록 제25서열 및 서열목록 제26서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제27서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제4형 검출 세트; 서열목록 제28서열 및 서열목록 제29서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제30서열의 프로브로 이루어진 RSV A 검출 세트; 서열목록 제31서열 및 서열목록 제32서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제33서열의 프로브로 이루어진 RSV B 검출 세트; 서열목록 제34서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제35서열 및 서열목록 제36서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제37서열의 프로브로 이루어진 엔테로바이러스 검출 세트; 서열목록 제38서열 및 서열목록 제39서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제40서열의 프로브로 이루어진 보카바이러스 검출 세트; 서열목록 제41서열 및 서열목록 제42서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제43서열의 프로브로 이루어진 아데노바이러스 1 검출 세트; 서열목록 제44서열 및 서열목록 제45서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제46서열의 프로브로 이루어진 아데노바이러스 2 검출 세트; 서열목록 제47서열 및 서열목록 제48서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제49서열 및 서열목록 제50서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제51서열의 프로브로 이루어진 코로나바이러스 229E/NL63 검출 세트; 및 서열목록 제52서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제53서열 및 서열목록 제54서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제55서열의 프로브로 이루어진 코로나바이러스 OC43/HKU1 검출 세트로 구성된 군으로부터 최소 2종의 검출 세트를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; 및 (ii) 서열목록 제56서열 및 서열목록 제57서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제58서열의 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 DNA 시료는 임상검체로부터 유래된 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 다중 호흡기 바이러스 동시 검출방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 상기 다중 호흡기 바이러스 검출 세트는 (i) 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제4서열의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제5서열의 프로브로 이루어진 리노바이러스 검출 세트; 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제8서열 및 서열목록 제9서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 인플루엔자 A 검출 세트; 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 인플루엔자 B 검출 세트; 및 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제15서열의 프로브로 이루어진 메타뉴모바이러스 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; (ii) 서열목록 제16서열 및 서열목록 제17서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제18서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제1형 검출 세트; 서열목록 제19서열 및 서열목록 제20서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제21서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제2형 검출 세트; 서열목록 제22서열 및 서열목록 제23서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제24서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제3형 검출 세트; 및 서열목록 제25서열 및 서열목록 제26서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제27서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제4형 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; (iii) 서열목록 제28서열 및 서열목록 제29서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제30서열의 프로브로 이루어진 RSV A 검출 세트; 서열목록 제31서열 및 서열목록 제32서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제33서열의 프로브로 이루어진 RSV B 검출 세트; 서열목록 제34서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제35서열 및 서열목록 제36서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제37서열의 프로브로 이루어진 엔테로바이러스 검출 세트; 및 서열목록 제38서열 및 서열목록 제39서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제40서열의 프로브로 이루어진 보카바이러스 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; 또는 (iv) 서열목록 제41서열 및 서열목록 제42서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제43서열의 프로브로 이루어진 아데노바이러스 1 검출 세트; 서열목록 제44서열 및 서열목록 제45서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제46서열의 프로브로 이루어진 아데노바이러스 2 검출 세트; 서열목록 제47서열 및 서열목록 제48서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제49서열 및 서열목록 제50서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제51서열의 프로브로 이루어진 코로나바이러스 229E/NL63 검출 세트; 및 서열목록 제52서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제53서열 및 서열목록 제54서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제55서열의 프로브로 이루어진 코로나바이러스 OC43/HKU1 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트인 것을 특징으로 하는 다중 호흡기 바이러스 동시 검출방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 다중 호흡기 바이러스 검출 세트는 4종의 호흡기 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 다중 호흡기 바이러스 동시 검출방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 다중 호흡기 바이러스 동시 검출방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 증폭은 실-시간(real-time) PCR에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 다중 호흡기 바이러스 동시 검출방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 다중 호흡기 바이러스 동시 검출방법.
  9. (i) 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제4서열의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제5서열의 프로브로 이루어진 리노바이러스 검출 세트; 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제8서열 및 서열목록 제9서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 인플루엔자 A 검출 세트; 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 인플루엔자 B 검출 세트; 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제15서열의 프로브로 이루어진 메타뉴모바이러스 검출 세트; 서열목록 제16서열 및 서열목록 제17서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제18서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제1형 검출 세트; 서열목록 제19서열 및 서열목록 제20서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제21서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제2형 검출 세트; 서열목록 제22서열 및 서열목록 제23서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제24서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제3형 검출 세트; 서열목록 제25서열 및 서열목록 제26서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제27서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 제4형 검출 세트; 서열목록 제28서열 및 서열목록 제29서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제30서열의 프로브로 이루어진 RSV A 검출 세트; 서열목록 제31서열 및 서열목록 제32서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제33서열의 프로브로 이루어진 RSV B 검출 세트; 서열목록 제34서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제35서열 및 서열목록 제36서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제37서열의 프로브로 이루어진 엔테로바이러스 검출 세트; 서열목록 제38서열 및 서열목록 제39서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제40서열의 프로브로 이루어진 보카바이러스 검출 세트; 서열목록 제41서열 및 서열목록 제42서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제43서열의 프로브로 이루어진 아데노바이러스 1 검출 세트; 서열목록 제44서열 및 서열목록 제45서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제46서열의 프로브로 이루어진 아데노바이러스 2 검출 세트; 서열목록 제47서열 및 서열목록 제48서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제49서열 및 서열목록 제50서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제51서열의 프로브로 이루어진 코로나바이러스 229E/NL63 검출 세트; 및 서열목록 제52서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제53서열 및 서열목록 제54서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제55서열의 프로브로 이루어진 코로나바이러스 OC43/HKU1 검출 세트로 구성된 군으로부터 최소 2종의 검출 세트를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; 및 (ii) 서열목록 제56서열 및 서열목록 제57서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제58서열의 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 포함하는 다중 호흡기 바이러스 검출용 키트.
  10. 삭제
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 다중 호흡기 바이러스 검출 세트는 (i) 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제4서열의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제5서열의 프로브로 이루어진 리노바이러스(Rhinovirus) 검출 세트; 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제8서열 및 서열목록 제9서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 인플루엔자 A(Influenza A) 검출 세트; 서열목록 제10서열 및 서열목록 제11서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제12서열의 프로브로 이루어진 인플루엔자 B 검출 세트; 및 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제15서열의 프로브로 이루어진 메타뉴모바이러스(metapneumovirus) 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; (ii) 서열목록 제16서열 및 서열목록 제17서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제18서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 1(parainfluenza 1) 검출 세트; 서열목록 제19서열 및 서열목록 제20서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제21서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 2 검출 세트; 서열목록 제22서열 및 서열목록 제23서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제24서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 3 검출 세트; 및 서열목록 제25서열 및 서열목록 제26서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제27서열의 프로브로 이루어진 파라인플루엔자 4 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; (iii) 서열목록 제28서열 및 서열목록 제29서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제30서열의 프로브로 이루어진 RSV(respiratory syncytial virus) A 검출 세트; 서열목록 제31서열 및 서열목록 제32서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제33서열의 프로브로 이루어진 RSV B 검출 세트; 서열목록 제34서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제35서열 및 서열목록 제36서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제37서열의 프로브로 이루어진 엔테로바이러스(Enterovirus) 검출 세트; 및 서열목록 제38서열 및 서열목록 제39서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제40서열의 프로브로 이루어진 보카바이러스(Bocavirus) 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트; 또는 (iv) 서열목록 제41서열 및 서열목록 제42서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제43서열의 프로브로 이루어진 아데노바이러스 1(adenovirus 1) 검출 세트; 서열목록 제44서열 및 서열목록 제45서열의 프라이머쌍, 그리고 서열목록 제46서열의 프로브로 이루어진 아데노바이러스 2 검출 세트; 서열목록 제47서열 및 서열목록 제48서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 정방향 프라이머, 서열목록 제49서열 및 서열목록 제50서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제51서열의 프로브로 이루어진 코로나바이러스(Coronavirus) 229E/NL63 검출 세트; 및 서열목록 제52서열의 정방향 프라이머, 서열목록 제53서열 및 서열목록 제54서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 역방향 프라이머, 그리고 서열목록 제55서열의 프로브로 이루어진 코로나바이러스 OC43/HKU1 검출 세트로 구성된 다중 호흡기 바이러스 검출 세트인 것을 특징으로 하는 다중 호흡기 바이러스 검출용 키트.
  12. 삭제
  13. 삭제
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