CN112391496A

CN112391496A - 一种新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合、检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN112391496A
Application number: CN202011363012.2A
Authority: CN
Inventors: 林琳; 武晓宇; 华聪; 章程
Original assignee: Hangzhou Weierxiao Medical Laboratory Co ltd; Weierxiao Laboratory Technology Hangzhou Co ltd
Current assignee: Hangzhou Weierxiao Medical Laboratory Co ltd; Weierxiao Laboratory Technology Hangzhou Co ltd
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2021-02-23

Abstract

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合、检测试剂盒及应用。本发明是基于多重荧光PCR技术，通过实时荧光PCR仪，进行同步核酸扩增与检测，提供一种可以在同一反应管中检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、新冠病毒ORF 1ab基因及N基因、呼吸道合胞病毒、腺病毒、内标的B2M基因的试剂盒。同步检测细胞内保守基因B2M，用于评估采集样本质量及PCR抑制因素，对检测过程进行质量控制。本发明所有的探针Tm接近相同且高于引物的Tm大约8‑10℃，所有引物的Tm接近相同58～60℃，确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合。

Description

一种新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合、检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合、检测试剂盒及应用。

背景技术

目前病毒的检测产品大多只单一性地采用免疫检测或荧光PCR法针对新冠病毒、流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒，并无联合检测产品，无法实现有效筛查。虽有少数联合检测试剂盒，但检测范围覆盖不当，或只进行新冠病毒与流感病毒的同步检测，检测效率太低；或同时检测10余种呼吸道病毒，缺少针对性且患者检测成本过高。目前的联合检测基因芯片技术，仪器、研发成本相对较高，灵活度较低，且病毒覆盖种类较少，未能在临床大规模使用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合、检测试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。荧光定量PCR的灵敏度和特异性均较高，且检测时间较短，具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，同时具有针对性的检测秋冬季节常见、人群易感的呼吸道病毒(流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒)，目前尚未有将荧光定量PCR法单独应用于联合检测新冠病毒、流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的技术。本检测方法针对性强，方便快捷，安全可靠，价格低廉，适于推广应用。

本发明是这样实现的，一种新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合，所述引物与探针组包括用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab的引物SEQ ID NO：1、SEQ IDNO： 2和探针SEQ ID NO：3FAM-ACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTC-MGB；用于检测 2019-nCoV N的引物SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和探针SEQ ID NO：6 FAM-ACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCT-MGB；用于检测甲型流感病毒的引物SEQ ID NO： 7、SEQ ID NO：8和探针SEQ ID NO：9HEX/JOETCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG-MGB；用于检测乙型流感病毒的引物SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11和探针SEQ ID NO：12 ROX-ACCTTGCTGCTCTGCTATGGGCTC-MGB；用于检测呼吸道合胞病毒的引物SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和探针SEQ ID NO：15 NED/ABY-ATCTCAACCTCWCYTATAATTGCAGC-MGB，其中W＝A/T；Y＝T/C；本发明的实施例中W为T，Y为T；用于检测腺病毒的引物SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和探针 SEQ ID NO：18JUN-ACCTTYTTCCCCATGGCBCACAACAC-MGB，其中Y＝C/T，B＝T/G/C，本发明的实施例中Y为C，B为T；内参B2M引物SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和探针SEQ ID NO：21。

本发明提供的上述引物与探针的组合，能够在同一反应管中有效地同时扩增出新型冠状病毒、甲型流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒(2009)、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒的特异性片段产物。

另外，本发明还提供了一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒，包括所述的引物与探针组合。所述呼吸道感染病原体包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒。所述引物包括用于检测靶基因的上下游引物和用于检测内标基因B2M 的上下游引物；所述探针包括用于检测靶基因的探针和用于检测内标基因B2M的探针。所述用于检测靶基因的上下游引物的浓度为180～200nM，所述用于检测内标基因B2M的上下游引物的浓度为80～120nM；所述用于检测靶基因的探针的浓度为5～30μM，所述用于检测内标基因B2M的探针的浓度为5～10μM。

本发明还披露了如上述的一种新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合在制备用于检测呼吸道病毒的试剂盒中的应用。

进一步地，所述呼吸道病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒中的至少一种。

本发明还披露了一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒，包括如权利要求1所述的新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、酶混合液、空白对照和阳性对照。

进一步地，所述PCR缓冲液的组成为：26～30mol/L pH8.0 Tris-HCl，15～25mmol/L (NH4)₂SO₄，28～32mmol/L KC1，3.5～4.5mmol/L MgCl₂，0.15～0.25mol/L dNTPs。

进一步地，所述酶混合液包括热启动Taq酶、逆转录酶和尿嘧啶糖基化酶。所述热启动 Taq酶的用量为3～8U/人份，所述逆转录酶的用量为3～8U/人份，所述尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05～0.2U/人份。所述热启动Taq酶的用量为5.5U/人份，所述逆转录酶的用量为5.5 U/人份，所述尿嘧啶糖基化酶的用量为0.1U/人份。

进一步地，所述空白对照为灭菌的去离子水；所述阳性对照包括新型冠状病毒N靶基因质粒、新型冠状病毒ORF 1ab靶基因质粒、乙型流感病毒基因质粒，质粒浓度均为1.0×10⁵ copies/mL，以及内标B2M基因质粒，质粒浓度为1.0×10⁴copies/mL；甲型流感病毒基因质粒、呼吸道合胞病毒基因质粒、腺病毒基因质粒，质粒浓度均为1.0×10⁵copies/mL。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明方法方便快捷，能在较短的时间内对新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒进行联合检测，检测试剂不需要专用的设备，在进口的罗氏、 ABI和国产的仪器上都适用，不需要增加设备，减轻医疗机构及患者负担，简便易行；针对性强，本发明针对秋冬季节常见、人群易感的呼吸道病毒与新冠病毒进行联合检测；灵敏度高，可实现低拷贝样本的检测；特异性好，本发明的引物探针针对新冠病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒的特异性保守区域序列设计，具有较高的特异性。本发明安全高效，可为患者的诊断和鉴别诊断提供强力支持，适于推广应用。

本发明开发的试剂盒，内标选用的是人B2M蛋白基因作为内源性内标，监控样本采集、提取及检测整个实验流程，避免假阴性出现。同时设置UNG酶+dUTP防污染措施，避免PCR产物污染带来的假阳性结果。

本发明是基于多重荧光PCR技术，通过实时荧光PCR仪，进行同步核酸扩增与检测，提供一种可以在同一反应管中检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、新冠病毒ORF 1ab基因及N基因、呼吸道合胞病毒、腺病毒、内标的B2M基因的试剂盒。同步检测细胞内保守基因 B2M，用于评估采集样本质量及PCR抑制因素，对检测过程进行质量控制。本发明所有的探针Tm接近相同且高于引物的Tm大约8-10℃，所有引物的Tm接近相同58～60℃，确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明披露了一种新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合、检测试剂盒及应用，具体如下实施例所示。

实施例

(1)引物与探针组合

本发明中设计的仅与新冠病毒2019-nCoV ORF1ab的互补的核甘酸序列的SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2的引物和SEQ ID NO：3的探针；仅与2019-nCoV N靶基因的互补的核苷酸序列的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5的引物和SEQ ID NO：6的探针；仅与甲型流感病毒的互补的核苷酸序列的SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的引物和SEQ ID NO：9的探针；仅与乙型流感病毒靶基因互补的核苷酸序列SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11的引物和SEQ ID NO：12的探针；仅与呼吸道合胞病毒靶基因互补的核苷酸序列SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14的引物和SEQID NO：15的探针；仅与腺病毒靶基因互补的核苷酸序列SEQ ID NO： 16、SEQ ID NO：17的引物和SEQ ID NO：18的探针。内参B2M引物序列SEQ ID NO：19、 SEQ ID NO：20的引物和SEQID NO：21的探针。

用于检测靶基因的探针使用浓度为180-220nM，用于检测内标的探针使用浓度为80-120 nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为180-220nM，用于检测内标的引物使用浓度为80-120nM。用于检测靶基因的探针使用浓度为200nM，用于检测内标的探针使用浓度为100 nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为200nM，用于检测内标的引物使用浓度为100 nM。

(2)PCR缓冲液：

所述PCR缓冲液的组成为：26-30mol/L pH8-8.5Tris-HCl，15-25mmol/L(NH4)2SO₄， 28-32mmol/L KC1，3.5-4.5mmol/L MgCl₂，0.15-0.25mol/L dNTPs。所述PCR缓冲液的组成为：28mol/L pH8.0Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2SO₄，30mmol/L KC1，4.0mmol/L MgCl₂，0.2mol/L dNTPs。

(3)酶混合液：

所述酶混合液包括热启动Taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)；其中热启动Taq 酶的用量为3-8U/人份，逆转录酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份。

(4)空白对照：

所述空白对照为无RNA酶的水。

(5)阳性对照：

所述阳性对照：2019-nCoV ORF1ab基因质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；2019-nCoV N 基因质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；甲型流感病毒质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；乙型流感病毒质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；腺病毒质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；内标质粒，浓度为1.0×10⁴copies/ml；呼吸道合胞病毒质粒，浓度为1.0×10⁵copies/ml；内标质粒，浓度为1.0×10⁴copies/ml。

2、试剂盒的使用方法：

(1)样本采集及处理：

1)鼻咽拭子：用无菌拭子拭取鼻腔、咽部分泌物，将其置于无菌试管(400-500μL生理盐水或PBS)，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。2)痰液：留取前清水漱口3次，用力咳出呼吸道深部的痰液吐至无菌痰液收集器中。患者痰液较深不易咳出时，可在咳痰前捶背、协助排痰。采集痰量不能少于1mL。液化方法：痰液样本中加入等体积的乙酰半胱氨酸(10g/L)，室温振荡30分钟，待充分液化后才可进行后续核酸提取。3)肺泡灌洗液：收集支气管肺泡灌洗液密闭送检。样本采用Qiagen DNA/RNA共纯化试剂盒80284。

(2)样本检测：

将样品提取的DNA 5μl加入PCR反应液并混匀后，再放置于荧光定量PCR仪中反应，扩增程序：55℃15分钟，热启动95℃30秒，热循环95℃10秒，60℃35秒，共45循环。

(3)扩增后曲线分析：

1)样本在FAM、HEX/JOE、ROX、NED/ABY、JUN荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参B2M在CY5荧光检测通道Ct值≤40，判断为阴性。2)样本在FAM荧光检测通道Ct值≤40，HEX/JOE、ROX、NED/ABY、JUN荧光检测通道Ct值显示为Undet，其 RNA内参B2M在CY5荧光检测通道Ct值≤40或Undet，判断为2019-nCoV阳性。3)样本在HEX/JOE荧光检测通道Ct值≤40，FAM、ROX、NED/ABY、JUN荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参B2M在CY5荧光检测通道Ct值≤40或Undet，判断为甲型流感病毒阳性。4)样本在ROX荧光检测通道Ct值≤40，FAM、HEX/JOE、NED/ABY、JUN荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参B2M在CY5荧光检测通道Ct值≤40或Undet，判断为乙型流感病毒阳性。5)样本在NED/ABY荧光检测通道Ct值≤40，FAM、HEX/JOE、 ROX、JUN荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参B2M在CY5荧光检测通道Ct值≤40或Undet，判断为呼吸道合胞病毒阳性。6)样本在JUN荧光检测通道Ct值≤40，FAM、HEX/JOE、ROX、NED/ABY荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参B2M在CY5 荧光检测通道Ct值≤40或Undet，判断为腺病毒阳性。7)样本在各荧光通道Ct值显示为 Undet，判断为无效，需重新采样。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 魏尔啸实验室科技（杭州）有限公司

杭州魏尔啸医学检验实验室有限公司

<120> 一种新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合、检测试剂盒及应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctacaactt gtgctaatga ccc 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggctgcactt acaccgcaaa 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actccgcgaa cccatgcttc agtc 24

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggccccaagg tttaccca 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aattggaacg ccttgtcctc 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actgcgtctt ggttcaccgc tct 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcttctaac cgaggtcgaa acg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aattccctta gtcagaggtg aca 23

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcaggccccc tcaaagccga g 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttgaaatag cagaaggcca cgaa 24

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgtcttactc caggtaccga a 21

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accttgctgc tctgctatgg gctc 24

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctgggatact cttaatcatc t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agttgttagt gtaactttgt g 21

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)

<223> W=A/T

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)

<223> Y=T/C

<400> 15

atctcaacct cwcytataat tgcagc 26

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctacacctac gagtggaact t 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aggaatgggg taaagcatgt t 21

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)

<223> Y=C/T

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)

<223> B=T/G/C

<400> 18

accttyttcc ccatggcbca caacac 26

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cggctctgct tcccttagac t 21

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caaacgtcgc gtgctgtt 18

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgctaagttc gcatgtc 17

Claims

1.一种新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合，其特征在于：所述引物与探针组包括用于检测新冠病毒2019-nCoV ORF1ab的引物SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和探针SEQ ID NO：3；用于检测2019-nCoV N的引物SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和探针SEQ ID NO：6；用于检测甲型流感病毒的引物SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和探针SEQ ID NO：9；用于检测乙型流感病毒的引物SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和探针SEQ ID NO：12；用于检测呼吸道合胞病毒的引物SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和探针SEQ ID NO：15；用于检测腺病毒的引物SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和探针SEQ ID NO：18；内参B2M引物SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20和探针SEQ ID NO：21。

2.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合在制备用于检测呼吸道病毒的试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述呼吸道病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒及腺病毒中的至少一种。

4.一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的新型冠状病毒联合呼吸道病毒检测引物与探针组合。

5.根据权利要求4所述的一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR缓冲液、酶混合液、空白对照和阳性对照。

6.根据权利要求5所述的一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液的组成为：26～30mol/L pH8.0 Tris-HCl，15～25mmol/L(NH4)₂SO₄，28～32mmol/LKC1，3.5～4.5mmol/L MgCl₂，0.15～0.25mol/L dNTPs。

7.根据权利要求5所述的一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：所述酶混合液包括热启动Taq酶、逆转录酶和尿嘧啶糖基化酶。

8.根据权利要求5所述的一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：所述空白对照为灭菌的去离子水；所述阳性对照包括新型冠状病毒N靶基因质粒、新型冠状病毒ORF1ab靶基因质粒、乙型流感病毒基因质粒，质粒浓度均为1.0×10⁵copies/mL，以及内标B2M基因质粒，质粒浓度为1.0×10⁴copies/mL；甲型流感病毒基因质粒、呼吸道合胞病毒基因质粒、腺病毒基因质粒，质粒浓度均为1.0×10⁵copies/mL。