CN111808997A - 检测10种呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及新型冠状病毒2019‑nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒I型、人副流感病毒II型、人副流感病毒III型、人副流感病毒IV型、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒和偏肺病毒的检测；与此同时，还提供了包含所述组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测呼吸道相关病毒并分型的方法。本发明的组合物结合荧光探针法和熔解曲线法，能够在一管同时检测呼吸道相关病毒并进行分型，其成本低，通量高，耗时少，极大的提升了检测效率，并且操作简便，单管操作避免由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，更具体的，更具体地，涉及新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒I型、人副流感病毒II型、人副流感病毒III型、人副流感病毒IV型、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒和偏肺病毒的检测并分型。
背景技术
呼吸系统感染性疾病大多数是临床上的常见病、多发病。引起呼吸道疾病的病原体种类很多，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的病原体种类。呼吸道病毒可以通过空气传播，引起急性呼吸道病的的病原体具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点，可引起广泛的急性上呼吸道和下呼吸道疾病，严重危害人类的健康，严重可致死。常见的呼吸道病毒主要包括如下病毒：
1）2019新型冠状病毒（2019-nCoV），冠状病毒是一个大型病毒家族，在此之前已知有6种可以感染到人类，如可引起感冒以及中东呼吸综合征（MERS）和严重急性呼吸综合征（SARS）等。新型冠状病毒SARS-CoV-2是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，该病毒在分类学上属于冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）中的β类型冠状病毒，具有囊膜和刺突细胞学特征基因组为线性单股正链的RNA（（＋）ssRNA）病毒。
2）流行性感冒病毒（influenza virus），简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，属于正黏病毒，一共分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。禽流感（avianinfluenza; AI）是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的某种亚型（也称禽流感病毒）引起的传染性疾病。在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科（Orthomyxoviridae），流行性感冒病毒属（Influenza virus），它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行，如发生在1918~1919年造成全球有二千万以上的人死亡的“西班牙流感”（Spanish Influenza）、发生于1957 年“亚洲流感”（Asian Influenza）、发生于1968年的“香港流感”（Hong Kong Influenza）和发生于1977年的“俄国流感”（Russian Influenza），以及发生于2013年的H7N9禽流感。
3）呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）属副黏病毒科肺炎属的RNA病毒，临床研究表明，呼吸道合胞病毒是引起病毒性肺炎的最常见的病原，多见于三岁以下的婴幼儿，主要症状有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。
4）腺病毒（Adenoviruses，HAdv）属于腺病毒科（Adenoviridae），根据免疫学、生物学、生物化学特性不同，将其分为A～G 7个亚种，共有52个血清型，不同的血清型有不同的器官亲和性并引起相应的临床表现，对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染致病。
5）副流感病毒(Human Parainfluenza viruse，HPIVs)是单链的RNA病毒，属于副黏病毒，一共有四种型别，分别是：人副流感病毒I型、人副流感病毒II型、人副流感病毒III型、人副流感病毒IV型。常常引起儿童上呼吸道感染或下呼吸道感染，它也能造成严重反复感染的下呼吸道疾病，特别是在老年人和有免疫缺陷人群中。在临床上四个型别有各自不同的感染后症状，Ⅰ型可引起严重的喉炎（假膜性喉炎）、气管炎或支气管炎；Ⅱ型与Ⅰ型引起病症的临床表现相似，但不严重，只有在感染2~4岁儿童时，才可发生严重的感染病例，感染Ⅰ型和Ⅱ型病毒还有一个表现，就是起病较急，会出现鼻塞、流涕、咽痛的症状，严重的话还会发生喉梗阻；Ⅲ型是仅次于呼吸道合胞病毒的婴儿支气管炎和肺炎的病原体，常引起婴幼儿细支气管和肺炎，也可导致假膜性喉炎，此外III型病毒感染的发病率较高，而且还可以形成巨细胞性肺炎。引发中耳炎的几率也比感染1型更常见；Ⅳ型引起的病症较轻，多引起成人和儿童的上呼吸道感染，通常不引起肺炎。因此区分这四种型别的副流感病毒来辅助临床医生是很有必要的。
6）人类偏肺病毒（Human Metapneumovirus，hMPV）是近年来发现的一种与人类呼吸道感染之间存在病原学关系的新型副粘液病毒。2001年荷兰学者首次报道了HMPV，随后世界各国研究表明，该病毒在世界范围内普遍存在，并已经在人类中传播了至少50年。HMPV被认为是目前导致呼吸道感染的第二大原因，且与RSV属于同一家族，后者是人类呼吸道感染的第一大病因。HMPV与近10%的病因不明的呼吸道感染有关，可引起相当一部分婴儿、儿童和成人的上、下呼吸道感染。
上述7种病毒（含4种副流感病毒基因型）引起的呼吸道感染性疾病具有相似的临床症状和流行特征，严重的可能导致重症肺炎、呼吸衰竭，甚至死亡，因此，早诊断、早治疗、早隔离是防止的根本。然而，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的病毒种类，而且病毒的培养条件较苛刻，造成培养阳性率低，甚至有些病毒在目前条件下尚不能培养，这给呼吸道感染患者及临床医生带来很大困扰。
因此本领域迫切需要一种简便、快速、客观的检测多种呼吸道病毒的方法，从而实现明确病原、及早诊断、合理指导临床用药。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供了一种能够检测呼吸道相关病毒并分型的组合物，所述组合物同时包括：
第一组：
如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针；
如SEQ ID NO:4所示的乙型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:5所示的乙型流感病毒下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的乙型流感病毒探针；和
如SEQ ID NO:7所示的呼吸道腺病毒上游引物、如SEQ ID NO:8所示的呼吸道腺病毒下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的呼吸道腺病毒探针；以及
第二组：
如SEQ ID NO:10所示的人副流感病毒I型上游引物和如SEQ ID NO:11所示的人副流感病毒I型下游引物；
如SEQ ID NO:12所示的人副流感病毒II型上游引物和如SEQ ID NO:13所示的人副流感病毒II型下游引物；
如SEQ ID NO:14所示的人副流感病毒III型上游引物和如SEQ ID NO:15所示的人副流感病毒III型下游引物；
如SEQ ID NO:16所示的人副流感病毒IV型上游引物和如SEQ ID NO:17所示的人副流感病毒IV型下游引物；
如SEQ ID NO:18所示的甲型流感病毒上游引物和如SEQ ID NO:19所示的甲型流感病毒下游引物；
如SEQ ID NO:20所示的呼吸道合胞病毒上游引物和如SEQ ID NO:21所示的呼吸道合胞病毒下游引物；和
如SEQ ID NO:22所示的偏肺病毒上游引物和如SEQ ID NO:23所示的偏肺病毒下游引物。
在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针中的一对或多对。
所述如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物，其靶标序列为Genbank登录号为：NC_045512.2的新型冠状病毒2019-nCoV全基因组。
所述如SEQ ID NO:7所示的呼吸道腺病毒上游引物、如SEQ ID NO:8所示的呼吸道腺病毒下游引物，其靶标序列为Genbank登录号为：MN628615.1的呼吸道腺病毒全基因组。
进一步地，第一组的探针上带有荧光报告基团，第二组的每一对的上游引物和/或下游引物带有荧光报告基团，并且第一组内探针的荧光报告基团彼此互不相同且互不干扰，并且第二组内人副流感病毒的荧光报告基团一致，但与其余每一对的荧光报告基团彼此互不相同且互不干扰。
在一个具体的实施方案中，当第二组的每一对的上下游引物均带有荧光报告基团时，其荧光报告基团是一样的。
在本发明中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在本发明中，第一组采用的是荧光探针法，第二组采用的是熔解曲线法。具体地，荧光探针法的荧光报告基团在探针上，熔解曲线法的荧光报告基团在上游和/或下游引物的一个T碱基上。
进一步地，所述组合物第一组还包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物以混合的形式存在于同一个包装中。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：如SEQ ID NO:24所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:25所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:26所示的内标探针。
在本发明中，荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
在本发明中，探针3’末端还连有猝灭基团，例如BHQ1或BHQ2等。
在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:6所示的乙型流感病毒探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO:9所示的呼吸道腺病毒探针的荧光报告基团为ROX。
在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:10所示的人副流感病毒I型上游引物的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:12所示的人副流感病毒II型上游引物的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:14所示的人副流感病毒III型上游引物的荧光报告基团为FAM；如SEQID NO:16所示的人副流感病毒IV型上游引物的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:18所示的甲型流感病毒上游引物的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO:20所示的呼吸道合胞病毒上游引物的荧光报告基团为ROX；如SEQ ID NO:22所示的偏肺病毒的荧光报告基团为CY5。
在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:26所示的内标探针的荧光报告基团为CY5。
进一步地，所述组合物中引物的用量为50~150nM；所述组合物中探针的用量为25~75nM。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测呼吸道相关病毒并分型的试剂盒中的用途。
所述呼吸道感染的病毒包括：新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒I型、人副流感病毒II型、人副流感病毒III型、人副流感病毒IV型、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒和偏肺病毒。
第三方面，本发明提供了一种检测呼吸道相关病毒并分型的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述组合物中引物的用量为50~150nM；所述组合物中探针的用量为25~75nM；所述dNTP的用量为0.2~0.3mM。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/μL~15U/μL，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶（MMLV）；所述DNA聚合酶的浓度为5U/μL~15U/μL，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，所述试剂盒除上述的本发明的组合物之外，还进一步包括以下组份和用量：
第四方面，提供了一种用于检测呼吸道相关病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1）释放待测样本的核酸；
2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃，时间25~35分钟，1次循环；预变性，温度为94℃，时间2~10分钟，1次循环；变性，温度为94℃，时间为10~20秒，退火，温度为60℃，时间为20~40秒，45~50次循环；熔解曲线分析，温度为50℃~95℃，每上升0.5℃采集一次荧光，1次循环。
进一步地，提供了一种用于以非诊断目的检测呼吸道相关病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1）释放待测样本的核酸；
2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
在示例性的实施方案中，本发明的检测方法可以在实验中的检测培养物中是否有上述病毒。
使用本发明的组合物，结合荧光探针法和熔解曲线法，能够使用一个管在一次试验中同时检测10种呼吸道相关病毒基因型并进行分型，其成本低，通量高，耗时少。使得单次试验一管能给出11个靶点的信息，极大的提升了检测效率，并且操作简便，结果读取过程通过扩增曲线和CT值即可以判定。检测全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。
附图说明
图1为本发明组合物检测样本的FAM通道检测结果：图1A为熔解曲线法检测副流感病毒的检测结果，图1B为荧光探针法检测新型冠状病毒2019-nCoV的检测结果；
图2为本发明组合物检测样本的HEX通道检测结果：图2A为熔解曲线法检测甲型流感病毒的检测结果，图2B为荧光探针法检测乙型流感病毒的检测结果；
图3为本发明组合物检测样本的ROX通道检测结果：图3A为熔解曲线法检测呼吸道合胞病毒的检测结果，图3B为荧光探针法检测呼吸道腺病毒的检测结果；
图4为本发明组合物检测样本的CY5通道检测结果：图4A为熔解曲线法检测偏肺病毒的检测结果，图4B为荧光探针法检测内标的检测结果；
图5~12为本发明组合物检测浓度为500拷贝/ml的各个病毒的检测结果；
图13为本发明组合物的特异性检测结果：图13A为熔解曲线法检测特异性的检测结果，图13B为荧光探针法检测特异性的检测结果；
图14~27为本发明组合物的对比例检测各个病毒的检测结果；
图28为本发明组合物与本发明组合物的对比例分别检测阴性样本的检测结果：图28A为本发明组合物的检测结果，图28B为本发明组合物的对比例的检测结果；
图29为本发明组合物和本发明对比例组合物中的新型冠状病毒2019-nCoV引物和探针单独检测新冠样本的检测结果；
图30为本发明组合物和本发明对比例组合物中的呼吸道腺病毒引物和探针单独检测呼吸道腺病毒样本的检测结果；
图31为本发明组合物和本发明对比例组合物中的新型冠状病毒2019-nCoV引物和探针在联检体系中的检测结果；
图32为本发明组合物和本发明对比例组合物中的呼吸道腺病毒引物和探针在联检体系中的检测结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下表1所示：
其中，新型冠状病毒2019-nCoV探针的荧光报告基团为FAM；乙型流感病毒探针的荧光报告基团为HEX；呼吸道腺病毒探针的荧光报告基团为ROX，探针的3’末端还具有BHQ1或BHQ2猝灭基团。
人副流感病毒I型、II型、III型和IV型上游引物的荧光报告基团为FAM；甲型流感病毒上游引物的荧光报告基团为HEX；呼吸道合胞病毒上游引物的荧光报告基团为ROX；偏肺病毒的荧光报告基团为CY5。荧光引物基团的荧光报告基团均标记在引物中的一个T碱基上。
实施例2、检测呼吸道相关病毒并分型的方法
本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。磁珠法提取病毒核酸，在样本处理室进行如下操作：
2.1 取适量1.5 mL灭菌离心管，分别标记阴性对照、阳性对照及待测样本，每管加入300μL RNA提取溶液1；
2.2 每管加入200μL待测样本或阴性对照、阳性对照；盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；
2.3 每管加入100μL RNA提取溶液2-mix（充分混匀后吸取），震荡混匀10秒钟后，室温静置10分钟；
2.4 瞬时离心后将离心管置于分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出（注意不要碰到吸附于管壁的棕色物）；
2.5 每管加入600μL RNA提取溶液3和200μL RNA提取溶液4，震荡混匀5秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；
2.6 约3分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃；
2.7 每管加入50μL PCR-mix，用吸头吸取PCR-mix洗脱吸附于离心管壁的棕色残留物，反复几次尽量将其完全洗脱，然后将洗脱后的全部棕色混合液转移至0.2mL PCR反应管中，盖上管盖，转移到扩增检测区。
实时荧光PCR反应体系按照如下进行配置：
PCR扩增程序如下进行设置：
结果分析：
1）目的检测信号为FAM，HEX（或VIC）及ROX，内参检测信号为CY5；
2）Baseline的设置：Baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点（Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点（End）比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。Threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；
3）先分析内标在CY5通道是否检测扩增曲线，且Ct≤39，若有，表示本次检测有效，继续进行后续分析：
A)若FAM通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct＜39，表示新型冠状病毒2019-nCoV检测结果为阳性；若FAM通道检测到Tm（66.1±1.0℃）特征峰，表示人副流感病毒I型检测结果为阳性；若FAM通道检测到Tm（71.0±1.0℃）特征峰，表示人副流感病毒II型检测结果为阳性；若FAM通道检测到Tm（75.7±1.0℃）特征峰，表示人副流感病毒III型检测结果为阳性；若FAM通道检测到Tm（81.6±1.0℃）特征峰，表示人副流感病毒IV型检测结果为阳性；
B）若HEX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct＜40，表示乙型流感病毒检测结果为阳性；若HEX通道检测到Tm（67.0±1.0℃）特征峰，表示甲型流感病毒为阳性；
C）若ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct＜40，表示腺病毒检测结果为阳性；若ROX通道检测到Tm（70.5±1.0℃）特征峰，表示呼吸道合胞病毒检测结果为阳性；
D）若CY5通道检测到Tm（68.0±1.0℃）特征峰，表示偏肺病毒检测结果为阳性；
4）若内标在CY5通道没有检测到Ct或Ct＞39，表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新准备实验。
实施例3、本发明组合物测试阳性对照的检测结果
使用本发明表1的组合物，按照实施例2所述的方法，对各个靶标阳性质粒进行检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测，结果如图1~4所示。从图中可以看出，荧光探针法和熔解曲线法均能能够检测出对应靶标，证明本发明组合物能够检测呼吸道相关病毒并分型。
实施例4、本发明组合物灵敏度实验
使用本发明表1的组合物，按照实施例2所述的方法，对各个靶标阳性质粒最低浓度在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测，结果如图5~12所示。从图中可以看出，荧光探针法和熔解曲线法均能能够检测出对应靶标，证明本发明组合物灵敏度为500拷贝/ml。
实施例5、本发明组合物特异性实验
使用本发明表1的组合物，按照实施例2所述的方法，对核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状的病原体（如冠状病毒（NL63，HKU1，229E，OC43）、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、肠病毒A、B型、肠病毒C型（EV-C95）、肠病毒D型（EV-D70）、人间质肺病毒、新生隐球菌、化脓性性链球菌、鲍曼不动杆菌、肺孢子虫、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎衣原体、EB病毒、人巨细胞病毒、烟曲霉、白色念球菌、光滑念珠菌、结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、诺如病毒、轮状病毒、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒等）在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测，结果如图13所示。从图中可以看出，荧光探针法和熔解曲线法检测均为阴性，证明本发明组合物有很好的特异性。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
在引物和探针设计过程中，发明人还设计了其余的引物和探针（所述表2中编号为2的构成一个组合物，编号为3的构成另一个组合物）同样用于检测所述病毒。具体序列如以下表2所示，在宏石荧光定量PCR仪器上使用阳性对照质粒进行PCR检测，结果如图14~27所示。从图中可以看出：
新型冠状病毒2019-nCoV用本发明的组合物检测时，Ct值在25左右；用对比例表2中的新型冠状病毒2019-nCoV 2检测时，Ct值在33左右，用对比例表2中的新型冠状病毒2019-nCoV 3检测时，Ct值在35左右。
乙型流感病毒用本发明的组合物检测时，Ct值在24左右；用对比例表2中的乙型流感病毒2检测时，Ct值在35左右，用对比例表2中的乙型流感病毒3检测时，Ct值在26左右。
呼吸道腺病毒用本发明的组合物检测时，Ct值在25左右；用对比例表2中的呼吸道腺病毒2检测时，Ct值在30左右，用对比例表2中的呼吸道腺病毒3检测时，无扩增曲线。
内标用本发明的组合物检测时，Ct值在26左右；用对比例表2中的内标2检测时，Ct值在36左右，用对比例表2中的内标3检测时，Ct值在37左右。
甲型流感病毒用表1中的组合物检测时，特征峰明显；用对比例表2中的甲型流感病毒2检测时，特征峰较不明显；用对比例表2中的甲型流感病毒3检测时，特征峰较不明显。
呼吸道合胞病毒用表1中的组合物检测时，特征峰明显；用对比例表2中的呼吸道合胞病毒2检测时，特征峰仅较为明显；用对比例表2中的呼吸道合胞病毒3检测时，特征峰较不明显。
偏肺病毒用表1中的组合物检测时，特征峰明显；用对比例表2中的偏肺病毒2检测时，特征峰较不明显；用对比例表2中的偏肺病毒3检测时，无特征峰。
从图中可以看出，对比例的引物和探针不能很好的对各个病毒进行检测。
同时在对比引物探针表2的引物探针组合中：新型冠状病毒2019-nCoV-2（引物探针）、乙型流感病毒-2（引物探针）、呼吸道腺病毒-2（引物探针）、甲型流感病毒-2（引物探针）、偏肺病毒-2（引物探针）、内标-2（引物探针），此八个靶点组合的引物探针体系在阴性检测的时候会有非特异性的扩增，容易形成假阳性，如图28所示。
由此可见在多重荧光PCR体系的构建中，并非简单将单靶点引物探针组合即可得到成功的多重检测体系，稳定的多重体系设计和构建需要多次调整和优化。
对比例2、多种病原体联检，引物探针之间的相互干扰
多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性（保守性对检测的准确性至关重要），又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
为了进一步说明本发明组合物的优越性，本发明进一步继续了以下实验，首先，发明人验证了单独使用新冠检测和呼吸道腺病毒的引物和探针的检测效率：
分别使用新型冠状病毒2019-nCoV上下游引物和探针、新型冠状病毒2019-nCoV上下游引物和探针2、新型冠状病毒2019-nCoV上下游引物和探针3，以及新型冠状病毒2019-nCoV上下游引物和探针4（表3），对新冠病毒阳性质粒进行检测，实验结果如图29所示。
分别使用呼吸道腺病毒上下游引物和探针、呼吸道腺病毒上下游引物和探针2、呼吸道腺病毒上下游引物和探针3，以及呼吸道腺病毒上下游引物和探针4（表4），对呼吸道腺病毒阳性质粒进行检测，实验结果如图30所示。
从图29和30的结果可以看出，实际上新型冠状病毒2019-nCoV上下游引物和探针，和新型冠状病毒2019-nCoV上下游引物和探针2，以及呼吸道腺病毒上下游引物和探针，和呼吸道腺病毒上下游引物和探针2在单独检测靶标序列时，Ct值是相当的，也就是说其单独的检测效果是相当的。
但是，将新型冠状病毒2019-nCoV上下游引物和探针和新型冠状病毒2019-nCoV上下游引物和探针2分别与本发明表1当中的组合物的其余引物探针进行组合时，结果却发现新型冠状病毒2019-nCoV上下游引物和探针2却受到了联合检测体系的影响，Ct值较为靠后，检测效果比新型冠状病毒2019-nCoV上下游引物和探针差，实验结果如图31所示。
同理，也发现呼吸道腺病毒上下游引物和探针2也受到了联合检测体系的影响，Ct值较为靠后，检测效果比呼吸道腺病毒上下游引物和探针差，实验结果如图32所示。
因此，证明本发明所寻找到的特点的引物和探针的组合，在检测方面有着更高的灵敏度优势。
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 检测10种呼吸道相关病毒并分型的组合物、试剂盒、用途及方法
<160> 66
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtatttcta ctacctagga act 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttggtgtatt caaggctccc 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccagaagctg gacttcccta tggtgc 26
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagctgccta tgaagacctg a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctcccattc cttctacctg 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tttgctggaa catggaaacc ctt 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaacaaattt agaaacccca ca 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aagcactctg ttgtcgccta 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgaccaccga tcgtagccag cgc 23
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tataatcaaa aatgtaacag ctagatca 28
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctaggatctc gtgagctact ctg 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aactccagtg aacaggctgc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtgcatgtca gacaatgggc 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctcaatccca caggaagcat tgt 23
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgtgtaatgc agcttgttgt tgtata 26
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tgtgtaatgc agcttgttgt tgtata 26
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gtgtaaccag cagatttact ga 22
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cttctaaccg aggtcgaaac gta 23
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ggtgacagga ttggtcttgt cttta 25
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cctaattgta tagcattcat aggtgaa 27
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ttcagcaaac tttatatgta aataagacc 29
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aaaacaatgg tgactttgct aa 22
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctagggtatc ttttgagtgc atc 23
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gaggtgggac ttcagcatgg c 21
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgtttctttt ccttaaagtc aac 23
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tgcagatttg gacctgcgag cgggttct 28
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gccccaaggt ttacccaat 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
aggtcttcct tgccatgttg 20
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
actgcgtctt ggttcaccgc tctca 25
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ggccgcaaat tgcacaat 18
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gtgtgacttc catgccaatg c 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cccccagcgc ttcagcgttc tt 22
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
taaatcacat aatgattggg cattc 25
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ccygcaaagg tactgattaa tgaagg 26
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cagatgaatg atgtctgttt ccaaagatca a 31
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
atggctcttt acaatatggc aacac 25
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
caaaactctc aggtcttcat aggc 24
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ctccraagca agacatgaag aataattg 28
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
aaatggctga agaacttgaa gatg 24
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ggagcctgag catatacatg agtct 25
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
aggcagaagc accacaagct gatcaga 27
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gcaaacaacc aaggtgctct ag 22
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ggctgaacag catttctttc att 23
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tgaaatgcag ttttttgccc cctctg 26
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
atggaatggc taaagacaag ac 22
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gcattttgga caaagcgtct 20
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ctaaccgagg tcgaaacgt 19
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ttagccattc catgagagcc t 21
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
ttcacgargg ctccacat 18
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
tcaattggtt gattgattgg tt 22
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
aacaaaaaga tacwatcaaa acaacact 28
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
acctcactag atcgataytg tgt 23
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gtctcttcaa gggattcacc 20
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gttgttgtgc ctacatctc 19
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
acaccttcat cattgcagca ag 22
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
agaaccacct gaacttcact gcctg 25
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
gccaagtgtg agggctg 17
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
ggctgatgaa ctataaaagg gaag 24
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
aatgccccag tctctgtcag cactcc 26
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
ctcggatcca tctcactgc 19
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
ttggaaaaac tgcaacaaca tcat 24
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
caacttcttc aagggcccgg ct 22
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
agaaaaccac ataagttccg agg 23
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
agttactatc agcccttcct 20
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
cttcgatttg ggccatgcta tcct 24
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
tctaaacaaa tactggaatt tggggcac 28
Claims (10)
1.一种能够检测呼吸道相关病毒并分型的组合物，所述组合物同时包括：
第一组：
如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒2019-nCoV上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型冠状病毒2019-nCoV下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针；
如SEQ ID NO:4所示的乙型流感病毒上游引物、如SEQ ID NO:5所示的乙型流感病毒下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的乙型流感病毒探针；和
如SEQ ID NO:7所示的呼吸道腺病毒上游引物、如SEQ ID NO:8所示的呼吸道腺病毒下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的呼吸道腺病毒探针；以及
第二组：
如SEQ ID NO:10所示的人副流感病毒I型上游引物和如SEQ ID NO:11所示的人副流感病毒I型下游引物；
如SEQ ID NO:12所示的人副流感病毒II型上游引物和如SEQ ID NO:13所示的人副流感病毒II型下游引物；
如SEQ ID NO:14所示的人副流感病毒III型上游引物和如SEQ ID NO:15所示的人副流感病毒III型下游引物；
如SEQ ID NO:16所示的人副流感病毒IV型上游引物和如SEQ ID NO:17所示的人副流感病毒IV型下游引物；
如SEQ ID NO:18所示的甲型流感病毒上游引物和如SEQ ID NO:19所示的甲型流感病毒下游引物；
如SEQ ID NO:20所示的呼吸道合胞病毒上游引物和如SEQ ID NO:21所示的呼吸道合胞病毒下游引物；和
如SEQ ID NO:22所示的偏肺病毒上游引物和如SEQ ID NO:23所示的偏肺病毒下游引物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物的第一组进一步包括如SEQ ID NO:24所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:25所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:26所示的内标探针。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，第一组的探针上带有荧光报告基团，第二组的每一对的上游引物和/或下游引物带有荧光报告基团，并且第一组内探针的荧光报告基团彼此互不相同且互不干扰，并且第二组内人副流感病毒的荧光报告基团一致，但与其余每一对的荧光报告基团彼此互不相同且互不干扰。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，如SEQ ID NO:3所示的新型冠状病毒2019-nCoV探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:6所示的乙型流感病毒探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO:9所示的呼吸道腺病毒探针的荧光报告基团为ROX；如SEQ ID NO:10所示的人副流感病毒I型上游引物的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:12所示的人副流感病毒II型上游引物的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:14所示的人副流感病毒III型上游引物的荧光报告基团为FAM；SEQ ID NO:16所示的人副流感病毒IV型上游引物的荧光报告基团为FAM；SEQ ID NO:18所示的甲型流感病毒上游引物的荧光报告基团为HEX；SEQ ID NO:20所示的呼吸道合胞病毒上游引物的荧光报告基团为ROX；SEQ ID NO:22所示的偏肺病毒上游引物的荧光报告基团为CY5。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的各成分存在于同一个包装中。
6.权利要求1~5中任一项所述的组合物在制备检测呼吸道相关病毒并分型的试剂盒中的用途。
7.一种用于检测呼吸道相关病毒并分型的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1~5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述组合物中引物的用量为50~150nM；所述组合物中探针的用量为25~75nM。
10.一种用于检测呼吸道相关病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
1）释放待测样本的核酸；优选地，所述样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液；
2）使用如权利要求1~5中任一项所述的组合物对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
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