CN112553380A - 一种利用多重pcr技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用 - Google Patents

一种利用多重pcr技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用，属于基因工程技术领域。为了解决目前对于12种呼吸道病毒生物分类困难，特异性差的难题，本发明对NCBI已发布的12种呼吸道病毒基因组信息的分析，得到特异性高、保守性好的各呼吸道病毒的基因作为靶基因，并根据靶基因设计多重引物和探针，进而通过优化获得多重PCR反应体系，得到了一种可以快速检测12种呼吸道病毒的方法，利用该方法可以实现通过一次PCR快速检测出样品中是否含有12种呼吸道病毒。

Description

一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其 应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用。
背景技术
传染病是一类让国际卫生组织及各大医院、疾病控制中心对之时刻保持高度警惕的一类疾病，可以在人与人，动物与动物，人与动物之间相互感染传播。传染病的暴发和流行对人类的生命财产构成了巨大的威胁，传染病可以在很短时间内就能在全球各个城市大范围的流行，严重威胁人类。尤其是呼吸道病毒引发的疾病，如何高效鉴别疑似，做到“早发现，早诊断，早隔离，早治疗”，成为病毒感染治疗的关键手段；尤其是2020年新冠病毒的出现和暴发，让我们认识到病毒分类和检测的重要意义。
发明内容
本发明为了解决目前对于12种呼吸道病毒生物分类困难，特异性差的难题，提供了一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一、通过分别对NCBI已发布的12种呼吸道病毒的基因组信息的分析，得到具有特异性高和保守性的各呼吸道病毒的基因作为靶基因；
步骤二、基于步骤一获得的靶基因设计多重引物及探针；
步骤三、利用步骤二获得的多重引物进行多重PCR反应体系及条件的优化，获得多重PCR反应体系和条件。
进一步地限定，所述12种呼吸道病毒为：2019-nCoV、HCoV229E、HCoVOC43、HCoVNL63、SARS、MERS、HKU1、RNA人偏肺病毒、RNA甲型流感病毒、RNA乙型流感病毒、RNA副流感病毒和RNA呼吸道合胞病毒。
进一步地限定，步骤一所述靶基因的获得方法具体为：
(1)对NCBI已发布的12种呼吸道病毒基因组信息分别进行共线性分析，得到基因组中特异性的基因；
(2)通过比较基因组学分析确定基因组中特异性基因与NCBI库中不具有同源特异性的序列作为候选基因；
(3)将候选基因在目的病毒基因组数据中进行检索，确定上下游基因保守性，避开高突变区域，用简并碱基的形式标注出变异性的碱基；
(4)对候选基因进行验证，将具有特异性和保守性的候选序列作为靶基因。
进一步地限定，步骤二所述多重引物为：
2019-nCov病毒靶基因的上下游引物：
2019-nCoV ORF1ab 1 W1 F序列如SEQ ID No.1所示；
2019-nCoV ORF1ab 1 W1 R序列如SEQ ID No.2所示；
2019-nCoV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.3所示；
2019-nCoV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.4所示；
HCoV229E病毒靶基因的上下游引物：
HCoV229E N 1 W1 F序列如SEQ ID No.5所示；
HCoV229E N 1 W1 R序列如SEQ ID No.6所示；
HCoVOC43病毒靶基因的上下游引物：
HCoVOC43 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.7所示；
HCoVOC43 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.8所示；
HCoVNL63病毒靶基因的上下游引物：
HCoVNL63 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.9所示；
HCoVNL63 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.10所示；
SARS病毒靶基因的上下游引物：
SARS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.11所示；
SARS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.12所示；
MERS病毒靶基因的上下游引物：
MERS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.13所示；
MERS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.14所示；
HKU1病毒靶基因的上下游引物：
HKU1 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.15所示；
HKU1 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.16所示；
RNA人偏肺病毒靶基因的上下游引物：
HMPV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.17所示；
HMPV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.18所示；
RNA甲型流感病毒靶基因的上下游引物：
H3N2 M 1 W1 F序列如SEQ ID No.19所示；
H3N2 M 1 W1 R序列如SEQ ID No.20所示；
H1N1 HA 2 W1 F序列如SEQ ID No.21所示；
H1N1 HA 2 W1 R序列如SEQ ID No.22所示；
H3N2 HA 1 W1 F序列如SEQ ID No.23所示；
H3N2 HA 1 W1 R序列如SEQ ID No.24所示；
H1N1 M 2 W1 F序列如SEQ ID No.25所示；
H1N1 M 2 W1 R序列如SEQ ID No.26所示；
RNA乙型流感病毒靶基因的上下游引物：
IFB NP 1 W1 F序列如SEQ ID No.27所示；
IFB NP 1 W1 R序列如SEQ ID No.28所示；
IFB NP 2 W1 F序列如SEQ ID No.29所示；
IFB NP 2 W1 R序列如SEQ ID No.30所示；
RNA副流感病毒靶基因的上下游引物：
HPIV4 NP 1 W1 F序列如SEQ ID No.31所示；
HPIV4 NP 1 W1 R序列如SEQ ID No.32所示；
RNA呼吸道合胞病毒靶基因的上下游引物：
RSVN 1 W1 F序列如SEQ ID No.33所示；
RSVN 1 W1 R序列如SEQ ID No.34所示；
进一步地限定，步骤二所述探针为：
H3N2 M 1 W1 E：TGTTCACGCTCACCG
2019-nCoV ORF1ab 1 W1 E：GTGTAAGACGGGCTG
2019-nCoV N 1 W1 E：CAACAAGGCCAAACTG
H1N1 HA 2 W1 E：cAGCATAACGGGAAACTAT
MERS N 1 W1 E：ccctAGTTTCTGCTTACGCT
HPIV4 NP 1 W1 E：cTTGGCAGATGATGATACAG
HMPV N 1 W1 E：gTGCTGCAGAAATAGGAATA
H3N2 HA 1 W1 E：ACTGCACACTAATAGATGCTC
SARS N 1 W1 E：ccctCTCCTTGCCATGCTGAGT
HCoVOC43 N 1 W1 E：gagaGTCCTCTGGAAATCGGTC
IFB NP 1 W1 E：catttCTCTAAGCAAACAAGCTG
IFB NP 2 W1 E：gagGGAAACCCTTGCATTTTAAT
HCoVNL63 N 1 W1 E：ccATTGGTAAGGGTAATAAAGATG
HCoV229E N 1 W1 E：accGCAACCCAGACGACACCTTCAAC
RSV N 1 W1 E：gAATGTTCTAAAAAATGAAATGAAAC
HKU1 N 1 W1 E：ggacAACCCCAACCCAAATTCACTGTG
H1N1 M 2 W1 E：gatttGTGGTAGTAGCCATCTGTCTGTG
进一步地限定，步骤三所述多重PCR反应体系由0.5μL多重PCR缓冲液，0.4μL氯化镁缓冲液，0.1μL dNTP混合物，0.2μL多重PCR酶，1μL PCR引物混合物和2.8μL纯化后的核酸组成。
进一步地限定，步骤三所述多重PCR反应条件为95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃60s 45个循环；72℃5min；4℃保温。
本发明还提供了利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法在制备用于快速检测12种呼吸道病毒的试剂盒中的应用。
有益效果
本发明通过分别12种呼吸道病毒全基因组的分析，获得了特异性高、保守性好的各呼吸道病毒的靶基因，解决了目前对于12种病毒生物分类困难，特异性差的难题，提供了一种能够通过一次PCR就能够快速检测出12种呼吸道病毒的方法，利用该方法可以制成PCR试剂盒用于12种呼吸道病毒的快速检测。
附图说明
图1：新冠病毒2019-ncoV的基因比对分析结果；
图2：2019-ncoV ORF1ab基因的特异性和保守性验证；
图3：HCoV229E N基因的特异性和保守性验证；
图4：RNA甲型流感病毒HA基因的特异性和保守性验证。
具体实施方式：
步骤一、通过分别对NCBI已发布的12种呼吸道病毒的基因组信息的分析，得到特异性高、保守性好的各呼吸道病毒的基因作为靶基因：
1)通过NCBI已发布的12种病毒的基因组信息，查找每类病毒的不同的基因组序列；然后对基因组序列使用DNAMAN软件进行基因组序列比对，其中图1为新冠病毒2019-ncoV的基因组序列比对分析结果。
2)检索出基因组特异性的基因，并且通过blast软件和nt数据库进行比对，确定其与NCBI库中不具有同源的特异性基因序列作为候选基因，这些特异性序列和同源病毒的同源性不高于60％。
3)将候选基因在的目的病毒基因组数据中进行检索，确定其上下游基因保守性；选择保守片段序列避开高突变区域，如有变异性较高的碱基需要用简并碱基的形式标注出来。其中2019-nCov病毒的候选基因为orf1ab和N基因，其余6种新冠病毒(HCoV229E、HCoVOC43、HCoVNL63、SARS、MER、HKU1)的候选基因为N和M基因，RNA人偏肺病毒的候选基因为N和F基因，RNA甲型流感病毒的候选基因为M、HA和N基因，RNA乙型流感病毒的候选基因为HA基因，RNA副流感病毒的候选基因为H和HN基因、RNA呼吸道合胞病毒的候选基因为N基因，其中N蛋白对于病毒基因组RNA特征序列的识别及其与其它结构蛋白的相互作用，对于病毒粒子的准确组装有着重要意义，N蛋白可用于特异性识别患者样本中的病毒靶点抗原，所以N基因和N蛋白常作为冠状病毒的检测诊断工具。
4)对候选基因进行验证，检测候选基因是否表达，并将准确性高、特异性高、保守性好的基因作为靶基因。
步骤二、基于步骤一获得的靶基因设计多重引物及探针：
采用基因合成的方法将挑选出来的靶基因进行合成，作为检测的底物，同时根据获得的靶基因，使用在线多重引物设计网站进行引物设计，网站网址：https:// agenacx.com/，设计完成后，下载相应的序列，进行引物及探针合成。
得到的多重引物为：
2019-nCov病毒靶基因的上下游引物：
2019-nCoV ORF1ab 1 W1 F序列如SEQ ID No.1所示；
2019-nCoV ORF1ab 1 W1 R序列如SEQ ID No.2所示；
2019-nCoV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.3所示；
2019-nCoV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.4所示；
HCoV229E病毒靶基因的上下游引物：
HCoV229E N 1 W1 F序列如SEQ ID No.5所示；
HCoV229E N 1 W1 R序列如SEQ ID No.6所示；
HCoVOC43病毒靶基因的上下游引物：
HCoVOC43 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.7所示；
HCoVOC43 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.8所示；
HCoVNL63病毒靶基因的上下游引物：
HCoVNL63 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.9所示；
HCoVNL63 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.10所示；
SARS病毒靶基因的上下游引物：
SARS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.11所示；
SARS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.12所示；
MERS病毒靶基因的上下游引物：
MERS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.13所示；
MERS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.14所示；
HKU1病毒靶基因的上下游引物：
HKU1 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.15所示；
HKU1 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.16所示；
RNA人偏肺病毒靶基因的上下游引物：
HMPVN 1 W1 F序列如SEQ ID No.17所示；
HMPVN 1 W1 R序列如SEQ ID No.18所示；
RNA甲型流感病毒靶基因的上下游引物：
H3N2 M 1 W1 F序列如SEQ ID No.19所示；
H3N2 M 1 W1 R序列如SEQ ID No.20所示；
H1N1 HA 2 W1 F序列如SEQ ID No.21所示；
H1N1 HA 2 W1 R序列如SEQ ID No.22所示；
H3N2 HA 1 W1 F序列如SEQ ID No.23所示；
H3N2 HA 1 W1 R序列如SEQ ID No.24所示；
H1N1 M 2 W1 F序列如SEQ ID No.25所示；
H1N1 M 2 W1 R序列如SEQ ID No.26所示；
RNA乙型流感病毒靶基因的上下游引物：
IFB NP 1 W1 F序列如SEQ ID No.27所示；
IFB NP 1 W1 R序列如SEQ ID No.28所示；
IFB NP 2 W1 F序列如SEQ ID No.29所示；
IFB NP 2 W1 R序列如SEQ ID No.30所示；
RNA副流感病毒靶基因的上下游引物：
HPIV4 NP 1 W1 F序列如SEQ ID No.31所示；
HPIV4 NP 1 W1 R序列如SEQ ID No.32所示；
RNA呼吸道合胞病毒靶基因的上下游引物：
RSVN 1 W1 F序列如SEQ ID No.33所示；
RSVN 1 W1 R序列如SEQ ID No.34所示；
探针为：
H3N2 M 1 W1 E：TGTTCACGCTCACCG
2019-nCoV ORF1ab 1 W1 E：GTGTAAGACGGGCTG
2019-nCoV N 1 W1 E：CAACAAGGCCAAACTG
H1N1 HA 2 W1 E：cAGCATAACGGGAAACTAT
MERS N 1 W1 E：ccctAGTTTCTGCTTACGCT
HPIV4 NP 1 W1 E：cTTGGCAGATGATGATACAG
HMPV N 1 W1 E：gTGCTGCAGAAATAGGAATA
H3N2 HA 1 W1 E：ACTGCACACTAATAGATGCTC
SARS N 1 W1 E：ccctCTCCTTGCCATGCTGAGT
HCoVOC43 N 1 W1 E：gagaGTCCTCTGGAAATCGGTC
IFB NP 1 W1 E：catttCTCTAAGCAAACAAGCTG
IFB NP 2 W1 E：gagGGAAACCCTTGCATTTTAAT
HCoVNL63 N 1 W1 E：ccATTGGTAAGGGTAATAAAGATG
HCoV229E N 1 W1 E：accGCAACCCAGACGACACCTTCAAC
RSVN 1 W1 E：gAATGTTCTAAAAAATGAAATGAAAC
HKU1 N 1 W1 E：ggacAACCCCAACCCAAATTCACTGTG
H1N1 M 2 W1 E：gatttGTGGTAGTAGCCATCTGTCTGTG
序列验证：
采用核酸质谱的方法进行序列验证，质谱平台基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，其原理是将待测DNA进行PCR扩增，所得PCR扩增产物用虾碱酶纯化去除未结合的dNTPs，然后利用PCR对扩增产物进行单碱基延伸，延伸后通过磁珠富集延伸产物，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对延伸产物进行检测，通过区分飞行时间长短来进行分析数据。最后通过计算机软件分析判断目标区域序列是否发生改变，进而用于临床辅助诊断。验证的数据见图2-4，图2-4分别为2019-ncoV ORF1ab基因、HCoV229E N基因和RNA甲型流感病毒HA基因的特异性和保守性验证结果，从图中可以看出设计的候选基因的特异性和保守性、能够很好的把相应的病毒准确的检测。
步骤三、利用步骤三所述的多重引物进行多重PCR反应体系及条件的优化，获得多重PCR反应体系和条件。
优化3种成分扩增过程中的投入量，一是多重PCR酶，二是投入的纯化后的核酸的量、三是投入的PCR引物混合物的量。具体见下表：
成分 多重PCR酶(μL) 核酸的量(μL) PCR引物混合物(μL)
1 0.1 2 0.8
2 0.15 2.5 0.9
3 0.2 2.6 1
4 0.25 2.7 1.1
5 0.3 2.8 1.2
6 0.35 3 1.3
经过216轮测试发现，多重PCR酶(μL)为0.2，核酸的量(μL)为2.8，PCR引物混合物(μL)为1时，扩增效率最优。
扩增条件主要是优化退火温度，采用梯度PCR的方法，设置51、52、53、54、55、56、57、58℃的扩增梯度，经过测试后发现，在56摄氏度时，扩增效率最优。
优化后得到的多重PCR反应体系如下：由0.5μL多重PCR缓冲液，0.4μL氯化镁缓冲液，0.1μL dNTP混合物，0.2μL多重PCR酶，1μLPCR引物混合物和2.8μL纯化后的核酸组成。
优化后得到的多重PCR反应条件如下：
Figure BDA0002881112550000061
SEQ ID No.1
名称：2019-nCoV ORF1ab 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGAGTCAGCTGATGCACAATCG-3’；
SEQ ID No.2
名称：2019-nCoV ORF1ab 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGATCAGTACTAGTGCCTGTGC-3’
SEQ ID No.3
名称：2019-nCoV N 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGGTCTGGTAAAGGCCAACAAC-3’
SEQ ID No.4
名称：2019-nCoV N 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGAGGCTTCTTAGAAGCCTCAG-3’
SEQ ID No.5
名称：HCoV229E N 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGATTATCTTGGCACAGGACCC-3’
SEQ ID No.6
名称：HCoV229E N 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGTAGCACCATCAACAGCAACC-3’
SEQ ID No.7
名称：HCoVOC43 N 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGAGCAATCCAGTAGTAGAGCG-3’
SEQ ID No.8
名称：HCoVOC43 N 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGAAATTGGTCGGACTGATCGG-3’
SEQ ID No.9
HCoVNL63 N 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGATTCCCAGGAATCTTGTCCC-3’
SEQ ID No.10
名称：HCoVNL63 N 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGGCCAACGCTCTTGAACATTC-3’
SEQ ID No.11
名称：SARS N 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGCCCAATAATACTGCGTCTTG-3’
SEQ ID No.12
名称：SARS N 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGCCTCGAGGGAATCTAAGTTC-3’
SEQ ID No.13
名称：MERS N 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGGGAGGCAATAGTCAATCATC-3’
SEQ ID No.14
名称：MERS N 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGTCCTGATCTTGAACCTTGTG-3’
SEQ ID No.15
名称：HKU1 N 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGTCTGAGCGAAGCCATCAAAC-3’
SEQ ID No.16
名称：HKU1 N 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGTGGGATAGGGTTTCCTTGTG-3’
SEQ ID No.17
名称：HMPV N 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGCACTGTTGTGTGGAGAAATTC-3’
SEQ ID No.18
名称：HMPV N 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGTCTCTGACCCTAGAGCTGTG-3’
SEQ ID No.19
名称：H3N2 M 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGGACCAATTCTGTCACCTCTG-3’
SEQ ID No.20
名称：H3N2 M 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3’
SEQ ID No.21
名称：H1N1 HA 2 W1 F
5’-ACGTTGGATGTAGAAGACAAGCATAACGGG-3’
SEQ ID No.22
名称：H1N1 HA 2 W1 R
5’-ACGTTGGATGGATCCAGCCAGCAATGTTAC-3’
SEQ ID No.23
名称：H3N2 HA 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGCCTCATCAGATCCTTGATGG-3’
SEQ ID No.24
名称：H3N2 HA 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGTTGGAAGCCATCACACTGAG-3’
SEQ ID No.25
名称：H1N1 M 2 W1 F
5’-ACGTTGGATGGCCACTTGTGAACAGATTGC-3’
SEQ ID No.26
名称：H1N1 M 2 W1 R
5’-ACGTTGGATGGCCTGATTAGTGGATTGGTG-3’
SEQ ID No.27
名称：IFB NP 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGTGCAGTGGAGAGACCTATTG-3’
SEQ ID No.28
名称：IFB NP 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGCATCACGCCCCTCAATATTC-3’
SEQ ID No.29
名称：IFB NP 2 W1 F
5’-ACGTTGGATGGACCTGAGAGTTTTGTCTGC-3’
SEQ ID No.30
名称：IFB NP 2 W1 R
5’-ACGTTGGATGTGGAACATGGAAACCCTTGC-3’
SEQ ID No.31
名称：HPIV4 NP 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGGATCCACAGCAAAGATTCAC-3’
SEQ ID No.32
名称：HPIV4 NP 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGCTTAATCGCCGATTTGGCAG-3’
SEQ ID No.33
名称：RSV N 1 W1 F
5’-ACGTTGGATGGATCTGGTCTTACAGCTGTG-3’
SEQ ID No.34
名称：RSV N 1 W1 R
5’-ACGTTGGATGTATCCTTTGGTAGTAAGCCC-3’
序列表
<110> 哈尔滨星云医学检验所有限公司
<120> 一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法及其应用
<130>
<160> 51
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 2019-nCoV ORF1ab 1 W1 F
<400> 1
acgttggatg agtcagctga tgcacaatcg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 2019-nCoV ORF1ab 1 W1 R
<400> 2
acgttggatg atcagtacta gtgcctgtgc 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 2019-nCoV N 1 W1 F
<400> 3
acgttggatg gtctggtaaa ggccaacaac 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 2019-nCoV N 1 W1 R
<400> 4
acgttggatg aggcttctta gaagcctcag 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> HCoV229E N 1 W1 F
<400> 5
acgttggatg attatcttgg cacaggaccc 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> HCoV229E N 1 W1 R
<400> 6
acgttggatg tagcaccatc aacagcaacc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> HCoVOC43 N 1 W1 F
<400> 7
acgttggatg agcaatccag tagtagagcg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> HCoVOC43 N 1 W1 R
<400> 8
acgttggatg aaattggtcg gactgatcgg 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> HCoVNL63 N 1 W1 F
<400> 9
acgttggatg attcccagga atcttgtccc 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> HCoVNL63 N 1 W1 R
<400> 10
acgttggatg gccaacgctc ttgaacattc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> SARS N 1 W1 F
<400> 11
acgttggatg cccaataata ctgcgtcttg 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> SARS N 1 W1 R
<400> 12
acgttggatg cctcgaggga atctaagttc 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> MERS N 1 W1 F
<400> 13
acgttggatg ggaggcaata gtcaatcatc 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> MERS N 1 W1 R
<400> 14
acgttggatg tcctgatctt gaaccttgtg 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> HKU1 N 1 W1 F
<400> 15
acgttggatg tctgagcgaa gccatcaaac 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> HKU1 N 1 W1 R
<400> 16
acgttggatg tgggataggg tttccttgtg 30
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> HMPV N 1 W1 F
<400> 17
acgttggatg cactgttgtg tggagaaatt c 31
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> HMPV N 1 W1 R
<400> 18
acgttggatg tctctgaccc tagagctgtg 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> H3N2 M 1 W1 F
<400> 19
acgttggatg gaccaattct gtcacctctg 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> H3N2 M 1 W1 R
<400> 20
acgttggatg aaagcgtcta cgctgcagtc 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> H1N1 HA 2 W1 F
<400> 21
acgttggatg tagaagacaa gcataacggg 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> H1N1 HA 2 W1 R
<400> 22
acgttggatg gatccagcca gcaatgttac 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> H3N2 HA 1 W1 F
<400> 23
acgttggatg cctcatcaga tccttgatgg 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> H3N2 HA 1 W1 R
<400> 24
acgttggatg ttggaagcca tcacactgag 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> H1N1 M 2 W1 F
<400> 25
acgttggatg gccacttgtg aacagattgc 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> H1N1 M 2 W1 R
<400> 26
acgttggatg gcctgattag tggattggtg 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> IFB NP 1 W1 F
<400> 27
acgttggatg tgcagtggag agacctattg 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> IFB NP 1 W1 R
<400> 28
acgttggatg catcacgccc ctcaatattc 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> IFB NP 2 W1 F
<400> 29
acgttggatg gacctgagag ttttgtctgc 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> IFB NP 2 W1 R
<400> 30
acgttggatg tggaacatgg aaacccttgc 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> HPIV4 NP 1 W1 F
<400> 31
acgttggatg gatccacagc aaagattcac 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> HPIV4 NP 1 W1 R
<400> 32
acgttggatg cttaatcgcc gatttggcag 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> RSV N 1 W1 F
<400> 33
acgttggatg gatctggtct tacagctgtg 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> RSV N 1 W1 R
<400> 34
acgttggatg tatcctttgg tagtaagccc 30
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> H3N2 M 1 W1 E
<400> 35
tgttcacgct caccg 15
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> 2019-nCoV ORF1ab 1 W1 E
<400> 36
gtgtaagacg ggctg 15
<210> 37
<211> 16
<212> DNA
<213> 2019-nCoV N 1 W1 E
<400> 37
caacaaggcc aaactg 16
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> H1N1 HA 2 W1 E
<400> 38
cagcataacg ggaaactat 19
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> MERS N 1 W1 E
<400> 39
ccctagtttc tgcttacgct 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> HPIV4 NP 1 W1 E
<400> 40
cttggcagat gatgatacag 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> HMPV N 1 W1 E
<400> 41
gtgctgcaga aataggaata 20
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> H3N2 HA 1 W1 E
<400> 42
actgcacact aatagatgct c 21
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> SARS N 1 W1 E
<400> 43
ccctctcctt gccatgctga gt 22
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> HCoVOC43 N 1 W1 E
<400> 44
gagagtcctc tggaaatcgg tc 22
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> IFB NP 1 W1 E
<400> 45
catttctcta agcaaacaag ctg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> IFB NP 2 W1 E
<400> 46
gagggaaacc cttgcatttt aat 23
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> HCoVNL63 N 1 W1 E
<400> 47
ccattggtaa gggtaataaa gatg 24
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> HCoV229E N 1 W1 E
<400> 48
accgcaaccc agacgacacc ttcaac 26
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> RSV N 1 W1 E
<400> 49
gaatgttcta aaaaatgaaa tgaaac 26
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> HKU1 N 1 W1 E
<400> 50
ggacaacccc aacccaaatt cactgtg 27
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> H1N1 M 2 W1 E
<400> 51
gatttgtggt agtagccatc tgtctgtg 28

Claims (9)

1.一种利用多重PCR技术快速检测12种呼吸道病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、通过分别对NCBI已发布的12种呼吸道病毒的基因组信息的分析，得到具有特异性和保守性的各呼吸道病毒的基因作为靶基因；
步骤二、基于步骤一获得的靶基因设计多重引物及探针；
步骤三、利用步骤二获得的多重引物进行多重PCR反应体系及条件的优化，获得多重PCR反应体系和条件。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述12种呼吸道病毒为：2019-nCoV、HCoV229E、HCoVOC43、HCoVNL63、SARS、MERS、HKU1、RNA人偏肺病毒、RNA甲型流感病毒、RNA乙型流感病毒、RNA副流感病毒和RNA呼吸道合胞病毒。
3.根据权利要求1或2任意一项所述的方法，其特征在于，步骤一所述靶基因的获得方法具体为：
(1)根据NCBI已发布的12种呼吸道病毒基因组信息，查找每类病毒的不同的基因组序列，然后使用DNAMAN软件对基因组序列进行序列比对；
(2)检索出基因组特异性的基因，并且利用blast软件和nt数据库进行比对，确定基因组中特异性基因与NCBI库中不具有同源特异性的序列作为候选基因；
(3)将候选基因在目的病毒基因组数据中进行检索，确定上下游基因保守性，避开高突变区域，用简并碱基的形式标注出变异性的碱基；
(4)对候选基因进行验证，将具有特异性和保守性的候选序列作为靶基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述不具有同源特异性是指同源性不高于60％。
5.根据权利要求1或2任意一项所述的方法，其特征在于，步骤二所述多重引物为：
2019-nCov病毒靶基因的上下游引物：
2019-nCoV ORF1ab 1 W1 F序列如SEQ ID No.1所示；
2019-nCoV ORF1ab 1 W1 R序列如SEQ ID No.2所示；
2019-nCoV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.3所示；
2019-nCoV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.4所示；
HCoV229E病毒靶基因的上下游引物：
HCoV229E N 1 W1 F序列如SEQ ID No.5所示；
HCoV229E N 1 W1 R序列如SEQ ID No.6所示；
HCoVOC43病毒靶基因的上下游引物：
HCoVOC43 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.7所示；
HCoVOC43 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.8所示；
HCoVNL63病毒靶基因的上下游引物：
HCoVNL63 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.9所示；
HCoVNL63 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.10所示；
SARS病毒靶基因的上下游引物：
SARS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.11所示；
SARS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.12所示；
MERS病毒靶基因的上下游引物：
MERS N 1 W1 F序列如SEQ ID No.13所示；
MERS N 1 W1 R序列如SEQ ID No.14所示；
HKU1病毒靶基因的上下游引物：
HKU1 N 1 W1 F序列如SEQ ID No.15所示；
HKU1 N 1 W1 R序列如SEQ ID No.16所示；
RNA人偏肺病毒靶基因的上下游引物：
HMPV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.17所示；
HMPV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.18所示；
RNA甲型流感病毒靶基因的上下游引物：
H3N2 M 1 W1 F序列如SEQ ID No.19所示；
H3N2 M 1 W1 R序列如SEQ ID No.20所示；
H1N1 HA 2 W1 F序列如SEQ ID No.21所示；
H1N1 HA 2 W1 R序列如SEQ ID No.22所示；
H3N2 HA 1 W1 F序列如SEQ ID No.23所示；
H3N2 HA 1 W1 R序列如SEQ ID No.24所示；
H1N1 M 2 W1 F序列如SEQ ID No.25所示；
H1N1 M 2 W1 R序列如SEQ ID No.26所示；
RNA乙型流感病毒靶基因的上下游引物：
IFB NP 1 W1 F序列如SEQ ID No.27所示；
IFB NP 1 W1 R序列如SEQ ID No.28所示；
IFB NP 2 W1 F序列如SEQ ID No.29所示；
IFB NP 2 W1 R序列如SEQ ID No.30所示；
RNA副流感病毒靶基因的上下游引物：
HPIV4 NP 1 W1 F序列如SEQ ID No.31所示；
HPIV4 NP 1 W1 R序列如SEQ ID No.32所示；
RNA呼吸道合胞病毒靶基因的上下游引物：
RSV N 1 W1 F序列如SEQ ID No.33所示；
RSV N 1 W1 R序列如SEQ ID No.34所示。
6.根据权利要求1或2任意一项所述的方法，其特征在于，步骤二所述探针为：
H3N2 M 1 W1 E：TGTTCACGCTCACCG；
2019-nCoV ORF1ab 1 W1 E：GTGTAAGACGGGCTG；
2019-nCoV N 1 W1 E：CAACAAGGCCAAACTG；
H1N1 HA 2 W1 E：cAGCATAACGGGAAACTAT；
MERS N 1 W1 E：ccctAGTTTCTGCTTACGCT；
HPIV4 NP 1 W1 E：cTTGGCAGATGATGATACAG；
HMPV N 1 W1 E：gTGCTGCAGAAATAGGAATA；
H3N2 HA 1 W1 E：ACTGCACACTAATAGATGCTC；
SARS N 1 W1 E：ccctCTCCTTGCCATGCTGAGT；
HCoVOC43 N 1 W1 E：gagaGTCCTCTGGAAATCGGTC；
IFB NP 1 W1 E：catttCTCTAAGCAAACAAGCTG；
IFB NP 2 W1 E：gagGGAAACCCTTGCATTTTAAT；
HCoVNL63 N 1 W1 E：ccATTGGTAAGGGTAATAAAGATG；
HCoV229E N 1 W1 E：accGCAACCCAGACGACACCTTCAAC；
RSV N 1 W1 E：gAATGTTCTAAAAAATGAAATGAAAC；
HKU1 N 1 W1 E：ggacAACCCCAACCCAAATTCACTGTG；
H1N1 M 2 W1 E：gatttGTGGTAGTAGCCATCTGTCTGTG。
7.根据权利要求1或2任意一项所述的方法，其特征在于，步骤三所述多重PCR反应体系由0.5μL多重PCR缓冲液，0.4μL氯化镁缓冲液，0.1μL dNTP混合物，0.2μL多重PCR酶，1μLPCR引物混合物和2.8μL纯化后的核酸组成。
8.根据权利要求1或2任意一项所述的方法，其特征在于，步骤三所述多重PCR反应条件为95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃60s 45个循环；72℃5min；降温至4℃保存。
9.权利要求1或2任意一项所述的方法在制备用于快速检测12种呼吸道病毒的试剂盒中的应用。
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