CN111876524A - 基于多重pcr-飞行时间质谱检测34种呼吸道病原微生物的引物和探针组合及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于多重PCR飞行时间质谱的多重呼吸道病原体核酸检测及鉴定新冠病毒分型的引物和探针组合，所述的引物和探针组合包括，1）引物序列组合，如表1所示；2）探针序列组合，如表2所示。本发明还提供了基于多重PCR飞行时间质谱的多重呼吸道病原体核酸检测及鉴定新冠病毒分型的试剂盒。本发明中，基于MassARRAY MALDI‑TOF MS系统，除了对多种呼吸道病原体可以同时进行检测，还可以对2019新型冠状病毒（2019‑nCoV）进行分型鉴定，这样对临床和病毒研究更加有意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用多重PCR-飞行时间质谱检测34种呼吸道病原微生物的方法、配套引物/探针组合及试剂盒、以及这种检测方法在呼吸道病毒感染上的应用。
背景技术
呼吸道感染疾病，尤其是急性呼吸道传染病，一直是全球致死、致残的重要病因，在世界范围内受到广泛关注。病毒是造成呼吸道感染疾病最主要的原因，50％以上的呼吸道感染是由病毒引起。常见的呼吸道感染病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、冠状病毒等。甲型流感病毒可以感染人和哺乳动物以及禽类，H1N1、H2N2、H3N2 亚型主要感染人类，其它亚型主要是感染禽类以及猪、马和水生哺乳动物；在禽流感病毒中能够感染人类的亚型有H5N1、H7N1、H7N2、H7N4、H7N9、 H9N2、H10N8等12种。乙型流感病毒主要在人群中流行，没有亚型分类，其流行规模比甲型流感病毒要小。呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是副粘病毒科肺病毒属中单链RNA病毒，分为A、B两型，是 5岁以下婴幼儿呼吸道感染的最主要病因，我国2岁以下住院和门/急诊病例中，RSV检出率高居榜首，达33.3％[参见Yu J，et al.Comparison of the prevalence ofrespiratoryviruses in patients with acute respiratory infections at differenthospitalsettings in North China，2012-2015.BMC Infect Dis.2018Feb 8；18(1)：72]；此外，RSV还能感染其他各个年龄组的人群，并导致严重的呼吸道疾病，其病情在老年人中尤为严重。副流感病毒(PIV)属于副粘病毒科(paramyxiviridae)，副粘病毒亚科(paranyxivirinae)，可引起各年龄阶段人群发病，尤其以婴幼儿易感，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒。腺病毒 (Adenoviruses，ADV)是腺病毒科哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)的一种，可感染呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱、眼和肝脏等，并引起广泛的临床症状。人偏肺病毒(Human metapneumovirus，hMPV)是五岁以下婴幼儿急性呼吸道感染的重要病原体，通常可与RSV、流感病毒等共感染，导致儿童的临床症状加重。人博卡病毒(Bocavirus)是细小病毒科细小病毒亚科的一个属，通常感染肠道和呼吸道，由瑞典科学家运用分子病毒筛查方法于2005年首次在儿童呼吸道分泌物中发现；作为与人类急性呼吸道感染密切相关的新型病毒，人博卡病毒与其他呼吸道病毒的共感染率可高达51％，通过空气传播，容易使婴幼儿罹患肺炎、支气管炎和支气管肺炎等疾病。人肠病毒(HEV) 是一种主要寄生于肠道的正链单股RNA病毒，具高传染性，主要经由吃到被污染的食物、水等或经由呼吸道(飞沫、咳嗽等)传染；大部分的HEV感染临床症状都是轻微的类流感症状，表现为发烧、喉痛、头痛、恶心等。人鼻病毒(Human rhinovirus，HRV)是小RNA病毒科、鼻病毒属的一种，是人患普通感冒的主要病原，感染人群主要为老年人和5岁以下儿童，尤其多发于1岁以下儿童。柯萨奇病毒(Coxsackievirus)是一种肠病毒(enterovirus)，分为A和B两类，是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒，感染后人会出现发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状。肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是介于细菌与病毒之间，无细胞壁的一类原核细胞型生物，是引起儿童气管炎、支气管炎、原发性不典型肺炎的重要病原体。
冠状病毒(Coronavirus,CoV)是一类具有包膜包被的线性单股正链RNA 病毒，可进一步分为α、β、γ、δ四个属，因其在电子显微镜下观察发现病毒包膜上有类似日冕的棘突而得名。冠状病毒可感染哺乳动物和禽类，引起呼吸系统、消化和中枢神经系统的多种疾病，从牛和猪的胃肠炎，到鸡的呼吸道和泌尿生殖道疾病，甚至到可致命的严重人类呼吸道感染性疾病[参考文献：Fehr,A.R.；Perlman,S.Coronaviruses:an overview of theirreplication and pathogenesis.Methods Mol Biol,2015,1282:1-23]。人冠状病毒(HCoV) 是引起急性呼吸道感染的重要病原体，可以通过直接接触呼吸道分泌物或经气溶胶飞沫传播，感染呈现的临床表现从轻微感冒到严重的下呼吸道感染。截至目前，已鉴定出7种HCoV，包括2种α属冠状病毒NL63和229E，5 种β属冠状病毒OC43、HKU1、急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和2019新型冠状病毒(2019-nCoV或 SARS-CoV-2)。其中冠状病毒229E、NL63、OC43、HKU1为常见感染，感染人呼吸道后病症较轻，一般不会引起重症，而冠状病毒MERS-CoV、 SARS-CoV和新型冠状病毒2019-nCoV造成的感染，患者症状就非常严重，且极易产生重症甚至死亡。最近的二十年中，HCoV引起三次大规模大流行，就包括2003年的SARS、2012年的MERS和2019年底爆发目前仍肆虐于全球的2019-nCoV。
如上所述，呼吸道感染的病原体种类繁杂，不同的病原体感染可能会引起相似的临床表现，同时一个病原体也可以造成多种临床表现，为临床早期诊断带来了很大困难。并且针对不同的病原感染，临床治疗及病原防控方案有很大的不同。常见的呼吸道病毒感染疾病通过及时治愈一般不会发展为肺炎，而且传播能力相对较差，而像2019-nCoV等恶性传染性病毒的感染者往往具有很强的传播性，可以快速的发生严重的肺部病变，当CT检测已发现病灶时，患者病情往往已经比较严重，而且可能由于隔离及防护不及时，病原已大量传播。截至2020年6月，2019-nCoV在我国境内的传播已经基本被控制，现存确诊病例大多是其他国家入境输入，然而，在全球各地，新型冠状病毒2019-nCoV蔓延迅速，目前已累计确诊感染738万多，死亡人数41万多，并且疫情仍在不断发展恶化，引起世界恐慌。因此，准确、快速地检测与区分普通呼吸道系统感染与恶性病原感染，进而为后续的防控、治疗以及采取针对性的措施提供指导，做到早发现、早诊断、早隔离、早治疗是目前全球呼吸道疾病防控的重点。
快速、准确的病原诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。病原微生物检测方法主要是传统培养法、血清学检测法和基于PCR的分子生物学检测法。传统培养法对仪器设备的要求不高，可操作性成本低，但是耗时、低效、操作繁琐，阳性率仅为10％左右，并且很多病毒难以分离，培养也容易受到多种外界和人为因素影响，无法满足当前检测工作的快速性、准确性要求。基于血清学病原检测方法，如抗原检测、酶联免疫吸附检测、免疫荧光检测等，需要制备特定抗原蛋白或特异性抗体，检测效果受厂家所用抗原、抗体原料影响很大，并且检测步骤繁琐，耗时长，阳性率也仅为10％左右。随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛。目前常用的病原微生物分子检测方法主要包括：基于PCR的电泳法、实时荧光定量PCR(qPCR)、基因芯片技术、测序技术(Sanger测序技术、焦磷酸测序技术、高通量NGS测序技术)等。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，具有灵敏度高、特异性强、简便快速、对标本的纯度要求低等特点，是目前应用最为广泛的病原学检测技术。其中荧光定量PCR具特异性强、灵敏度高、精密度好、检测速度快等特点，是目前应用最为广泛的病原学检测技术，自2020年1月份以来已经在新型冠状病毒临床检测及疫情防控过程中得到了迅速的推广使用。最近，中国专利CN111074001A公开了9种呼吸道病原体核酸协同多重PCR检测，中国专利CN110724764A公开了人冠状病毒和呼吸道合胞病毒荧光定量PCR检测方法及其应用，中国专利CN110468234A 公开了用于19种人呼吸道病毒检测的多重荧光定量PCR试剂盒；中国专利 CN111074011A公开了检测引起呼吸道感染的病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途，以上这些方法都是基于荧光定量PCR法。但是目前的荧光定量PCR法由于本身的技术性限制，一个检测反应最多只能实现几种病原体的同时检测，检测通量有限，当需要检测更多种病原体时就会受到限制。另一方面，随着疫情的发展，可疑病例也会不断增多，利用常规的RT-PCR 方法可能无法满足大样本量快速检测的需求。而NGS高通量测序技术和芯片技术，近年来作为一种高通量高精度的核酸检测手段，逐渐成为临床诊断的重要手段，在孕产前中期、肿瘤早筛与治疗、遗传病检测与治疗以及其他疾病的早筛领域发挥着巨大的作用。疫情爆发以来，中国专利CN111139315A公开了一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法与应用，中国专利 CN111041129A公开了采用恒温扩增与微流控芯片相结合的方法检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用。基因芯片和NGS高通量测序检测技术虽然检测通量高，但是由于检测成本高、耗时长，并不适用于呼吸道病原监测、分诊及疫情预警防控系统对于快速诊断的需求，目前鲜有临床应用。因此，如何有效利用核酸分子检测的手段，快速、高效、高通量、且准确判断感染情况是迫切需要解决的问题。
发明内容
为解决实时定量PCR法检测通量不足以及流行病疫情爆发时对于大样本量检测筛查的需求，建立一种快速、灵敏和高通量的呼吸道病毒感染病原体检测方法，本发明提供了一种基于多重PCR-飞行时间质谱检测34种呼吸道病原微生物的方法及其这种检测方法在呼吸道病毒感染防控上的应用，并提供配套引物/探针组合及试剂盒。本发明提供的检测方法具有高精度、高敏感性、高通量、低成本、快速检测的优势。
在本发明中，基于MassARRAY基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱 (MALDI-TOF)系统(Sequenom,Inc.,San Diego,CA,USA)，发明人开发了一个常见呼吸道病毒panel测试(CRV-MS)，可以同时检测和识别34种常见呼吸道病毒类型/子类型，包括五种甲型流感病毒(通用型MP、H1N1、H1N1pdm09、 H3N2、H7N9)、乙型流感病毒(Flu-B)、副流感病毒1至4型(PIV1至4型)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞体病毒A和B(RSV-A、RSV-B)、人偏肺病毒A 和B(HMPV-A、HMPV-B)、人博卡病毒1和2型(HBoV1、HBoV2)、人鼻病毒(HRV)、人肠病毒(HEV)、柯萨奇病毒A6、A16和A10型(CVA6、 CVA16、CVA10)、肺炎支原体(MP、CP)、四种人类冠状病毒(HCoV)(oc43、 229E、NL63、HKU-1)、2019新型冠状病毒(2019-nCoV)(ORF1ab、N、28144、8782、26144、29095)。
MassARRAY MALDI-TOF MS系统已成功用于多种病原体的检测(10-16)。本发明中，基于MassARRAY MALDI-TOF MS系统，除了对多种呼吸道病原体可以同时进行检测，还可以对2019新型冠状病毒(2019-nCoV)进行分型鉴定，这样对临床和病毒研究更加有意义。
另外，发明人在研究过程中发现，虽然呼吸道病原微生物相关的基因序列是已知的现有技术，但是实际操作中仍然存在着技术难点，这是因为选择能同时扩增检测的34种常见呼吸道病毒类型/子类型，既要考虑模板序列、引物探针相互之间发生反应导致检测失败的因素，又要考虑引物探针的结果对于特异性、灵敏度和准确性的影响。为此，尽管可以利用常规软件在理论上进行分析，但发明人仍需要根据实际情况选择特定的设计思路，并通过进一步的实验对各种引物探针组合方式和反应条件进行验证优化才最终得到本发明的引物探针组合。
本发明的引物探针的设计思路如下：
发明人针对34种常见呼吸道病毒类型/子类型，设计34个特异性位点引物，另外，根据待测病毒全序列，选择特异性保守序列，设计PCR引物，用一对PCR 引物，在引物的5’端带有10个碱基(ACGTTGGATG)序列，使总长度达到30 个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针长度15-29个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过30个碱基。
关于检测新冠状病毒样本，设计发明的引物和探针组合时，发明人首先设计了3种2019-N引物及其探针(引物为SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.48，探针为SEQ ID NO.98至SEQID NO.100)，以及2种2019-ORF1ab引物及其探针 (引物为SEQ ID NO.49至SEQ ID NO.52，探针为SEQ ID NO.101至SEQ ID NO.102)，作交叉试验分为6个组合进行试验对比，最终根据试验结果，选择特异性最佳组合2019-N1与2019-O2的组合(2019-N1引物为SEQ ID NO.43至 SEQ ID NO.44，2019-O2引物为SEQ ID NO.51至SEQ ID NO.52，2019-N1 探针为SEQ IDNO.98，2019-O2探针为SEQ ID NO.102)。
表3 SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.52引物序列表
| SEQ ID NO.43 | ACGTTGGATGGGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT | 2019-N1正向引物 |
| SEQ ID NO.44 | ACGTTGGATGCAGACATTTTGCTCTCAAGCTG | 2019-N1反向引物 |
| SEQ ID NO.45 | ACGTTGGATGTTACAAACATTGGCCGCAAA | 2019-N2正向引物 |
| SEQ ID NO.46 | ACGTTGGATGGCGCGACATTCCGAAGAA | 2019-N2反向引物 |
| SEQ ID NO.47 | ACGTTGGATGGGGAGCCTTGAATACACCAAAA | 2019-N3正向引物 |
| SEQ ID NO.48 | ACGTTGGATGTGTAGCACGATTGCAGCA | 2019-N3反向引物 |
| SEQ ID NO.49 | ACGTTGGATGCCCTGTGGGTTTTACACTTAA | 2019-O1正向引物 |
| SEQ ID NO.50 | ACGTTGGATGACGATTGTGCATCAGCTGA | 2019-O1反向引物 |
| SEQ ID NO.51 | ACGTTGGATGACCGAAGTTGTAGGAGACAT | 2019-O2正向引物 |
| SEQ ID NO.52 | ACGTTGGATGAAGCAGCCATTAGATCTGTG | 2019-O2反向引物 |
表4 SEQ ID NO.98至SEQ ID NO.102探针序列表
| SEQ ID NO.98 | 2019-N1探针 | TGCTGCTGCTTGACAGATT |
| SEQ ID NO.99 | 2019-N2探针 | GAACGCTGAAGCGCTGG |
| SEQ ID NO.100 | 2019-N3探针 | GATCACATTGGCACC |
| SEQ ID NO.101 | 2019-O1探针 | CGGTATGTGGAAAGGTTATGG |
| SEQ ID NO.102 | 2019-O2探针 | ATTACAGAAGAGGTTGGC |
本发明的技术方案如下：
首先，本发明提供了基于多重PCR飞行时间质谱的多重呼吸道病原体核酸检测及鉴定新冠病毒分型的引物和探针组合，
所述的组合用于检测34种常见呼吸道病毒类型/子类型，包括五种甲型流感病毒(通用型MP、H1N1、H1N1pdm09、H3N2、H7N9)、乙型流感病毒(Flu-B)、副流感病毒1至4型(PIV1至4型)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞体病毒A和B(RSV-A、RSV-B)、人偏肺病毒A和B(HMPV-A、HMPV-B)、人博卡病毒1和2型(HBoV1、HBoV2)、人鼻病毒(HRV)、人肠病毒(HEV)、柯萨奇病毒A6、A16和A10型(CVA6、CVA16、CVA10)、肺炎支原体(MP、CP)、四种人类冠状病毒(HCoV)(oc43、229E、NL63、 HKU-1)、2019新型冠状病毒2019-nCoV(ORF1ab、N、28144、8782、26144、29095)；
所述的引物和探针组合包括，
1)引物序列组合，如表1所示；
2)探针序列组合，如表2所示；
3)样品质量控制参照位点RNaseP，其中引物的样品质量控制参照位点 RNaseP序列如SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76所示，探针的样品质量控制参照位点RNaseP序列如SEQID NO.114所示；
表1
表2
表1和表2种列出的合成的多核苷酸，均采用常规的多核苷酸合成方法合成。纯化方式为ePAGE。
其次，本发明提供了基于多重PCR飞行时间质谱的多重呼吸道病原体核酸检测及鉴定新冠病毒分型的试剂盒，含有上述的引物和探针组合，还包括检测所需的检测试剂。
最后，本发明提供了基于多重PCR飞行时间质谱的多重呼吸道病原体核酸检测及鉴定新冠病毒分型的检测方法，包括以下步骤：
1、RT-PCR反应：本发明中，在RT-PCR反应体系中，采用“一步法”首次创新，直接用病毒RNA样本反转录并且扩增。通过第一轮PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
2、虾碱性磷酸酶(SAP)处理：使未结合的剩余核酸脱磷酸(dNTPs)失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。
3、碱基延伸反应：在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及其它延伸产物之间的分子量差异不小于16Da。
4、树脂脱盐：纯化延伸反应产物，吸附体系中的Na、K离子。
5、质谱检测：将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MASS)系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测样本是否含有呼吸道病原体，如果是待测新冠样本，则可判型类别，软件自动处理报告判型结果。
优选的，在每次反应中加入阴性对照，所述阴性对照为去离子双蒸水。
本发明的检测方法中，包括如下改进之处：
1)设计34个特异性位点引物以及1个质量控制参照位点RNaseP。另外，根据待测病毒全序列，选择特异性保守序列，设计PCR引物，用一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基(ACGTTGGATG)序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针长度15-29个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过30 个碱基。
2)第一步RT-PCR扩增反应，创新直接用病毒RNA样本进行反转录-PCR 一步法。
3)纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测。根据分子量标记确定待测样本是否含有呼吸道病原体，如果是待测新冠样本，则可判型类别，软件自动处理报告判型结果。
4)选用RNaseP作为样品质量控制参照。
本发明的技术原理如下：
与现有检测呼吸道病原体的其它技术或同类技术相比，本发明技术方案充分发挥了PCR-质谱联用检测多种病毒的优势，同时，也对新型冠状病毒分型有着一定优势，标记、不需要洗涤、反应在微量体系中进行、样本上样量很少(浓度大于1ng/μL均可检出)等优势，使得试剂耗材成本与检测PCR重数成反比，从而实现以多条探针，在一个反应中同时检测17种病毒病原体的目标。首轮PCR 扩增区域为50-130bp的基因型特异性片段，第二轮PCR采用特异性探针末端单点法扩增，可以允许使用更多循环，最大限度地提高了检测灵敏度和特异性，使检测灵敏度达到1aM级单个拷贝水平，避免了检测漏诊造成地假阴性问题。同时，每个位点的设计采用虚拟判型结果一个“N”，另一个为突变位点，只要看突变位点是否突变，而虚拟位点则不可能发生突变。该基因型特异性片段扩增设计技术会彻底排除PCR产物污染和同源序列探针错配引起地假阳性问题，为多重检测呼吸道病原体提供了可靠的实验方法。
本发明具有如下技术效果：
目前，多数的检测手段主要是通过荧光定量PCR检测，而无法实现同时检测多种呼吸道病原体，或者2019新型冠状病毒的分型，本发明包括以下2点创新点：
(1)开发了一个常见呼吸道病毒panel测试(CRV-MS)，可以同时检测和识别34种常见呼吸道病毒类型/子类型。其中，RNA病毒29种，包括五种甲型流感病毒(通用型MP、H1N1、H1N1pdm09、H3N2、H7N9)、乙型流感病毒(Flu-B)、副流感病毒1至4型(PIV1至4型)、呼吸道合胞体病毒A和B (RSV-A、RSV-B)、人偏肺病毒A和B(HMPV-A、HMPV-B)、人鼻病毒(HRV)、人肠病毒(HEV)、柯萨奇病毒A6、A16和A10型(CVA6、CVA16、CVA10)、四种人类冠状病毒(HCoV)(oc43、229E、NL63、HKU-1)、2019新型冠状病毒(2019-nCoV)(ORF1ab、N、28144、8782、26144、29095)；DNA病毒有3种，包括人博卡病毒1和2型(HBoV1、HBoV2)和腺病毒(ADV)；支原体或衣原体2种：肺炎支/衣原体(MP、CP)。
(2)纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测。根据分子量标记确定待测样本是否为阳性新冠样本，并通过26144、29095、28144和8782四个位点引物延伸，判读分型A、B或C型。
(3)本发明的方法，检测浓度低至1000拷贝/mL。
附图说明
图1为检测阳性新冠状病毒样本时的核酸质谱峰图；
图2为HRV-5-UTR位点阳性样本核酸质谱峰图；
图3为HEV71位点阳性样本核酸质谱峰图；
图4为AdV-Hexon-U2位点阳性样本核酸质谱峰图；
图5-1为PIV1-HN位点阳性样本核酸质谱峰图；
图5-2为PIV2-HN位点阳性样本核酸质谱峰图；
图5-3为PIV3-HN位点阳性样本核酸质谱峰图；
图5-4为PIV4-HN-U2位点阳性样本核酸质谱峰图；
图6-1为Flu-A-MP-U3位点阳性样本核酸质谱峰图；
图6-2为Flu-A-H1N1-HA位点阳性样本核酸质谱峰图；
图6-3为Flu-A-H1N1-pdm09-HA位点阳性样本核酸质谱峰图；
图6-4为Flu-A-H3N2-HA位点阳性样本核酸质谱峰图；
图6-5为Flu-B-MP位点阳性样本核酸质谱峰图；
图6-6为Flu-A-H7N9-HA位点阳性样本核酸质谱峰图；
图7-1为RSV-A-N位点阳性样本核酸质谱峰图；
图7-2为RSV-B-N-U2位点阳性样本核酸质谱峰图；
图8-1为MP位点阳性样本核酸质谱峰图；
图8-2为CP位点阳性样本核酸质谱峰图；
图9-1为HCoV-229E-N位点阳性样本核酸质谱峰图；
图9-2为HCoV-NL63-N位点阳性样本核酸质谱峰图；
图9-3为HCoV-HKU-1-N位点阳性样本核酸质谱峰图；
图9-4为HCoV-OC43-N位点阳性样本核酸质谱峰图；
图10-1为HMPV-A-N位点阳性样本核酸质谱峰图；
图10-2为HMPV-B-N位点阳性样本核酸质谱峰图；
图11-1为HBoV1-NP1位点阳性样本核酸质谱峰图；
图11-2为HBoV2-NP1位点阳性样本核酸质谱峰图；
图12-1为CVA6-VP1位点阳性样本核酸质谱峰图；
图12-2为CVA16-VP1位点阳性样本核酸质谱峰图；
图12-3为CVA10-VP1位点阳性样本核酸质谱峰图；
图13-1为2019-N1位点新冠阳性样本(N1O2)核酸质谱峰图；
图13-2为2019-O2位点新冠阳性样本(N1O2)核酸质谱峰图；
图13-3为26144位点新冠阳性样本(N1O2)核酸质谱峰图；
图13-4为28144位点新冠阳性样本(N1O2)核酸质谱峰图；
图13-5为29095位点新冠阳性样本(N1O2)核酸质谱峰图；
图13-6为8782位点新冠阳性样本(N1O2)核酸质谱峰图；
图14-1为29095位点新冠阳性样本(N1O1)核酸质谱峰图；
图15-1为29095位点新冠阳性样本(N2O1)核酸质谱峰图；
图16-1为2019-N3位点新冠阳性样本(N3O1)核酸质谱峰图；
图17-1为29095位点新冠阳性样本(N2O2)核酸质谱峰图；
图18-1为2019-N3位点新冠阳性样本(N3O2)核酸质谱峰图。
具体实施方式
此处所描述的具体实施方式仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施方式提供的高灵敏度检测/或鉴定呼吸道病毒病原体种类以及新型冠状病毒的分型的方法，待检测样本有，每个位点对应的阳性质粒，阳性新冠样本和阴性样本对照。包括如下步骤：
(1)根据待测呼吸道病毒的各个全基因组序列，选择特异性保守序列，设计PCR引物，设计34个特异性位点引物，另外，根据待测病毒全序列，选择特异性保守序列，设计PCR引物，用一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基(ACGTTGGATG)序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针长度15-29个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过30个碱基。各种呼吸道病毒的探针引物序列见表2。
关于检测新冠状病毒样本，设计发明的引物和探针组合时，设计了3种 2019-N引物及其探针(引物为SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.48，探针为SEQ ID NO.98至SEQ IDNO.100)，和2种2019-ORF1ab引物及其探针(引物为SEQ ID NO.49至SEQ ID NO.52，探针为SEQ ID NO.101至SEQ ID NO.102)，作交叉试验分为6个组合进行试验对比，最后根据试验结果，选择特异性最佳组合，即2019-N1与2019-O2的组合(2019-N1引物为SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.44，2019-O2引物为SEQ ID NO.51至SEQ ID NO.52，2019-N1探针为SEQ IDNO.98，2019-O2探针为SEQ ID NO.102)。
具体对比核酸质谱峰图结果见附图13-1至图18-1。
图13-1至13-6为组合2019-N1与2019-O2组合为效果最佳的核酸质谱峰图；
图14-1至18-1分别为2019-N1与2019-O1、2019-N2与2019-O1、2019-N3 与2019-N1、2019-N2与2019-O2、2019-N3与2019-O2组合的特异性不好位点核酸质谱峰图。
表3 SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.52引物序列表(5'→3')
| SEQ ID NO.43 | ACGTTGGATGGGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT | 2019-N1正向引物 |
| SEQ ID NO.44 | ACGTTGGATGCAGACATTTTGCTCTCAAGCTG | 2019-N1反向引物 |
| SEQ ID NO.45 | ACGTTGGATGTTACAAACATTGGCCGCAAA | 2019-N2正向引物 |
| SEQ ID NO.46 | ACGTTGGATGGCGCGACATTCCGAAGAA | 2019-N2反向引物 |
| SEQ ID NO.47 | ACGTTGGATGGGGAGCCTTGAATACACCAAAA | 2019-N3正向引物 |
| SEQ ID NO.48 | ACGTTGGATGTGTAGCACGATTGCAGCA | 2019-N3反向引物 |
| SEQ ID NO.49 | ACGTTGGATGCCCTGTGGGTTTTACACTTAA | 2019-O1正向引物 |
| SEQ ID NO.50 | ACGTTGGATGACGATTGTGCATCAGCTGA | 2019-O1反向引物 |
| SEQ ID NO.51 | ACGTTGGATGACCGAAGTTGTAGGAGACAT | 2019-O2正向引物 |
| SEQ ID NO.52 | ACGTTGGATGAAGCAGCCATTAGATCTGTG | 2019-O2反向引物 |
表4 SEQ ID NO.98至SEQ ID NO.102探针序列表(5'→3')
| SEQ ID NO.98 | 2019-N1探针 | TGCTGCTGCTTGACAGATT |
| SEQ ID NO.99 | 2019-N2探针 | GAACGCTGAAGCGCTGG |
| SEQ ID NO.100 | 2019-N3探针 | GATCACATTGGCACC |
| SEQ ID NO.101 | 2019-O1探针 | CGGTATGTGGAAAGGTTATGG |
| SEQ ID NO.102 | 2019-O2探针 | ATTACAGAAGAGGTTGGC |
(2)通过PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
模拟样本：本发明合成了所有位点的相应阳性质粒，把质粒稀释成1000 拷贝/mL。然后再检测该样本时混入一定量(1-3ng)的人的RNA，模拟病毒检测环境。
PCR反应体系配制见表5.
表5
| 试剂 | 最终浓度 | 体积1×(μL) |
| 2×Buffer | 2.50 | |
| 1mM PCR Primer Mix | 0.2mM | 1.00 |
| 5U/mL Enzyme Mix | 1Unit | 0.10 |
| RNA Template(0.5-2ng/μL) | 1.00 | |
| RNase-Free Water | N/A | 0.40 |
| Total | 5.00 |
先用45℃ 30分钟，进行反转录，然后95℃ 2分钟对Mix中PCR酶进行热启动，随后做PCR循环扩增。反应条件为95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环；最终72℃延伸5分钟，完成后恒温于4℃。
(3)通过虾碱性磷酸酶(SAP)处理，使得未结合的剩余核酸(dNTPs) 脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。SAP消化酶反应体系见表6。
表6
| 试剂 | 体积1×(μL) |
| ddH<sub>2</sub>O | 1.75 |
| SAP Enzyme | 0.25 |
| Total | 2.00 |
反应条件为37℃孵育10分钟，去除剩余dNTPs；然后用85℃5分钟使SAP 酶失活，完成后恒温于4℃。
(4)通过碱基延伸反应，在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，延伸反应体系见表7。
表7
*延伸反应探针Mix的浓度，按照各型分子量大小进行线性关系调节，总浓度约为42.70mM，最终浓度约为4.01mM。
循环反应为200个短阶梯程序，包含两个循环嵌合，开始为95℃变性30秒，随后在95℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共40个循环中，每个插入脱火和延伸5个小循环；最终72℃延伸3分钟，完成后恒温于4℃。
(5)采用树脂脱盐纯化延伸反应产物。
(6)将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测样本是否为阳性或判定其分型。
(7)关于新型冠状病毒的分型：图1中，横坐标为分子量，纵坐标为峰强度。途图中纵行虚线同色为该基因型延伸探针的分子量位置，如果不存在该型别探针峰不变；如果被检测样本拷贝数大于1000，探针可被完全消耗，左侧峰消失转至右侧；右侧的同色虚线表示延伸产物分子量位置。用Type4.1软件阅读谱图，自动分析和报告结果，导出数据。数据解释为，每一个位点或内参基因的延伸探针在质谱图不同的质量处有相应的分子量峰，在探针发现目标基因工作时出现单碱基延伸产物，探针分子量峰发生转移为产物分子峰，分析结果报告为阳性。阳性结果分为四种判读情况：A、结果可靠；B、中度可靠；C、一般可靠；D、低度可靠。前三种视为延伸反应有效，可确诊为该阳性呼吸道病毒感染，第四种需要人工辅助判断，观察探针是否消耗，判断为可疑感染或阴性结果。对可疑感染样本，在必要时可作重复性验证试验。
(8)例如，图1为一已知阳性新型冠状病毒患者下呼吸道提取的RNA样本。如果2019-N1或2019-O2出现一种或两种上类可判读情况，同时，28144、 8782、26144和29095四个位点判读情况见下表8，因为四个位点延伸引物方向为反向(R)，再根据文献《Phylogenetic network analysis of SARS-CoV-2 genomes》中判型依据：A的两个子簇由同义突变T29095C区分。B由A衍生出两个突变: 同义突变T8782C和非同义突变C28144T将一个亮氨酸变成丝氨酸。C型与它的亲本B型的区别在于非同义突变G26144T，它将甘氨酸转变为缬氨酸。因此，该样本判定为新型冠状病毒样本，B型。
表8
(9)本试验对其他28个位点相对应的阳性模拟样本分别做了检测，结果如图2至图12-3，结果完全可以检测出为阳性，且检测该位点时其他位点均显示未检出。
结论：本发明能够同时检测34种已知呼吸道病毒病原体的一种或多种，共计34个检测位点。能够对于该34个位点针对特异序列区同时进行检测，且对新冠状病毒检测与分型有良好效果。
序列表
<110> 江苏康为世纪生物科技有限公司
<120> 基于多重PCR-飞行时间质谱检测34种呼吸道病原微生物的引物和探针组合及试剂盒
<160> 114
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg tgttctagcc tgcgtrgctg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg aacacggaca cccaargtag 30
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg gaaatggrgt gttggaaacc a 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg tttctgcgra gttggacaaa g 31
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg cttgtaaacg tagggrcagg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgttggatg ttacyaccgt cagtgraaac 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgttggatg gcaaagyaga gatctcacac 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggatg caatrgtgtt ctcgcatatc 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgttggatg cagcttttgc gattgattcc 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgttggatg gggataatac arcaatctgc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgttggatg cttgttgttg agattgrgcc 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgttggatg tgcatcatca ggyatagaag 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgttggatg atatagrcga ccytctgcac 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acgttggatg rggagactta tacagagtgc 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acgttggatg tctacgctgc agtcctcgct 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acgttggatg gaccaatctt gtcacctctg 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgttggatg ctgagrgagc aattgagttc 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acgttggatg tcccgttatg ggagcrtgat 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acgttggatg tgaatcgtgg tagtccaaag 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acgttggatg ggtaaagagt tcraccacct 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acgttggatg agtgcttttg agatctgctg 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgttggatg gcgggtttca tagaraatgg 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acgttggatg agaaggccat garagctcag 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acgttggatg agccctgtgt gratgtgatg 30
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acgttggatg ctaattgatg gttggtatgg tttc 34
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgttggatg aattgccgat tgagtgcttt t 31
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acgttggatg cctytggtag aagrttgtgc 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acgttggatg cccaaggata tagcyaacag 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acgttggatg gcacatcata attgrgagtg 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acgttggatg aataaggatc agctgctgtc 30
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acgttggatg attaccatcc ttgttgtaag g 31
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acgttggatg gaagcttatg gtacaggttg g 31
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acgttggatg agggctataa aggcgttgct 30
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acgttggatg gatggtcgca gactttgttc c 31
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acgttggatg accttccaag rttgttcact 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acgttggatg atgggctgat gmatctgaac 30
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acgttggatg ggaaycttgt ccctattgg 29
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acgttggatg gcatacgcca acgctcttga 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acgttggatg acagagtctt ctacayaagg 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acgttggatg gctgrtactc agcacatttc 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg tcttatgacc acrctgacgc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gctataacgg cgcaattagg 30
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg ggggaacttc tcctgctaga at 32
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg cagacatttt gctctcaagc tg 32
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
acgttggatg ttacaaacat tggccgcaaa 30
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gcgcgacatt ccgaagaa 28
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gggagccttg aatacaccaa aa 32
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
acgttggatg tgtagcacga ttgcagca 28
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
acgttggatg ccctgtgggt tttacactta a 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acgttggatg acgattgtgc atcagctga 29
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
acgttggatg accgaagttg taggagacat 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg aagcagccat tagatctgtg 30
<210> 53
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
acgttggatg atgcgctttg atgctgaatt ca 32
<210> 54
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gacatgaarg ggactgacac ttg 33
<210> 55
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gaaatggrgt gttggaaacc a 31
<210> 56
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg tttctgcgra gttggacaaa g 31
<210> 57
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gttgatgagc ctgaagaaca tg 32
<210> 58
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg tgctgctgag gcttctaaga 30
<210> 60
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg gtttgttctg gaccacgtct g 31
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg accctcatca ttrcaacaag 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acgttggatg agggattcac ctaagtgatc tg 32
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acgttggatg agttgtggtg cctacatctc 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acgttggatg acagaaatat gttctrgcac 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
acgttggatg gtctgcttct gtcygtgagg 30
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
acgttggatg ggcagctact tyactgactc 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg ttttcctccw gcrttgcttg 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
acgttggatg gcaagctgca gaaacgggag 30
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
acgttggatg tgctccacac tcgcctcatt 30
<210> 71
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
acgttggatg atgcgctttg atgctgaatt ca 32
<210> 72
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
acgttggatg gacatgaarg ggactgacac ttg 33
<210> 73
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
acgttggatg gaaatggrgt gttggaaacc a 31
<210> 74
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
acgttggatg tttctgcgra gttggacaaa g 31
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
acgttggatg tgaatagcca aggtgagcgg 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
acgttggatg cggtgtttgc agatttggac 30
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tgattcctcc ggcccctgaa t 21
<210> 78
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ctgacctgaa ggctctg 17
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
ctctcacaga tcacggga 18
<210> 80
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tagagaagtc atgcaac 17
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gcttttgcga ttgattccat ca 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
aagccatcat aattgacaat atc 23
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
gacaatttct ttctgaagat tgtgaa 26
<210> 84
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tcacgctcac cgtgccca 18
<210> 85
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
cttcatttga gaggttcgaa atattc 26
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gttcggcatt gtaagtccaa at 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
ctcagaattt tgatgcctga aacc 24
<210> 88
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
aaattattca atgcaagtaa aact 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
cggtatgtgg aaaggttatg g 21
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
cctctggtag aagattgtgc tatac 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gtgtcaatat tatctcctgt act 23
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
taagctatca gctacatgg 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
agcgtctgtt ggcaagggga a 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gaataaggta ttctaccctg 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
aaagatgagc agattggtt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
caagagtagc aagtaaacta tg 22
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
agaccataat gaaggtgct 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
tgctgctgct tgacagatt 19
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gaacgctgaa gcgctgg 17
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gatcacattg gcacc 15
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
cggtatgtgg aaaggttatg g 21
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
attacagaag aggttggc 18
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
ggttcctggc aattaattgt aaaaggt 27
<210> 104
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
cattagtata actaccacca cgctg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
aacaactccg gatgaa 16
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<212> DNA
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ctggaccacg tctgcc 16
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagcatgctg attacaaata tgctgca 27
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
tatattaaaa gagtct 16
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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attgtgaaag atgtaattac t 21
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaatgaccac aaatacagaa ctgaaaat 28
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgttgtgtg atgaatcgaa acg 23
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
ccaccagggg ctccaaaacc 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
cacttcttct cccgctctgg 20
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
ctgacctgaa ggctctg 17
Claims (2)
1.基于多重PCR飞行时间质谱的多重呼吸道病原体核酸检测及鉴定新冠病毒分型的引物和探针组合，
所述的组合用于检测34种常见呼吸道病毒类型/子类型，包括五种甲型流感病毒(通用型MP、H1N1、H1N1pdm09、H3N2、H7N9)、乙型流感病毒(Flu-B)、副流感病毒1至4型(PIV1至4型)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞体病毒A和B(RSV-A、RSV-B)、人偏肺病毒A和B(HMPV-A、HMPV-B)、人博卡病毒1和2型(HBoV1、HBoV2)、人鼻病毒(HRV)、人肠病毒(HEV)、柯萨奇病毒A6、A16和A10型(CVA6、CVA16、CVA10)、肺炎支原体(MP、CP)、四种人类冠状病毒(HCoV)(oc43、229E、NL63、HKU-1)、2019新型冠状病毒2019-nCoV(ORF1ab、N、28144、8782、26144、29095)；
所述的引物和探针组合包括，
1)引物序列组合，如表1所示；
2)探针序列组合，如表2所示；
3)样品质量控制参照位点RNaseP，其中引物的样品质量控制参照位点RNaseP序列如SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76所示，探针的样品质量控制参照位点RNaseP序列如SEQ IDNO.114所示；
表1
表2
2.基于多重PCR飞行时间质谱的多重呼吸道病原体核酸检测及鉴定新冠病毒分型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有如权利要求1所述的引物和探针组合，还包括检测所需的检测试剂。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Application publication date: 20201103 |
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