CN113215322B - Maldi-tof ms检测生殖道病原体的引物组合物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于飞行时间质谱法检测8种生殖道病原菌及两种人乳头瘤病毒分型特定位点的引物组、产品及非诊断检测方法，所述生殖道病原菌包括金黄色葡萄球菌、B族链球菌、淋病奈瑟菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、生殖支原体、解脲支原体、沙眼衣原体以及HPV16、HPV18病毒分型。本发明首次提出利用多重PCR结合临床质谱实现对10种生殖道病原体的检测提供新的方法，并综合了多重PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用PCR检测病原体特定片段，具有较高的检测灵敏度。

Description

MALDI-TOF MS检测生殖道病原体的引物组合物及用途

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种利用激光飞行时间质谱技术快速鉴定10种生殖道病原体的的引物组合物及用途。

背景技术

据世界卫生组织最新调查报告显示，对于成年女性而言，最常见的疾病不是感冒，而是生殖道感染，患病几率高达90％以上；最常见的不适症状不是发热、咳嗽、头痛等，而是阴部瘙痒、异味、疼痛，以及尿频，尿急等。而且女性许多其它疾病的发生也与生殖系统的功能异常密切相关，如骨质疏松、冠心病、糖尿病、黄褐斑等。从某种意义上讲，生殖系统的问题关乎女人一生的健康和幸福，也可以说是女人的“百病之源”。女性生殖道感染是发生在女性从外阴口至子宫这段腔道因细菌、病毒、寄生虫等病原微生物引起的感染性疾病，主要包括阴道炎(念珠菌性、滴虫性、老年性、细菌性阴道病)、淋病、宫颈炎(息肉、那氏囊肿)、盆腔炎等，是妇女的常见病，几乎每个成年女性和部分少女都曾有过。女性生殖道感染具有患病率高、无症状比例高、不就诊的比例高和得不到合理治疗比例高的特点，导致各种严重并发症和后遗症。女性生殖健康水平直接影响着人口素质，不容忽视。女性生殖道感染已经成为全球范围内危害严重的重要传染病之一。女性生殖感染相关因素由于女性生殖道因解剖、生理、性活动、分娩和卫生习惯等多种因素影响，易发生多种感染。

生殖道感染是妇科常见疾病，由细菌、病毒、白色假丝酵母菌、原虫、支原体、衣原体等多种病原体的侵袭所致，包括女性下生殖道的外阴炎、阴道炎、宫颈炎和上生殖道的盆腔炎性疾病。生殖道感染具流行范围广、复发率高、就诊率低的特点，是最常见的妇科疾病，国内患病率高达42.9％。生殖道感染若得不到及时诊断和正确治疗，可增加性传播疾病感染的风险，会引起异常子宫出血、不孕症、异位妊娠、慢性盆腔痛、流产、胎膜早破、早产、死胎、死产及先天性感染等并发症及后遗症，不仅危害妇女健康，还可危害胎儿及新生儿。生殖道感染已成为严重影响女性健康的社会公共卫生问题，给家庭及社会带来严重负担。

生殖道微生物菌群种类繁多，协调共生、相互制约，可以与宿主发生一系列复杂的相互作用，显著影响生殖道的生理机能和免疫功能，并在抵御机会性病原体的定植过程中发挥“第一道防线”作用。生殖道微生态环境的不平衡可导致女性趋向于发生各种妇科疾病，如阴道炎症、不孕不育、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌等等。阴道炎可由一种病原体所致，单纯的病原体诊治相对简单，但我国阴道炎中有50％左右为混合性感染，利用生殖道微生态系统检测有利于精准诊治阴道混合性感染。近年来，随着女性不孕症的患病率逐年升高，不孕症越来越受到人们的关注。不孕症的发病机制复杂，其中女性生殖道微生物群落失衡与女性不孕不育密切相关。通过临床检测与评价女性阴道微生态平衡，对于女性不孕不育的诊治具有重要意义。高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是医学上公认的宫颈癌发生的主要原因和必要条件，其中HPV16和HPV18的感染与宫颈癌的发病密切相关。但感染HPV后仅5％-10％最终发展为宫颈癌前病变甚至宫颈癌。目前发现，生殖道微生态的不平衡可能是造成HPV持续感染继而发生宫颈病变的协同因素。重建及保护生殖道微生态平衡，尤其是维持乳杆菌为主、阴道正常的酸性环境，为HPV感染及相关宫颈疾病治疗提供研究的新方向。

生殖道病原体是人体重要的微生态体系之一，它们与宿主、环境之间构成了相互制约、相互协调的微生态平衡，这种动态平衡在维护女性生殖道健康中起到关键作用。女性生殖道病原体包括金黄色葡萄球、溶血性链球菌、淋病奈瑟菌、B族链球菌、大肠埃希菌、阴道加德纳菌、白色假丝酵母菌、支原体、沙眼衣原体和HPV等。

目前常用的病原体检测方法有实时荧光定量PCR法、PCR-毛细管电泳法、高通量测序法。但是，实时荧光定量PCR法检测通量低，难以对多种病原菌同时进行检测。PCR-毛细管电泳法虽然在自动化程度和分析时间上有了较大提升，但其检测通量远低于近年来新兴的分子生物学检测手段。高通量测序(NGS)能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，在临床病原菌检测中发挥重要作用，但是NGS技术对设备要求高、技术门槛高、平台构建需要大量资金投入，难以在临床应用领域进行推广。因此，临床应用领域迫切需要建立一种快速、准确、灵敏、高通量的生殖道病原体检测体系，为疾病的诊断、治疗及评估预后提供充足的依据。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，简称MALDI-TOF MS)技术，是20世纪80年代末问世并迅速发展起来的一种质谱分析技术。其质量分析器是一个离子漂移管(iondirft tube)，由离子源产生的离子首先被收集，在收集器中所有离子速度变为0，使用一个脉冲电场加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器，离子质量越大，到达接收器所用时间越长；离子质量越小，到达接收器所用时间越短。根据这一原理，可以把不同质量的离子按质荷比大小进行分离，准确检测多肽、蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分子质量和纯度，具有准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短、性价比高的优点。

早期的MALDI-TOF MS质谱技术来检测临床微生物，主要是针对微生物的特征蛋白。林豪芸(“基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在临床微生物鉴定中的应用”，《中国人兽共患病学报》，2014年第8期)报道了“由于每种微生物都有其独特的蛋白质组成，与传统方法依靠微生物生理生化特性不同，蛋白质组成很少受到环境条件的影响，主要由遗传特性所决定，因此MALDI-TOF MS更加准确与可靠。在众多的方法之中，MALDI-TOF MS的一个主要优点是其鉴定微生物的普遍性。它可以同时分析大量目标且不要求选择特定的识别抗体或引物，而对发生基因变异的微生物，MALDI-TOF MS至少可以把他们鉴定到最近的邻居数据库中”。然而，该报道指出，虽然可以检测2-3种细菌的组分，“但当混合物中某一个物种数量占强烈主导地位时，MALDI-TOF MS的鉴定能力明显受限”。

中国专利申请CN102337223A，“产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制备方法”，公开了一种检测产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALDI-TOF鉴定方法，其中从平板上挑取产黄青霉A096孢子接种于SGY液体培养基培养，预处理得到粗蛋白溶液在色谱柱上分离纯化，并在羧甲基阳离子交换色谱柱上分离纯化，收集各洗脱组分，各组分离心超滤浓缩至所需体积，以宛氏拟青霉为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分判断获得蛋白的纯度；割取SDS-PAGE电泳图上的单一条带，进行MALDI-TOF鉴定。该方法仅适用于特定微生物，且需要多重蛋白纯化过程，最终用MALDI-TOF鉴定特征蛋白Pc-Arctin，其过程繁琐，适用面窄，不能实现质谱分类细菌或微生物的目的。

中国专利申请201110154723、“MALDI TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法”公开了一种利用MALDI TOF MS技术辅助鉴定细菌的方法，包括：预处理细菌培养物，采集所有菌株样品的MALDI TOF MS图谱，根据软件制备细菌标准图谱，使用相同的方法检测并采集待测细菌的图谱，以及比较二者图谱，根据匹配分数进行判定。由于该方法使用常规的处理(通过无水乙醇、甲酸和乙腈处理，并辅以离心，最后吸取上清液进行检测)，尽管其在一定程度上能表征该细菌的特征图谱，但由于其待测物中含有蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体细菌而无法推广到其他大量的细菌检测中。

已有一些公开文献使用MALDI-TOF MS质谱技术对生殖道病原体进行分类和鉴定，例如，麻雅婷(“应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱研究白色念珠菌血流感染的血清多肽指纹图谱”，《解放军医学杂志》，2018年1月1日，第43卷第1期)报道了通过建立白色念珠菌血流感染小鼠模型，应用MALDI-TOF MS联合弱阳离子交换磁珠(weak cationexchange，WCX)提取多肽技术，研究其血清多肽，并通过分析比较差异多肽峰建立相应的诊断模型，以辅助诊断真菌性的血流感染。虽然该诊断模型能够用于检测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，但由于该方法需要从大量特征多肽片段中摸索出特征性曲线图峰值，并且各菌的多肽片段相互干扰，因此对于检测效果存在一定影响。

在检测临床微生物特征蛋白的基础上，近年来发展了MALDI-TOF MS检测临床微生物特征核酸片段的技术，该理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP的分子量依次为271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTMP是经过修饰的)，它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点(SNP)、插入/缺失(InDel)、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化(copy number variation，CNV)等多种DNA变化类型进行检测。

中国专利申请201210272533.6“建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法及其产品”，公开了一种基于质谱技术快速鉴定幽门螺杆菌的方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录和核酸酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。该方法利用飞行时间质谱技术，对分子量和丰度各异的核酸片段进行检测，并形成谱图。但是，该方法中核酸片段经PCR扩增后，还需经过SAP酶消化、转录和核酸酶切，仅能识别单个碱基的变化，无法检测有特征序列的长片段DNA。

此外，基于MALDI-TOF MS，开发了一些核酸检测方法，如美国Agena公司的hME和iPLEX方法，德国Bruker公司的GOOD assay方法，韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。各公司为了提高质谱仪的分辨率，对目标位点进行检测倾向于检测分子量较小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通过对含单核苷酸多态性(SNP)位点的多重PCR产物进行限制性酶切，产生2000～4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测，而GOOD assay方法通过磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)将含SNP位点的寡核苷酸片段切割成1000～2000Da左右的小片段进行检测。然而，以上方法，都不可避免地存在操作复杂，耗时长等问题。

由于现有的利用MALDI-TOF MS检测临床病原体的技术，多数针对少数2-3种病原体进行检测，或是针对同一病原体的不同靶点或特定位点进行检测，因此目前缺少一种能同时对女性生殖道病原体，如金黄色葡萄球菌、B族链球菌、淋球菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、生殖支原体、解脲支原体、沙眼衣原体和人乳头瘤病毒(HPV16和HPV18)能快速、高效、准确的检测技术。

发明内容

基于上述技术存在的缺陷或不足，本发明原理之一在于：本发明提供了一种联合PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测与待测病原体分型相关的特征片段的特征图谱。其中，针对10种病原体(金黄色葡萄球、B族链球菌、淋球菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、生殖支原体、解脲支原体、沙眼衣原体和HPV16和HPV18)，设计10种引物组，在多重PCR中同时扩增10种病原体的含有特定靶序列的DNA片段产物，并通过高效的单碱基引物对上述产物进行单碱基延伸，即延伸引物在10个特定位点处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与该位点处的基因型相关。随后，对延伸产物进行纯化，通过MALDI TOFMS质谱对纯化后的待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的扩增产物的理论分子量进行比较，从而确定延伸产物中的待检测病原体类型。

本发明原理之二在于，为了解决多重PCR产物的相互干扰，以及排除不适宜的待检位点，本发明进行了优化筛选，从而确定了优化的扩增产物组合和延伸引物组合。

本发明原理之三在于，在多重PCR体系进一步优化过程中，为了使得延伸引物和延伸产物的分子量尽量分布在理想的质谱检测窗口(即4000～9000Da)，本发明在扩增引物中引入不影响PCR扩增的tag序列，使得最终的10种延伸产物既落入检测窗口，同时各自区分，避免了分子量的叠合，从而提高了检测准确率和灵敏度。

因此，本发明第一个目的是提供一种MALDI TOF-MS检测10种生殖道病原体特征片段引物组合物，其包括：

表1

其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量，以及所扩增片段的特征峰值如表2所示。

表2

在一个实施方案中，上述PCR扩增引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag(ACGTTGGATG)，例如，PCR引物SEQ ID NO:1为5'-ACGTTGGATGGCCGTTATCTGTTTGTGATG-3’。在另一具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。

本发明第二个目的是提供了通过上述引物组合物所制备的检测产品，该检测产品可通过MALDI TOF MS来检测10种生殖道病原体检测相关的特征片段，其中，所述病原体的特征片段及对应的PCR扩增引物和延伸引物选自：

金黄色葡萄球的nuc片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 1-2，延伸引物SEQ 21；

B族链球菌的scpB片段及对应的PCR扩增引物为SEQ3-4，延伸引物SEQ 22；

淋病奈瑟菌的NG片段及对应的PCR扩增引物为SEQ5-6，延伸引物SEQ 23；

阴道加德纳菌的16sRNA片段及对应的PCR扩增引物为SEQ7-8，延伸引物SEQ 24；

白色念珠菌的ITS片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 9-10，延伸引物SEQ 25；

生殖支原体的PA片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 11-12，延伸引物SEQ 26；

解脲支原体的UreA片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 13-14，延伸引物SEQ 27；

沙眼衣原体的PmpF片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 15-16，延伸引物SEQ 28；

HPV16的L1片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 17-18，延伸引物SEQ 29；

HPV18的L1片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 19-20，延伸引物SEQ30。

在一个实施方案中，该产品为检测试剂盒，包括：

(1)用于PCR扩增的反应液I，包括：PCR扩增引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液(包含dNTPs、Tris-HCl、MgCl₂)；

(2)用于PCR产物纯化的反应液II，其含有Tris-HCl、MgCl₂；

(3)用于单碱基延伸反应的反应液III，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液，其含有Tris-HCl、MgCl₂。

在一个具体实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，人基因组DNA提取试剂等试剂。

上述实施方案中，其中在所述PCR扩增的反应体系中含有：

余量为双蒸水补足至5μl。

在实施方案中，其中每组引物对的浓度控制在0.5-2μM之间。

其中在PCR扩增反应程序为：50℃预处理2min，然后在95℃预变性2min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行45个循环；72℃延伸5min。

其中SAP酶消化反应过程：向5ul扩增产物中加入1.5μL反应液II、0.5μL酶II，并在37℃下30min，65℃下5min各1个循环。

延伸反应过程：在消化产物中加入0.83μL反应液II、0.23μL酶II，0.94μL延伸引物，并在94℃下30s一个循环；94℃下5s，随后5个循环的56℃下5s和80℃下5s，共40个循环；最后在72℃下5分钟，共1个循环。

在上述任一实施方案中，其中延伸反应完毕后，在产物分析区向每PCR管/孔延伸产物中加入41μL超纯水和15mg树脂，颠倒混匀5分钟，5000rpm离心1min。

本发明第三个目的是使用上述引物组合物、检测产品来检测10种生殖道病原体的特征片段方法，包括如下步骤：

(1)多重PCR：使用特异性的PCR扩增引物，在一个反应体系中，对10种生殖道病原体的目的DNA区域同时进行扩增，得到含10处特定位点所在DNA区域的PCR产物；

(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；

(3)单碱基延伸：使用10种特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对位病原体特定位点处伸一个核苷酸，该核苷酸与特定位点处的基因型互补配对；

(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；

(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测；

其中，所述病原体的特征片段及对应的PCR扩增引物和延伸引物选自：

金黄色葡萄球的nuc片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 1-2，延伸引物SEQ 21；

B族链球菌的scpB片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 3-4，延伸引物SEQ 22；

淋病奈瑟菌的NG片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 5-6，延伸引物SEQ 23；

阴道加德纳菌的16sRNA片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 7-8，延伸引物SEQ 24；

白色念珠菌的ITS片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 9-10，延伸引物SEQ 25；

生殖支原体的PA片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 11-12，延伸引物SEQ 26；

解脲支原体的UreA片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 13-14，延伸引物SEQ 27；

沙眼衣原体的PmpF片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 15-16，延伸引物SEQ 28；

HPV16的L1片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 17-18，延伸引物SEQ 29；

HPV18的L1片段及对应的PCR扩增引物为SEQ 19-20，延伸引物SEQ30。

在一个实施方案中，步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。

在一个实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag(ACGTTGGATG)，例如，PCR引物SEQ ID NO:1为5'-ACGTTGGATGGCCGTTATCTGTTTGTGATG-3’。此外，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。

在上述任一实施方案中，该方法可作为非诊断目的的应用，广泛用于对环境卫生、食品安全检测、进出口检验检疫等领域的病原体进行鉴定，以维护公共卫生安全。

本发明第四目的是提供一种用作上述质谱鉴定生殖道病原体的核酸指纹图谱库的制备方法，包括如下步骤：

(1)针对10种病原体的目的片段设计引物，并把这些片段连接到质粒载体上进行转化，合成了分别包含该10个目的片段的10个质粒，其中，

金黄色葡萄球菌的nuc目的片段的特异性引物组选自：SEQ1和SEQ2；

B族链球菌的scpB片段目的片段的特异性引物组选自：SEQ3和SEQ4；

淋病奈瑟菌的NG片段目的片段的特异性引物组选自：SEQ5和SEQ6；

阴道加德纳菌的16sRNA片段目的片段的特异性引物组选自：SEQ7和SEQ8；

白色念珠菌的ITS片段目的片段的特异性引物组选自：SEQ9和SEQ10；

生殖支原体的PA片段目的片段的特异性引物组选自：SEQ11和SEQ12；

解脲支原体的UreA片段目的片段的特异性引物组选自：SEQ13和SEQ14；

沙眼衣原体的PmpF片段目的片段的特异性引物组选自：SEQ15和SEQ16；

HPV16的L1片段目的片段的特异性引物组选自：SEQ17和SEQ18；

HPV18的L1片段目的片段的特异性引物组选自：SEQ19和SEQ20；

(2)提取10种质粒的混合DNA，并用步骤(1)中的引物组对上述混合DNA进行多重扩增，同时设置空白对照和阴性对照；

(3)对多重PCR产物进行纯化；

(4)加入单碱基延伸引物和延伸反应液，对扩增产物进行单碱基延伸，其中，

金黄色葡萄球菌的nuc目的片段的延伸引物选自：SEQ21；

B族链球菌的scpB片段目的片段的延伸引物选自：SEQ22；

淋病奈瑟菌的NG片段目的片段的延伸引物选自：SEQ23；

阴道加德纳菌的16sRNA片段目的片段的延伸引物选自：SEQ24；

白色念珠菌的ITS片段目的片段的延伸引物选自：SEQ25；

生殖支原体的PA片段目的片段的延伸引物选自：SEQ26；

解脲支原体的UreA片段目的片段的延伸引物选自：SEQ27；

沙眼衣原体的PmpF片段目的片段的延伸引物选自：SEQ28；

HPV16的L1片段目的片段的延伸引物选自：SEQ29；

HPV18的L1片段目的片段的延伸引物选自：SEQ30；

(5)将延伸引物产物直接与基质形成结晶混合物，点样于同一张芯片上；

(6)质谱仪检测，得到含有10种目的片段的特征核酸指纹图谱；

(7)将步骤(6)得到的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件与空白对照、阴性对照、阳性对照进行比对分析，得到10种生殖道病原体的标准核酸指纹特征图谱。

在一个实施方案中，上述10种目的片段的核酸指纹特征图谱所对应的分型的特定片段分子量以及质谱特征峰值分别为：

金黄色葡萄球菌的nuc目的片段：6077(m/z)；

B族链球菌的scpB片段目的片段：5447.6(m/z)；

淋病奈瑟菌的NG片段目的片段：5288.3(m/z)；

阴道加德纳菌的16sRNA片段目的片段：5919.8(m/z)；

白色念珠菌的ITS片段目的片段：6363.2(m/z)；

生殖支原体的PA片段目的片段：6694.4(m/z)；

解脲支原体的UreA片段目的片段：5997.9(m/z)；

沙眼衣原体的PmpF片段目的片段：6986.6(m/z)；

HPV16的L1片段目的片段：8241.3(m/z)；

HPV18的L1片段目的片段：5424.6(m/z)。

在一个实施方案中，所述DNA吸附柱的固相支持物包括但不限于凝胶、树脂、硅土、硅胶、磁珠、玻璃粉、玻璃珠等。在一个具体实施方案中，所述基质为含有酸性成分的复合基质，该酸性成分包括但不限于甲酸、乙酸和柠檬酸。在另一个具体的实施方案中，所述芯片为飞行时间质谱专用微阵列芯片，其材质包括但不限于不锈钢、金刚石、单晶硅、石英晶体。

在另一实施方案中，步骤(2)中利用NanoDrop ND-2000核酸检测仪测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为敏感度的标准品定量母液。

在其他实施方案中，上述PCR扩增引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag(ACGTTGGATG)，例如，PCR引物SEQ ID NO:1为5'-ACGTTGGATGGCCGTTATCTGTTTGTGATG-3’。在另一具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。。

在一个具体实施方案中，所述质谱仪为MALDI TOF MS质谱仪。

在一个实施方案中，所述软件是发明人自行研究开发的BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号，登记号2009SR10700。

技术效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明首次提出利用多重PCR结合临床质谱实现对10种生殖道病原体相关特定片段的多重检测，具有极高的生物学价值。

2、敏感：本发明综合了多重PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用PCR检测病原体特定片段，因此它的检测灵敏度很高。

3、特异：单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对核酸分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低；

4、简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染；

5、本发明通过鉴定与病原体分型相关的特定位点的特征图谱，从而完成相关的病原体检测。本发明克服了以往技术一次性检测病原体类别过少的缺陷,成本低廉。

6、本发明所需的数据分析简单,只需观察谱图,无需复杂的生物信息学分析。

7、本发明成本低,无需荧光标记,降低了荧光化学探针加入导致的系统复杂性信号判读误差。

8、高自主化，使用自主研发的仪器、试剂、芯片和分析软件。

附图说明

见文末。

原理与定义

本发明提供了一种联合多重PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测10种生殖道病原体特定片段或位点的特征图谱，进而确定待检病原体类型的检测方案。

其原理在于：

在多重PCR步骤中，通过设计并使用合适的引物，从而能同时扩增10个特定位点所在DNA特定片段。

在单碱基延伸步骤中，对上一步多重PCR的产物依次进行纯化和多重单碱基延伸。其中，延伸引物共10条，分别与10个特定位点对应，并在对应的特定位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与特定位点处的基因型互补配对(如某特定位点处是A基因型，将在对应的延伸引物上延伸T核苷酸)。在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸。

在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在纯化后，点至含基质的靶片，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与它们的分子量呈负相关，即分子量越大，飞行速度越慢，到达检测器的时间越晚。

术语“保护碱基”，指在PCR引物的5'端额外增加的碱基。由于保护碱基的序列使得PCR引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。此外，延伸引物的5'端也可以适量增加碱基序列，但其作用并非如同PCR引物的保护碱基，使其超出检测窗口，而是适当调整延伸引物的分子量，使延伸引物及其产物在检测窗口内处于一个合理的位置。例如，当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一个延伸引物增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距，以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清，从而提高检测效果。因此，增加碱基后的延伸引物及产物的分子量，一定不会超出检测窗口。上述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。

术语“碱性磷酸酶消化”，其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使dNTP的5'-P末端转换成5'-OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一步单碱基延伸的影响。

术语“外切酶ExoI消化”，其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA的dNTP之间3,5-磷酸二酯键，使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR反应后残余的PCR引物。由于外切酶可以将单链的PCR引物切除，并不会在检测窗口中出现，因此使用该外切酶时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

术语“单碱基延伸”，又被称之为微测序(mini sequence)，指在体系中加入延伸引物和ddNTP，ddNTP与延伸引物的3'端连接形成延伸产物(即引物延伸了一个碱基)，根据碱基互补配对原则，由特定位点处基因型决定具体连接何种ddNTP，这个过程类似于PCR过程中dNTP根据互补链的碱基组成，逐个添加到PCR引物上。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是，在脱特定位点处连接一个ddNTP，而不能像PCR那样，不断的往下延伸，因此称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，测序引物连接dNTP后将继续延伸，只有连接ddNTP后，方终止延伸，因此测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物；单碱基延伸体系中加入只有ddNTP，延伸引物只能连接一个ddNTP，并终止延伸，因此单碱基延伸产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。

术语“检测产品”，指用于检测特定位点基因型的任何常规产品，包括：检测试剂、检测芯片、检测载体，以及检测试剂盒等。

术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸，本技术方案共采用四种，它们之间存在分子量差异，如ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTTP是修饰后的分子量)。当延伸引物根据特定位点的基因型而延伸不同的核苷酸，将形成分子量差异。通过质谱检测，可分辨出这种差异。例如，某特定位点若是A/G多态，对应的延伸引物长度为22个碱基(分子量7200Da)，当该位点处是A基因型，延伸引物将延伸一个T核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量7487.2Da的延伸产物，当该位点处是G基因型，延伸引物将延伸一个C核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量7447.2Da的延伸产物，两种产物之间存在40Da的分子量差异。即对该位点而言，若使用此7200Da的延伸引物，G基因型将对应7447.2Da的质谱峰，A基因型将对应7487.2Da的质谱峰。

术语“纯化”，指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的PCR产物纯化有两种方式：一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离杂质，并回收相对较纯的PCR产物，可以认为是第一种纯化方式，该方式一般耗时，操作复杂，特别是样本量大时；碱性磷酸酶的作用是降解(亦称“消化”)dNTP，使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，可以认为是第二种纯化方式。应当指出的是，单独的外切酶ExoI不起纯化作用，当它与碱性磷酸酶混合使用时，其作用是预先将单链DNA(在反应完成后的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP，再由碱性磷酸酶使dNTP继续降解。由于PCR引物被降解，不会进入最后的质谱检测步骤，因此，如果计划纯化步骤中增加ExoI外切酶处理，那么无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外，在单碱基延伸步骤之前，由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温失活，其不会降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等，因此避免对后续实验产生影响。

术语“m/z”质荷比是质量跟电荷的比，在谱图里面所得到的最大分子质量与最小电荷(即1个电荷)的比，也可以表示为分子量(Da，即相对分子量)。

术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。其中，在设计延伸引物时，对于不同的特定位点，根据这些位点所在DNA区域的序列特点，以及特定位点的基因型，可以设计出分子量不同的延伸引物和延伸产物，避免不同延伸引物及产物之间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对宽阔的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多个特定位点的检测。

应当指出的是，鉴于以上核酸质谱的特殊性，例如，其需先通过PCR反应扩增出含特定位点的片段，然后通过延伸引物延伸出特定位点的碱基；各特定位点的PCR反应、延伸反应间无明显干扰；各特定位点的延伸引物、产物间分子量要有足够大的差异以便实现区分等，因此，并非所有的位点均可以用来进行核酸质谱的检测，也并不是所有针对特定位点设计的引物均可用以进行多重PCR反应和多重单碱基延伸反应。例如，Cláudia M.B等人(Optimization of a multiplex minisequencing protocol for population studiesand medical genetics，Genet.Mol.Res 4(2005)115-125)指出，在进行多重PCR反应前需首先对单重PCR的反应效果进行验证，如果单重PCR扩增效率低则需要放弃，另外，若PCR产物长度偏长，多重PCR效果会比较差，也需要放弃。

此外，在核酸质谱检测过程中，多重扩增过程的干扰作用，对于最终获得的延伸产物也存在影响。Sascha Sauer等人(Typing of single nucleotide polymorphisms byMALDI mass spectrometry:Principles and diagnostic applications，ClinicaChimica Acta 363(2006)95–105)和Heyi Yang等人(Multiplex single-nucleotidepolymorphism genotyping by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，Analytical Biochemistry 314(2003)54–62)在利用MALDI质谱技术研究核酸质谱检测过程中提出，所设计的多重引物应具有相近的熔解温度(Tm值)并彼此间的相互作用力较弱。如果引物之间的相互作用力过于强烈(ΔG的最小值为-10kcal/mol)，那么必须放弃该理论设计的引物而重新进行设计；当同一反应体系中存在多重反应引物，那么多重扩增的规模主要受限于引物之间的相互作用程度，从而影响核酸质谱检测过程；此外，为了准确区分不同碱基之间的差异，特别是腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(4种碱基中这二者分子量之间差值最小，为9Da)，要求的寡核苷酸长度一般不超过40个碱基，实际应用中，质谱检测窗口的分子量范围一般为4000～9000Da，即要求所涉及的延伸引物和产物的分子量尽量分布在4000～9000范围之内。同时，要避免各延伸引物及其延伸产物之间的叠合。由此可见，并非所有特定位点均可应用于核酸质谱尤其是多重核酸质谱的检测，其实际效果会受到多种实验因素的影响，因此需要通过实验来验证特定位点的可行性以及筛选不同引物的组合。

附图说明：

图1-图13：实施例二中对待测病原体DNA进行核酸质谱检测的各组空白对照、阴性 对照、阳性对照和待测样品的质谱结果图，其中箭头所示为，

图1为金黄色葡萄球菌的nuc目的片段(6077Da)所对应的特征峰：6077m/z；图2为B族链球菌的scpB片段目的片段(5447.6Da)所对应的特征峰：5447.6m/z；图3为淋病奈瑟菌的NG片段目的片段(5288.3Da)所对应的特征峰：5288.3m/z；图4为阴道加德纳菌的16sRNA片段目的片段(5919.8Da)所对应的特征峰：5919.8m/z；图5为白色念珠菌的ITS片段目的片段(6363.2Da)所对应的特征峰：6363.2m/z；图6为生殖支原体的PA片段目的片段(6694.4Da)所对应的特征峰：6694.4m/z；图7为解脲支原体的UreA片段目的片段(5997.9Da)所对应的特征峰：5997.9m/z；图8为沙眼衣原体的PmpF片段目的片段(6986.6Da)所对应的特征峰：6986.6m/z；图9为HPV16的L1片段目的片段(8241.3Da)所对应的特征峰：8241.3m/z；图10为HPV18的L1片段目的片段(5424.6Da)所对应的特征峰：5424.6m/z；图11为阳性对照，从左至右分别为：淋病奈瑟菌NG片段(5288.3Da)所对应的特征峰：5288.3m/z；HPV18 L1片段(5424.6Da)所对应的特征峰：5424.6m/z；B族链球菌scpB片段(5447.6Da)所对应的特征峰：5447.6m/z；阴道加德纳菌16sRNA片段(5919.8Da)所对应的特征峰：5919.8m/z；解脲支原体UreA片段(5997.9Da)所对应的特征峰：5997.9m/z；金黄色葡萄球菌nuc目的片段(6077Da)所对应的特征峰：6077m/z；白色念珠菌ITS片段(6363.2Da)所对应的特征峰：6363.2m/z；生殖支原体PA片段(6694.4Da)所对应的特征峰：6694.4m/z；沙眼衣原体PmpF片段(6986.6Da)所对应的特征峰：6986.6m/z；HPV16 L1片段(8241.3Da)所对应的特征峰：8241.3m/z；图12为阴性对照，谱图均为延伸引物出峰位置，无阳性靶标特征峰(延伸产物峰)，即未检出任何阳性病原体；图13为空白对照，谱图均为延伸引物出峰位置，无阳性靶标特征峰(延伸产物峰)，即未检出任何阳性病原体；

图14-图30：实施例四中对患者病原体DNA的质谱结果图，其中箭头所示，图14 N1，检测峰值(m/z)分别是：5919.8，6363.2，5997.9；图15 N2，检测峰值(m/z)分别是：6363.2；

图16 N3，检测峰值(m/z)分别是：6694.4；图17 N4，检测峰值(m/z)分别是：5919.8，6363.2；图18 N5，检测峰值(m/z)分别是：5919.8；图19 N6，检测峰值(m/z)分别是：8241.3；图20 N7，检测峰值(m/z)分别是：6363.2；图21 N8，检测峰值(m/z)分别是：6363.2；图22 N9，检测峰值(m/z)分别是：5288.3；图23 N10，检测峰值(m/z)分别是：6363.2，6077；图24 N11，检测峰值(m/z)分别是：6077；图25 N12，检测峰值(m/z)分别是：5424.6；图26N13，检测峰值(m/z)分别是：5919.8，6363.2；图27 N14，检测峰值(m/z)分别是：6986.6；图28 N15，检测峰值(m/z)分别是：5447.6，6363.2；图29 N16，检测峰值(m/z)分别是：6694.4；图30 N17，检测峰值(m/z)分别是：6363.2，6077；

图31-图33：实施例四中空白对照、阴性对照、阳性对照质谱结果图。其中，

图31空白对照，谱图均为延伸引物出峰位置，无阳性靶标特征峰(延伸产物峰)，即未检出任何阳性病原体；图32阴性对照，谱图均为延伸引物出峰位置，无阳性靶标特征峰(延伸产物峰)，即未检出任何阳性病原体；图33阳性对照从左至右分别为：淋病奈瑟菌NG片段(5288.3Da)所对应的特征峰：5288.3m/z；HPV18 L1片段(5424.6Da)所对应的特征峰：5424.6m/z；B族链球菌scpB片段(5447.6Da)所对应的特征峰：5447.6m/z；阴道加德纳菌16sRNA片段(5919.8Da)所对应的特征峰：5919.8m/z；解脲支原体UreA片段(5997.9Da)所对应的特征峰：5997.9m/z；金黄色葡萄球菌nuc目的片段(6077Da)所对应的特征峰：6077m/z；白色念珠菌ITS片段(6363.2Da)所对应的特征峰：6363.2m/z；生殖支原体PA片段(6694.4Da)所对应的特征峰：6694.4m/z；沙眼衣原体PmpF片段(6986.6Da)所对应的特征峰：6986.6m/z；HPV16 L1片段(8241.3Da)所对应的特征峰：8241.3m/z。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件实施。

需特别指出的是，尽管本发明的实施例中呈现的是50,000Da以下多重PCR产物的质谱检测数据，但50,000-100,000Da之间的多重PCR产物也可检测到，因此应用本发明对50,000-100,000Da之间的多重PCR产物质谱检测也包括在本发明所要求的权利范围之内。

实施例一、引物设计

本发明中所有检测目标区域都是单区域检测，PCR引物，与上述各参考PCR引物的3'端对应，保证能扩增，5'端由Primer5引物设计软件，根据扩增效率和多重PCR兼容性进行了调整，不影响引物的特异性，不会增加引物的非特异性。

针对10种病原体的目的检测区段(金黄色葡萄球菌的nuc片段、B族链球菌的scpB片段等)设计引物，经过检索NCBI数据库，各病原体目的片段来源如下：

金黄色葡萄球菌的目的片段：金黄色葡萄球菌的目的片段选自nuc片段，>DQ399678.1:1-450 Staphylococcus aureus nuclease(nuc)gene,partial cds，其序列号为DQ399678.1；

B族链球菌的目的片段：B族链球菌的目的片段选自scpB片段：>CP053027.1:1577249-1577698 Streptococcus agalactiae strain 01173 chromosome,completegenome，其序列号为CP053027.1；

淋病奈瑟菌的目的片段：淋病奈瑟菌的目的片段选自NG片段，>AP023076.1:1148-1597 Neisseria gonorrhoeae TUM16691 plasmid pMTY16691 DNA,complete genome，其序列号为AP023076.1；

阴道加德纳菌的目的片段：阴道加德纳菌的目的片段选自16sRNA片段，>L08167.1Gardnerella vaginalis 3'end of 16S ribosomal RNA,internal transcribed spacer,and 5'end of 23S ribosomal RNA，其序列号为L08167.1；

白色念珠菌的目的片段：白色念珠菌的目的片段选自ITS片段，>MK805514.1:77-526 Candida albicans strain TBS611 small subunit ribosomal RNA gene,partialsequence；internal transcribed spacer 1,5.8S ribosomal RNA gene,and internaltranscribed spacer 2,complete sequence；and large subunit ribosomal RNAgene,partial sequence，其序列号为MK805514.1；

生殖支原体的目的片段：生殖支原体的目的片段选自PA片段，>KP318805.1:413-862 Mycoplasma genitalium strain Seattle1 MgpB adhesin gene,complete cds，其序列号为KP318805.1；

解脲支原体的目的片段：解脲支原体的目的片段选自UreA片段，>X51315.1:374-823 Ureaplasma urealyticum DNAfor urease subunits alpha,beta and gamma(EC3.5.1.5)，其序列号为X51315.1；

沙眼衣原体的目的片段：沙眼衣原体的目的片段选自PmpF片段，>CP035484.1:326414-326863 Chlamydia trachomatis strain tet9 chromosome,complete genome，其序列号为CP035484.1；

HPV16的目的片段：HPV16的目的片段选自L1片段，>MN542782.1:934-1383 Humanpapillomavirus type 16isolate HPV16/Kp/L1/2019 L1 protein(L1)gene,completecds，其序列号为MN542782.1；

HPV18的目的片段：HPV18的目的片段选自L1片段，>MH057749.1:1025-1474 Humanpapillomavirus type 18isolate HPJ18-7 L1(L1)gene,complete cds，其序列号为MH057749.1；

将以上这些片段连接到质粒载体上进行转化，合成了分别包含该10个目的片段的10个质粒。

质粒构建过程如下所述：本发明中所用的质粒载体为在商品化质粒pGH Vector(上海捷瑞生物工程有限公司)的基础上，根据《分子克隆》记载的常规方法，将PCR产物插入pGH Vector，即构建包含该10个目的片段的10个质粒。所述质粒可长期保存于-20℃甘油中，用时活化并提取质粒DNA。

经鉴定后提取质粒DNA，利用NanoDrop ND-2000核酸检测仪测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为敏感度的标准品定量母液。

引物来自于目标DNA的保守序列，可选地根据需要加入tag序列，使多重PCR产物的大小能够容易地由MALDI-TOF MS进行区分。

每个质粒及其对应的特异性PCR引物信息如表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1.引物信息表

实施例二、构建10种病原体的检测质谱模型

使用ABI 9700型PCR仪，按说明书对10种生殖道病原体相关的特定位点进行检验。

本实施例使用检测10种生殖道病原体的多重引物体系，构建10种病原体的检测质谱模型。设置空白对照为去离子水、阴性对照为人类基因组DNA，阳性对照为检测10种生殖道病原体的各靶标的质粒混合物。

试剂盒中用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分为：

序号	组分名称	主要成分	包装规格
				1	反应液I	dNTPs、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>	323μL/管×1管
2	酶I	扩增酶、UNG酶	23μL/管×1管
				3	扩增引物	10对PCR引物	115μL/管×1管
4	反应液II	Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>	173μL/管×1管
				5	酶II	SAP酶	58μL/管×1管
6	反应液III	ddNTPs、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>	112μL/管×1管
				7	酶III	延伸酶	31μL/管×1管
8	延伸引物	10条延伸引物	126μL/管×1管
				9	质控品	质粒混合物	50μL/管×1管

按说明书，具体操作方法如下：

1.PCR扩增

1.1在PCR配液区，按照待检样品数(含阳性质控品、阴性对照、空白对照)准备200ul PCR反应管，并在管上标记样本编号；

1.2从试剂盒中取出PCR引物混合液、PCR反应液，使其自然解冻，涡旋振荡使其充分混匀，瞬时离心至管底；

1.3根据样本数目，按下表的比例取出PCR引物混合液和PCR反应液，置于一个离心管中混匀，按每PCR反应管加入4ul混合物进行分装。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份待测样品时，可按10.5-11份样品配制混合物。

组分名称	单反应体积取用量(μL)
		反应液I	2.8
酶I	0.2
		扩增引物*	1.0
合计	4

1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入1ul待测样品，使每份PCR反应体系总体积为5ul。其中，阴性对照为人类基因组DNA，阳性对照为质粒混合物，空白对照为去离子水。

1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行PCR扩增反应。

2.SAP酶消化

2.1向PCR产物中加入2ul酶切反应液，然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行下表程序。

组分名称	单反应体积(μL)
		反应液II	1.5
酶II	0.5
		合计	2.0

2.2将SAP反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行SAP消化反应。

温度(℃)	时间	循环数
			37	30min	1
65	5min	1
			4	Hold

3.延伸

3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸反应液，置于一个离心管中混匀。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份酶切产物时，可按10.5-11份样品配制混合物。

组分名称	单反应体积(μL)
		反应液III	0.83
酶III	0.23
		延伸引物	0.94
合计	2.00

3.2在PCR扩增区，按每管酶切产物加入2ul混合物进行分装。

3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行延伸反应。

4.纯化：在PCR扩增区向每管延伸产物中加入41μL超纯水和15mg树脂，颠倒混匀5分钟。

5.点样：使用微量移液器，吸取0.5ul纯化产物，点样至靶片。

6.上机检测及结果判读：将上述纯化产物通过临床飞行时间质谱Clin-TOF-Ⅱ(毅新博创生物科技有限公司生产的MALDI-TOF MS)质谱仪进行检测。

7.结果判读：使用发明人研制的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。

8.检测质量标准

杂峰：非本反应体系中可能出现的峰均为杂峰；峰型：无分叉，偏锋，跟峰等情况视为峰型较好

8.检测结果

将所述单碱基延伸产物均点样至同样一张芯片上，进行核酸质谱检测。

阳性靶标所对应的目的片段分子量所代表的特征峰(m/z)：金黄色葡萄球菌的nuc目的片段(6077Da)所对应的特征峰：6077m/z；B族链球菌的scpB片段目的片段(5447.6Da)所对应的特征峰：5447.6m/z；淋病奈瑟菌的NG片段目的片段(5288.3Da)所对应的特征峰：5288.3m/z；阴道加德纳菌的16sRNA片段目的片段(5919.8Da)所对应的特征峰：5919.8m/z；白色念珠菌的ITS片段目的片段(6363.2Da)所对应的特征峰：6363.2m/z；生殖支原体的PA片段目的片段(6694.4Da)所对应的特征峰：6694.4m/z；解脲支原体的UreA片段目的片段(5997.9Da)所对应的特征峰：5997.9m/z；沙眼衣原体的PmpF片段目的片段(6986.6Da)所对应的特征峰：6986.6m/z；HPV16的L1片段目的片段(8241.3Da)所对应的特征峰：8241.3m/z；HPV18的L1片段目的片段(5424.6Da)所对应的特征峰：5424.6m/z；将得到的核酸指纹特征图谱，通过软件与空白对照、阴性对照、阳性对照进行比对分析，结果显示：(1)空白对照：无上述阳性靶标特征峰，即未检出任何阳性病原体；(2)阴性对照：无上述阳性靶标特征峰，即未检出任阳性何病原体；(3)阳性对照：所有目的片段的阳性特征峰均正确检出，延伸效率均为100％；此外，所有组均无明显杂峰，基线平稳；谱图中3000-10000Da范围内无杂峰或＜2根杂峰。因此，构建出可以检出10种生殖道病原体的质谱特征模型。质谱检测结果如图1-13。

实施例三、分离患者病原体DNA

样本来源：阴道分泌物。采样人员采样前应穿上洗净双手并带上一次性手套，采集时应避开受检者的经期。标本采集及提取方法如下：宫颈采样拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子转动着轻轻插入阴道，停留片刻后顺时针旋转5次。取出拭子浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。拭子保存液在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过一个月，并可采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输，建议尽量采用新鲜拭子保存液。

样本提取：采用细菌DNA提取试剂盒对阴道分泌物进行DNA提取。共提取17例患者的待测DNA。实施例四、利用质谱模型检测患者病原体

根据实施例二的方法，对17例患者的待测DNA进行PCR扩增、纯化、单碱基延伸后，通过Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。同时按照实施例2，设置空白对照为去离子水、阴性对照为人类基因组DNA，阳性对照为10种病原体待检片段质粒DNA混合物。

质谱结果如图14-30所示：

样品N1，检测峰值(m/z)分别是：5919.8，6363.2，5997.9，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：5919.8，6363.2，5997.9，根据实施例2建立的质谱模型，因此确定检测结果为：阴道加德纳菌阳性，白色念珠菌阳性，解脲支原体阳性。样品N2，检测峰值(m/z)分别是：6363.2，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：6363.2，因此确定检测结果为：白色念珠菌阳性。样品N3，检测峰值(m/z)分别是：6694.4，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：6694.4，因此确定检测结果为：生殖道支原体阳性。样品N4，检测峰值(m/z)分别是：5919.8，6363.2，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：5919.8，6363.2，因此确定检测结果为：阴道加德纳菌阳性，白色念珠菌阳性。样品N5，检测峰值(m/z)分别是：5919.8，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：5919.8，因此确定检测结果为：阴道加德纳菌阳性。

样品N6，检测峰值(m/z)分别是：8241.3，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：8241.3，因此确定检测结果为：HPV16阳性。样品N7，检测峰值(m/z)分别是：6363.2，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：6363.2，因此确定检测结果为：白色念珠菌阳性。样品N8，检测峰值(m/z)分别是：6363.2，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：6363.2，因此确定检测结果为：白色念珠菌阳性。样品N9，检测峰值(m/z)分别是：5288.3，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：5288.3，因此确定检测结果为：淋病奈瑟菌阳性。样品N10，检测峰值(m/z)分别是：6363.2，6077，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：6363.2，6077，因此确定检测结果为：白色念珠菌阳性，金黄色葡萄球菌阳性。样品N11，检测峰值(m/z)分别是：6077，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：6077，因此确定检测结果为：金黄色葡萄球菌阳性。

样品N12，检测峰值(m/z)分别是：5424.6，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：5424.6，因此确定检测结果为：HPV18阳性。样品N13，检测峰值(m/z)分别是：5919.8，6363.2，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：5919.8，6363.2，因此确定检测结果为：阴道加德纳菌阳性，白色念珠菌阳性。样品N14，检测峰值(m/z)分别是：6986.6，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：6986.6，因此确定检测结果为：沙眼衣原体阳性。样品N15，检测峰值(m/z)分别是：5447.6，6363.2，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：5447.6，6363.2，因此确定检测结果为：B族链球菌阳性，白色念珠菌阳性。样品N16，检测峰值(m/z)分别是：6694.4，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：6694.4，因此确定检测结果为：生殖道支原体阳性。样品N17，检测峰值(m/z)分别是：6363.2，6077，其中待检病原体特定位点的单碱基延伸产物分子量(Da)分别是：6363.2，6077，因此确定检测结果为：白色念珠菌阳性，金黄色葡萄球菌阳性。

图14-30：各图中目的特征峰基线平滑，信噪比高，相邻信号峰之间分离度高，由此可见，本发明质谱法既能对多重PCR的产物同时进行检测，又能联合多重PCR方法快速获得检测结果，而避免了小分子片段电泳时间过长、分辨率低的缺点。

序列表

<110> 北京毅新博创生物科技有限公司

重庆市急救医疗中心

<120> MALDI-TOF MS检测生殖道病原体的引物组合物及用途

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

acgttggatg gccgttatct gtttgtgatg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

acgttggatg cgaaagggca atacgcaaag 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

acgttggatg caaacttgcc cgagatagac 30

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

acgttggatg cagcacaaac ttataaattg g 31

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

acgttggatg gagcaaggca gtattcaagc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

acgttggatg tcaagtcgtc cagctcgttc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

acgttggatg tttttgtgca cgctcggttg 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

acgttggatg aacccaaaag catgcccaac 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

acgttggatg cgcatcgatg aagaacgcag 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

acgttggatg agggagaaac gacgctcaaa 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 11

acgttggatg cccccaacct ctattttgtg 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 12

acgttggatg ttgaaggatg attgggttgc 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 13

acgttggatg gataggacgg tcaccagtat 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 14

acgttggatg ggtaaattag taccaggagc 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 15

acgttggatg aatatgtctg gagactgcgg 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 16

acgttggatg gcgtgtgatt gttctcaaat 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 17

acgttggatg ctgttgttga tactacacgc 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 18

acgttggatg ctgtaaatca tattcctccc 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 19

acgttggatg actgtggtag ataccactcg 30

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 20

acgttggatg ctgcaaatca tattcctcaa c 31

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 21

acactaagca actagtagc 19

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 22

tgattaatcg gagcctt 17

<210> 23

<211> 16

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 23

gcagggttga tagtca 16

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 24

ggtgtggtta ctggtgtg 18

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 25

cgatgattca cgaatatctg 20

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 26

ggagtatcac aacctgaata a 21

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 27

gctgattact tttgcttct 19

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 28

cctttagcag tatcagttat tg 22

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 29

gaacctacat ataaaaatac taactt 26

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 30

cagtctcctg tacctgg 17

Claims (7)

1.一种用于多重PCR结合MALDI TOF-MS检测10种生殖道病原体特征片段的引物组合物，其特征在于所述引物组合物，由SEQ1-SEQ20所示的10对PCR扩增引物和SEQ21-SEQ30所示的10条延伸引物组成，所述病原体的特征片段对应的PCR扩增引物和延伸引物如下：

金黄色葡萄球的nuc片段对应的PCR扩增引物为SEQ1-SEQ2，延伸引物SEQ21，扩增片段特征峰值为6077m/z；

B族链球菌的scpB片段对应的PCR扩增引物为SEQ3-SEQ4，延伸引物SEQ22，扩增片段特征峰值为5447.6m/z；

淋病奈瑟菌的NG片段对应的PCR扩增引物为SEQ5-SEQ6，延伸引物SEQ23，扩增片段特征峰值为5288.3m/z；

阴道加德纳菌的16sRNA片段对应的PCR扩增引物为SEQ7-SEQ8，延伸引物SEQ24，扩增片段特征峰值为5919.8m/z；

白色念珠菌的ITS片段对应的PCR扩增引物为SEQ9-SEQ10，延伸引物SEQ25，扩增片段特征峰值为6363.2m/z；

生殖支原体的PA片段对应的PCR扩增引物为SEQ11-SEQ12，延伸引物SEQ26，扩增片段特征峰值为6694.4m/z；

解脲支原体的UreA片段对应的PCR扩增引物为SEQ13-SEQ14，延伸引物SEQ27，扩增片段特征峰值为5997.9m/z；

沙眼衣原体的PmpF片段对应的PCR扩增引物为SEQ15-SEQ16，延伸引物SEQ28，扩增片段特征峰值为6986.6m/z；

HPV16的L1片段对应的PCR扩增引物为SEQ17-SEQ18，延伸引物SEQ29，扩增片段特征峰值为8241.3m/z；

HPV18的L1片段对应的PCR扩增引物为SEQ19-SEQ20，延伸引物SEQ30，扩增片段特征峰值为5424.6m/z。

2.如权利要求1所述的引物组合物，其中PCR扩增引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag：ACGTTGGATG。

3.如权利要求2所述的引物组合物，其中延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。

4.通过权利要求1-3任一所述的引物组合物，用于对环境卫生、食品安全检测、进出口检验检疫领域的病原体进行非诊断目的鉴定方法，包括：

(1)多重PCR：使用特异性的PCR扩增引物，在一个反应体系中，对10种生殖道病原体的目的DNA区域同时进行扩增，得到含10处特定位点所在DNA区域的PCR产物；

(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；

(3)单碱基延伸：使用10种特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应病原体特定位点延伸一个核苷酸，该核苷酸与特定位点处的基因型互补配对；

(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯度的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；

(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测；

其中，所述病原体的特征片段对应的PCR扩增引物和延伸引物如下：

金黄色葡萄球的nuc片段对应的PCR扩增引物为SEQ1-SEQ2，延伸引物SEQ21，扩增片段特征峰值为6077m/z；

B族链球菌的scpB片段对应的PCR扩增引物为SEQ3-SEQ4，延伸引物SEQ22，扩增片段特征峰值为5447.6m/z；

淋病奈瑟菌的NG片段对应的PCR扩增引物为SEQ5-SEQ6，延伸引物SEQ23，扩增片段特征峰值为5288.3m/z；

阴道加德纳菌的16sRNA片段对应的PCR扩增引物为SEQ7-SEQ8，延伸引物SEQ24，扩增片段特征峰值为5919.8m/z；

白色念珠菌的ITS片段对应的PCR扩增引物为SEQ9-SEQ10，延伸引物SEQ25，扩增片段特征峰值为6363.2m/z；

生殖支原体的PA片段对应的PCR扩增引物为SEQ11-SEQ12，延伸引物SEQ26，扩增片段特征峰值为6694.4m/z；

解脲支原体的UreA片段对应的PCR扩增引物为SEQ13-SEQ14，延伸引物SEQ27，扩增片段特征峰值为5997.9m/z；

沙眼衣原体的PmpF片段对应的PCR扩增引物为SEQ15-SEQ16，延伸引物SEQ28，扩增片段特征峰值为6986.6m/z；

HPV16的L1片段对应的PCR扩增引物为SEQ17-SEQ18，延伸引物SEQ29，扩增片段特征峰值为8241.3m/z；

HPV18的L1片段对应的PCR扩增引物为SEQ19-SEQ20，延伸引物SEQ30，扩增片段特征峰值为5424.6m/z。

5.权利要求4的方法，其中步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱。

6.权利要求5的方法，当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。

7.权利要求4-6任一所述的方法，其中PCR扩增引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，所述保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag：ACGTTGGATG。

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