CN114540479A - 用于检测与耳聋相关的基因snp的组合物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测与耳聋相关的基因SNP的组合物、试剂盒及检测方法。本发明能使用DNA样本在一个反应体系内对不同基因上的20处基因多态位点同时进行检测,较测序、实时荧光定量PCR等技术成本更低,操作更简便,图谱简明、质量范围广、准确度和灵敏度提高;利用本发明对人类20处耳聋基因多态位点的基因型进行检测,检测结果结合其他临床指标,可为临床医师合理制定临床治疗方案提供参考,避免不良反应;本发明能够作为对现有方案的补充,能丰富聋相关的基因多态位点的检测方案,更好的满足应用需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种用于检测与耳聋相关的基因SNP的组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术
据《中国出生缺陷防治报告(2012)》数据显示,我国是出生缺陷疾病高发国家,每年新增出生缺陷病例高达90万例,出生缺陷的筛查、治疗和预防迫在眉睫。出生缺陷主要包括:先天畸形、染色体异常、遗传代谢性疾病、功能异常(如盲、聋和智力障碍等)。
耳聋是最常见的出生缺陷之一,我国新生儿中,严重听力障碍发生率为1%-3%。在所有的致聋因素中,遗传因素导致的耳聋约占60%左右。我国听力正常的人群中,耳聋基因携带者有7800万人,正常人群中有5%—6%携带耳聋基因突变。80%以上的聋儿是由听力正常的父母所生。其中至少有50%的学语前耳聋是由遗传因素导致的;由环境因素导致的耳聋约占25%,如:感染、耳毒性药物和外伤等;另外25%的耳聋病因不明,但可能有遗传因素,所以遗传因素是导致学语前耳聋的最主要的因素。遗传性耳聋中约70%为非综合征型,其余约30%为综合征型。学语前非综合征型耳聋中,常染色体隐性遗传方式占80%,常染色体显性遗传方式占15-20%,X染色体连锁遗传的占1%,线粒体遗传的约占1%。目前我国要求将耳聋等遗传性疾病列入出生缺陷综合防控方案,建立涵盖孕前、孕期和新生儿各阶段的出生缺陷防治,明确耳聋基因的突变类型,选择合适的耳聋基因检测方法对于明确耳聋的病因、预防及治疗等至关重要。
聋病分子流行病学调查显示GJB2基因是中国人群中常见的NSHL致病基因,其中235delC是中国人群中GJB2基因常见的突变形式。GJB3基因突变可以引起常染色体显性或者隐性遗传性非综合征型耳聋。大前庭水管综合征在我国的发病比例较高,其听力下降往往表现为迟发性、渐进性,而且轻微的头部外伤、体质变化和感染因素都可引起患者明显的听力损伤,甚至“一巴掌打聋”;研究发现SLC26A4基因的IVS7-2A>G突变是中国人大前庭水管综合征中的热点突变。此外,氨基糖甙类抗生素抗菌效果好、使用方便、价格低廉、在中国获得广泛的应用,伴随着出现了大量的由该类药物造成的听力下降病例,甚至“一针致聋”,研究证实线粒体DNA 12SrRNA上的1555 A>G突变与此密切相关。国内开展的大规模耳聋分子流行病学研究表明,突变较为高发的基因或DNA片段主要为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因、以及线粒体DNA 12S rRNA等。
核酸检测通过对基因序列和结构进行精准测定,分析各种疾病易感基因的情况,预测身体患疾病的风险,能够满足疾病的早期筛查、个性化诊断和后期靶向治疗的精准诊断需求,为疾病的治疗提供指导依据,具有精确、特异性强的技术特点。目前,核酸检测已经在药物基因组、肿瘤易感基因、DNA甲基化、遗传学及遗传疾病诊断、细菌病毒分型及耐药等应用日益深入,成为精准医学不可或缺的分子诊断技术,对优生优育的遗传性筛查和疾病的治疗具有重要的意义。结合核酸检测应用于耳聋相关基因多态位点(SNP)的检测具有很好的前景,但现在缺少可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足,本发明提供了一种直接使用血样联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术,检测耳聋相关基因多态位点(SNP)的检测方案。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:提供一种用于检测与耳聋相关的基因SNP的组合物,包括如下所示的引物组:
其中,所述引物组用于检测如下的20个与耳聋相关的基因多态位点:GJB2基因35delG位点、176_191del16位点、235delC位点和299_300delAT位点;GJB3基因538C>T位点和547G>A位点;SLC26A4基因281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T和2168A>G;12SrRNA基因1095T>C、1494C>T和1555A>G。
优选的是,其中,所述延伸探针及对应的产物的分子量如下:
其中,延伸产物1对应为野生型的延伸产物,延伸产物2对应为突变型的延伸产物。
优选的是,其中,扩增引物序列为配对序列,扩增引物的5'端具有保护碱基序列。
优选的是,所述保护碱基序列为SEQ ID No.47:ACGTTGGATG。
本发明还提供一种用于检测与耳聋相关的基因SNP的试剂盒,包括:
(1)用于PCR的反应试剂,包括:如上所述的扩增引物SEQ ID No.1-SEQ ID No.26、耐高温的DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液、MgCl2;
(2)用于PCR产物纯化的试剂,包括虾碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶反应缓冲液;
(3)用于单碱基延伸反应的试剂,包括:如上所述的延伸引物SEQ ID No.27-SEQID No.46、耐高温的单碱基延伸酶、ddNTPs、延伸反应缓冲液。
优选的是,该试剂盒还包括阴性质控品、阳性质控品、纯化用树脂、点样及质谱检测用靶片、人基因组DNA提取试剂。
本发明还提供一种检测与耳聋相关的基因SNP的方法,其采用如上所述的试剂盒进行检测。
优选的是,该检测与耳聋相关的基因SNP的方法包括以下步骤:
1)多重PCR:在一个反应体系中,加入全血样本和扩增引物SEQ ID No.1-SEQ IDNo.26,对20处与耳聋相关的基因多态位点所在DNA区域同时进行扩增,得到含20处基因多态位点所在DNA区域的PCR产物;
2)对步骤1)得到的PCR产物进行纯化,以减少对后续反应的干扰;
3)单碱基延伸:在一个反应体系中,使用20条特异性的延伸引物SEQ ID No.27-SEQ ID No.46,对步骤2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸,延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸,该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对;
4)对步骤3)得到的延伸产物进行纯化,以获得高纯的延伸产物,避免盐离子等杂质对后续检测的影响;
5)质谱仪检测:将步骤4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上,放入质谱仪进行检测,根据延伸产物的分子量的差异,判断SNP位点的基因型。
优选的是,其中的核苷酸是一种特殊的核苷酸,本发明中具体包括四种:ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP,它们之间存在分子量差异,ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的核苷酸,将形成分子量差异。通过质谱检测,可分辨出这种差异。
本发明原理为:在多重PCR中同时扩增多达20个含SNP的DNA片段;在单碱基延伸过程中,对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸,延伸引物在20个SNP处分别延伸一个核苷酸,使得所延伸的核苷酸类型,分别与SNP处的基因型相关;单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物,以质谱对待检混合物进行检测,通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量,并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对,从而确定待检混合物是否包含特定的物质,进而确定各SNP处的基因型。
本发明的有益效果是:
本发明能使用DNA样本在一个反应体系内对不同基因上的20处基因多态位点同时进行检测,较测序、实时荧光定量PCR等技术成本更低,操作更简便,图谱简明、质量范围广、准确度和灵敏度提高;
利用本发明对人类20处耳聋基因多态位点的基因型进行检测,检测结果结合其他临床指标,可为临床医师合理制定临床治疗方案提供参考,避免不良反应;
本发明优选的20处SNP位点在PCR扩增时仅需13对扩增引物,减少引物之间错配的可能性,同时在一定程度上降低成本,简化操作,为后续引物体系及反应条件优化提供基础;
本发明能够作为对现有方案的补充,能丰富聋相关的基因多态位点的检测方案,更好的满足应用需求。
附图说明
图1为实施例3中20个SNP位点的口腔拭子质谱图;
图2为实施例3中20个SNP位点的石蜡包埋样本质谱图;
图3为实施例3中20个SNP位点的血液样本质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1 引物设计及合成
针对GJB2基因35delG位点、176_191del16位点、235delC位点和299_300delAT位点;GJB3基因538C>T位点和547G>A位点;SLC26A4基因281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T和2168A>G;12SrRNA基因1095T>C、1494C>T和1555A>G。20个与耳聋相关的基因多态位点,设计对应特异性PCR引物核心序列(SEQ ID No.1至SEQ ID No.26)和特异性延伸引物核心序列(SEQ ID No.27至SEQ IDNo.46)。
其中,为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果,每条PCR引物的5'端在核心序列(1至26)的基础上增加一定数目的碱基,优选的10bp的tag(ACGTTGGATG),以使PCR引物的分子量增大,从而超出质谱仪检测窗口。
实施例2 多重PCR、单碱基延伸、质谱仪检测
用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分为:
表1
序号 | 组分 | 主要成分 |
1 | 反应液I | 酶I缓冲液,包括dNTPs,Mg<sup>2+</sup>等 |
2 | 酶I | 扩增酶 |
3 | 扩增引物 | 序号1-26引物混合 |
4 | 反应液II | 酶II缓冲液,包括Tris-HCl等 |
5 | 酶II | 虾碱性磷酸酶 |
6 | 反应液III | 酶III缓冲液,包括ddNTPs,Mg<sup>2+</sup>等 |
7 | 酶III | 延伸酶 |
8 | 延伸引物 | 序号27-46引物混合 |
具体操作方法如下:
1.PCR扩增
1.1在PCR配液区,按照待检样品数(含阳性质控品、阴性对照、空白对照)准备200ul PCR反应管,并在管上标记样本编号;
1.2从试剂盒中取出PCR引物混合液、PCR反应液,使其自然解冻,涡旋振荡使其充分混匀,瞬时离心至管底;
1.3根据样本数目,按下表的比例取出PCR引物混合液和PCR反应液,置于一个离心管中混匀,按每PCR反应管加入3ul混合物进行分装。由于分装过程中,移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数,建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份待测样品时,可按10.5-11份样品配制混合物。
表2
组分 | 单体积反应(μL) |
反应液I | 1 |
酶I | 0.2 |
扩增引物 | 1 |
纯水 | 0.8 |
总计 | 3 |
1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入1.5ul待测样品,使每份PCR反应体系总体积为5ul。其中,阴性对照为纯化水。
1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中,按下表的程序进行PCR扩增反应。
表3
2.SAP酶消化
2.1在PCR配液区,根据样本数目,按下表的比例取出反应液,置于一个离心管中混匀。由于分装过程中,移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数,建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份酶切产物时,可按10.5-11份样品配制混合物。
表4
组分 | 单体积反应(μL) |
反应液II | 0.17 |
酶II | 0.5 |
纯水 | 1.33 |
总计 | 2 |
2.2从PCR反应管中吸取5ul的PCR产物后,加入2ul反应液,然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中,执行下表程序。
表5
温度(℃) | 时间 | 循环数 |
37 | 40min | 1 |
85 | 5min | 1 |
4 | 保温 |
3.延伸
3.1在PCR配液区,根据样本数目,按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸反应液,置于一个离心管中混匀。由于分装过程中,移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数,建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份酶切产物时,可按10.5-11份样品配制混合物。
表6
3.2在PCR扩增区,按每管酶切产物加入2ul混合物进行分装。
3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中,按下表的程序进行延伸反应。
表7
4.样本脱盐
把洁净树脂铺平在96/15mg dimple plate上,风干最少10分钟。在样本板的每一个有样本的孔里加入41ul水然后离心。轻轻将样本板凌空反转,放在已放树脂的dimpleplate上,然后将dimple plate连样本板一起反转(过程中两块板不可水平移动),让树脂掉到孔里。用膜把板封好,放在旋转器上颠倒摇匀30分钟。以2250g(标准板离心机的3700rpm)将板离心5分钟。
5.点样
用点样仪将样本点到对应的芯片上。
实施例3 上机检测及结果判读。
如前所述,20条延伸引物及它们在20个基因多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量,这些分子量对应各自的质谱峰,若在某分子量处出现质谱峰,则判断为存在与该分子量对应的物质(延伸引物或产物):
判断标准:
(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现,无论延伸引物对应的质谱峰是否存在,均判断为实验失败;
(2)若野生型或突变型对应的质谱峰仅出现一个,则判断为所出现质谱峰对应的基因型的纯合型;
(3)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现,则判断为杂合型。
参照图1为20个SNP位点的口腔拭子质谱图,图2为20个SNP位点的石蜡包埋样本质谱图,图3为20个SNP位点的血液样本质谱图,可以看出:所有样本20重SNP位点检测Wild均呈现阳性,本发明对于不同的样本处理方式具有较好的适配性。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节。
序列表
<110> 郑州中科生物医学工程技术研究院
<120> 用于检测与耳聋相关的基因SNP的组合物、试剂盒及检测方法
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
gagttttaag ctgtggctcg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
actgggatta gataccccac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
gacactgcag ctagagatac 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
cttgtaagtt cattacctg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
ggctccatat gaaatggcag 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
gttcagcatt atttggttga c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
ttctatggca atgtcgatgg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
tggaccccag taaatacttg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 9
gcttagtgac gtcatttcgg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 10
ttaaactcct gctggagacc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
gggatcagca acatcttctc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
tcctacctgt gtctttcctc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
ccaacatcgt ggactgctac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 14
agatggtgag tacgatgcag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 15
cagaaaacca gaaccttacc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 16
acgttcccaa agtgccaatc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 17
tctttcctcc agtgctctcc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 18
aggaattcat tgcctttggg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 19
aatgcgggtt ctttgacgac 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 20
atggaacctt gaccctcttg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 21
acttccccat ctcccacatc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 22
tctccccctt gatgaacttc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 23
agttgaacag ggccctgaag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 24
cactttccag tacacttacc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 25
tgggagatgg ggaagtagtg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 26
tagaagatgg attggggcac 20
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 27
gttgaggttt agggct 16
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 28
ccctgactct gctggtt 17
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 29
gcagtagcaa ttatcgtc 18
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 30
tgtatcaagt ccacagtaa 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 31
cgtcatttcg ggagttagta 20
<210> 32
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 32
tgctctttcc cgca 14
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 33
ggactgctac attgcc 16
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 34
agtaggtgaa gattttcttc t 21
<210> 35
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 35
accttaccac ccgc 14
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 36
ctccacagtc aagca 15
<210> 37
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 37
tggacggccg tg 12
<210> 38
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 38
tgcctttggg atcagc 16
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 39
aaggacacat tctttttga 19
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 40
ctgtagatag agtatagcat ca 22
<210> 41
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 41
ggcctaccgg agac 14
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 42
aagatcagct gcagg 15
<210> 43
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 43
accgcccgtc ac 12
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 44
ctacgcattt atatagagga g 21
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 45
ggaagtagtg atcgtagc 18
<210> 46
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 46
acgatcctgg ggg 13
<210> 47
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 47
acgttggatg 10
Claims (9)
3.根据权利要求2所述的用于检测与耳聋相关的基因SNP的组合物,其特征在于,其中,扩增引物序列为配对序列,扩增引物的5'端具有保护碱基序列。
4.根据权利要求1所述的用于检测与耳聋相关的基因SNP的组合物,其特征在于,所述保护碱基序列为:ACGTTGGATG。
5.一种用于检测与耳聋相关的基因SNP的试剂盒,其特征在于,包括:
(1)用于PCR的反应试剂,包括:如权利要求1-4中任意一项所述的扩增引物SEQ IDNo.1-SEQ ID No.26、耐高温的DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液、MgCl2;
(2)用于PCR产物纯化的试剂,包括虾碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶反应缓冲液;
(3)用于单碱基延伸反应的试剂,包括:如权利要求1-4中任意一项所述的延伸引物SEQID No.27-SEQ ID No.46、耐高温的单碱基延伸酶、ddNTPs、延伸反应缓冲液。
6.根据权利要求1所述的用于检测与耳聋相关的基因SNP的试剂盒,其特征在于,该试剂盒还包括阴性质控品、阳性质控品、纯化用树脂、点样及质谱检测用靶片、人基因组DNA提取试剂。
7.一种检测与耳聋相关的基因SNP的方法,其特征在于,其采用如权利要求5或6所述的试剂盒进行检测。
8.根据权利要求7所述的检测与耳聋相关的基因SNP的方法,包括以下步骤:
1)多重PCR:在一个反应体系中,加入全血样本和扩增引物SEQ ID No.1-SEQ IDNo.26,对20处与耳聋相关的基因多态位点所在DNA区域同时进行扩增,得到含20处基因多态位点所在DNA区域的PCR产物;
2)对步骤1)得到的PCR产物进行纯化;
3)单碱基延伸:在一个反应体系中,使用20条特异性的延伸引物SEQ ID No.27-SEQ IDNo.46,对步骤2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸,延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸,该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对;
4)对步骤3)得到的延伸产物进行纯化;
5)质谱仪检测:将步骤4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上,放入质谱仪进行检测,根据延伸产物的分子量的差异,判断SNP位点的基因型。
9.根据权利要求8所述的检测与耳聋相关的基因SNP的方法,所述核苷酸包括四种:ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP,ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da。
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