CN117230179A - 一种用于检测耳聋相关基因snp组合的引物组、试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组、试剂盒、检测方法及其应用。本发明针对9个与耳聋高度相关的SNP位点组合设计由扩增引物对和单碱基延伸引物组成的引物组，并提供了包含该引物组的试剂盒。引物组能同时对9个耳聋易感基因突变位点进行检测，分析人类遗传性耳聋特异性的SNP位点的基因型情况，具有高准确性、高灵敏度和重复性。同时，还提供了利用引物组或试剂盒检测与耳聋相关基因SNP的检测方法，无需提取基因组DNA，在同一体系中最多能同时检测9处耳聋相关基因SNP的基因型，通过多次引物序列优化，避免多对引物之间的相关干扰。

Description

一种用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组、试剂盒、检测 方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组、试剂盒、检测方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

通过基因筛查能提早发现携带有已知耳聋相关易感基因的下一代，并进行医学干预，避免下一代听力残疾。遗传性耳聋相关易感基因检测，就是通过对个体的DNA检测，发现其是否携带耳聋突变基因，从而对耳聋做到“早发现”、“早预防”和“早干预”。另外，耳聋相关易感基因筛查还具有指导正常人/聋人生育听力健康的后代，预防药物性耳聋，预防与跑跳、摔倒和头部外伤等相关的遗传性耳聋的意义。对于耳聋患者及有耳聋家族遗传史的患者来说，常见耳聋相关易感基因检测对国人常见的几大耳聋相关易感基因的高发突变位点进行全面检测，明确耳聋的原因，从而有效避免药物、头部碰撞等因素致聋，以及科学遗传咨询，避免或减少下一代再出现遗传性耳聋。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP。人类基因组上的SNP总量大概是3×10⁶个。因此，SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等都可能与SNP有关。

近年来，随着分子生物学和分子遗传学的迅速发展，人类基因组计划的实施和完成，听觉基因的定位和克隆不断取得飞跃性进展。目前遗传学家估计约有700多个基因与遗传性耳聋相关，而国内开展的大规模耳聋分子流行病学研究表明，突变较为高发的基因或DNA片段主要为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因、以及线粒体DNA 12S rRNA等，这说明遗传性耳聋与其相关基因的SNP息息相关。因此对耳聋相关基因SNP的分型检测，对耳聋的分子流行病学研究和聋儿的提前筛查有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组，所述引物组特异性好、灵敏度高，最多能同时检测9处耳聋相关基因的SNP位点，且在同一个体系进行反应时不存在互相干扰的现象。

本发明的第二个目的是提供用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组在制备检测耳聋相关基因SNP的检测产品中的应用，该引物组最多能同时检测9处耳聋相关基因的SNP位点，且特异性好、灵敏度高，可以用于制备检测耳聋相关基因SNP的检测产品。

本发明的第三个目的是提供一种检测耳聋相关基因SNP的检测产品，该检测产品最多能同时检测9处与耳聋相关基因的SNP位点，具有检测结果准确、操作简便等优点。

本发明的第四个目的是提供一种检测与耳聋相关基因SNP的检测方法，本发明的检测方法无需提取受检者的基因组DNA，直接使用血样能在一个反应体系内对不同基因上的9处基因多态位点同时进行检测，具有技术成本低、操作简便的优点。

为了实现上述目的，本发明中一种用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组的技术方案是：

一种用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组，包括如下所示引物组合中的一种或两种以上：

其中，每种引物组合由PCR扩增引物对和与PCR扩增引物对对应的单碱基延伸引物组成。

上述方案的有益效果在于：本发明针对目前与耳聋高度相关的SNP位点设计PCR扩增引物及相对应的单碱基延伸引物，通过实验证明所述的引物组特异性好、灵敏度高，最多能同时检测9处耳聋相关基因SNP位点的基因型，为耳聋的分子流行病学研究和聋儿的提前筛查提供新的引物资源。

为了实现上述目的，本发明中用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组在制备检测耳聋相关基因SNP的检测产品中的应用的技术方案是：

用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组在制备检测耳聋相关基因SNP的检测产品中的应用。

上述方案的有益效果在于：本发明通过实验证明引物组特异性好、灵敏度高，而且在同一反应体系内进行PCR扩增不存在互相干扰，且包含目前与耳聋高度相关的SNP位点，可应用于制备检测耳聋相关基因SNP的试剂或试剂盒，进行遗传性耳聋疾病相关的点突变、缺失突变及线粒体点突变等突变类型进行准确分型，实现对遗传性耳聋疾病快速有效的检测。

为了实现上述目的，本发明中一种检测耳聋相关基因SNP的检测产品的技术方案是：

一种检测耳聋相关基因SNP的检测产品，包含用于检测耳聋相关基因SNP的引物组合。

上述方案的有益效果在于：本发明提供的试剂盒最多能同时检测9处耳聋相关基因SNP位点的基因型，具有检测结果准确、操作简便的优点，能对遗传性耳聋疾病相关的点突变、缺失突变及线粒体点突变等突变类型进行准确分型，为遗传性耳聋疾病快速有效的检测奠定基础。

具体地，检测产品可以是用于检测SNP位点基因型的任何常规产品，包括：检测试剂、检测芯片、检测载体，以及检测试剂盒等。

作为进一步地改进，所述引物组中的PCR扩增引物的5’端具有保护碱基序列。

上述方案的有益效果在于：待检样本经过PCR扩增、单碱基延伸后要进行质谱仪检测，在扩增引物5’端增加一定数目的碱基，能有效避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，是检测结果更加有效。

优选地，SEQ ID NO：1-18的PCR扩增引物的5’端增加5-15bp碱基；进一步优选的，增加的碱基为10bp的tag，序列为ACGTTGGATG，例如，增加10bp的tag碱基后，SEQ ID NO:1所示的PCR扩增引物的核苷酸序列为5’-ACGTTGGATGACGTTGGATGAGTGAACGTTCCCAAAGTGC-3’。

作为进一步地改进，所述耳聋相关基因SNP分别为SLC26A4基因rs200455203(1975G>C位点)、SLC26A4基因rs201562855(1174A>T位点)、GJB2基因rs1291519904rs80338943#1(257C>G位点，235delC位点)、GJB2基因rs1291519904rs80338943#2(257C>G位点，235delC位点)、GJB2基因rs72474224(109G>A位点)、SLC26A4基因rs786204581(235C>T位点)、12S rRNA基因rs267606619(1494C>T位点)、SLC26A4基因rs768245266(916-917insG位点)和SLC26A4基因rs192366176(IVS15+5G>A位点)。

上述方案的有益效果在于：上述SNP位点与耳聋高度相关，且覆盖全面，对受检者进行上述SNP位点进行分型检测，能极大程度的为受检者提供健康信息，且检测结果结合其他临床指标，可为临床医师合理制定临床治疗方案提供参考，避免不良反应。

作为进一步地改进，所述检测产品为试剂盒。

上述方案的有益效果在于：将引物组与完成检测的试剂组成试剂盒，能方便操作者使用，且在同一批次下能保证检测的稳定性。

作为进一步地改进，所述试剂盒包括PCR扩增、PCR产物纯化和单碱基延伸反应所需试剂。

上述方案的有益效果在于：本发明试剂盒中提供的试剂包括完成多重PCR、产物纯化和单碱基延伸反应的试剂，与引物组配合使用，能快速、准确地完成SNP位点的分型检测，且试剂盒成分简单，能有效降低生产成本。

优选地，所述试剂盒包括：

(1)用于PCR的反应试剂，包括：特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；

(2)用于PCR产物纯化的试剂；

(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。

为了提高检测结果的可信度并方便使用者的检测，进一步优选地，所述试剂盒还包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶等试剂。

优选地，所述PCR产物纯化试剂包括碱性磷酸酶、碱性磷酸酶和外切酶ExoI、电泳凝胶回收试剂或PCR产物纯化柱中的任一种。本发明试剂盒中的纯化试剂有多种选择，可以根据使用者的具体检测条件进行定制，能满足不同客户的需求，扩大了试剂盒的适用范围。

具体地，当纯化试剂为碱性磷酸酶和外切酶ExoI时，所使用的PCR扩增引物无需包括保护碱基。

为了实现上述目的，本发明中一种检测与耳聋相关基因SNP的检测方法的技术方案是：

一种检测与耳聋相关基因SNP的检测方法，使用上述引物组或上述的检测产品；所述检测方法包括如下步骤：

(1)多重PCR扩增：在一个反应体系中使用PCR扩增引物对待测样本进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行纯化；

(2)单碱基延伸反应：在一个反应体系中使用延伸引物对步骤(1)纯化后的产物进行单碱基延伸反应；

(3)质谱仪检测：对步骤(2)单碱基延伸反应的产物纯化后进行质谱仪检测，根据延伸产物的分子量的差异，判断SNP位点的基因型。

上述方案的有益效果在于：本发明提供的检测方法利用上述试剂盒或检测引物，能快速有效地最多同时对9处耳聋相关基因SNP位点进行分型检测。检测方法无需提取受检者基因组DNA的过程，直接以血样为模板，简化了实验流程，提高了检测的效率。同时克服了现有技术中单管反应检测SNP位点较少的缺陷，通过多次引物序列优化，避免多对引物之间的相关干扰，进一步提高了检测的效率，也为受检者提供了更全面的信息。

具体地，本发明检测方法的原理在于：

提供了一种直接使用血样联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测耳聋相关基因多态位点(SNP)的检测方案。其中：在多重PCR中同时扩增多达9个含SNP的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在9个SNP处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与SNP处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各SNP处的基因型。

作为进一步地改进，步骤(1)中PCR扩增的程序为：95℃2min；95℃30s，56.3℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min；4℃保温。

作为进一步地改进，所述延伸产物的分子量如下：

上述方案的有益效果在于：根据上述标准能有效的区分待测SNP位点的基因型。

附图说明

图1为本发明实施例3中rs200455203位点的阴性对照质谱图；

图2为本发明实施例3中rs201562855位点的阴性对照质谱图；

图3为本发明实施例3中rs1291519904rs80338943#1位点的阴性对照质谱图；

图4为本发明实施例3中rs1291519904rs80338943#2位点的阴性对照质谱图；

图5为本发明实施例3中rs72474224位点的阴性对照质谱图；

图6为本发明实施例3中rs786204581位点的阴性对照质谱图；

图7为本发明实施例3中rs267606619位点的阴性对照质谱图；

图8为本发明实施例3中rs768245266位点的阴性对照质谱图；

图9为本发明实施例3中rs192366176位点的阴性对照质谱图；

图10为本发明实施例3中rs200455203位点的阳性质谱图；

图11为本发明实施例3中rs201562855位点的阳性质谱图；

图12为本发明实施例3中rs1291519904rs80338943#1位点的阳性质谱图；

图13为本发明实施例3中rs1291519904rs80338943#2位点的阳性质谱图；

图14为本发明实施例3中rs72474224位点的阳性质谱图；

图15为本发明实施例3中rs786204581位点的阳性质谱图；

图16为本发明实施例3中rs267606619位点的阳性质谱图；

图17为本发明实施例3中rs768245266位点的阳性质谱图；

图18为本发明实施例3中rs192366176位点的阳性质谱图。

具体实施方式

本发明中术语“rs200455203、rs201562855”等，均是人SNP位点在NCBI数据库的统一编号。

本发明中术语“保护碱基”，指在PCR引物的5’端额外增加的碱基。由于保护碱基的序列使得PCR引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。此外，延伸引物的5’端也可以适量增加碱基序列，但其作用并非如同PCR引物的保护碱基，使其超出检测窗口，而是适当调整延伸引物的分子量，使延伸引物及其产物在检测窗口内处于一个合理的位置。例如，当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一个延伸引物增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距，以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清，从而提高检测效果。因此，增加碱基后的延伸引物及产物的分子量，一定不会超出检测窗口。上述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。

本发明中术语“碱性磷酸酶消化”，其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使dNTP的5’-P末端转换成5’-OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一步单碱基延伸的影响。

本发明中术语“单碱基延伸”，又被称之为微测序(mini sequence)，指在体系中加入延伸引物和ddNTP，ddNTP与延伸引物的3’端连接形成延伸产物(即引物延伸了一个碱基)，根据碱基互补配对原则，由SNP位点处基因型决定具体连接何种ddNTP，这个过程类似于PCR过程中dNTP根据互补链的碱基组成，逐个添加到PCR引物上。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基，不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅在SNP位点处连接一个ddNTP，而不能像PCR那样，不断的往下延伸，因此称之为单碱基延伸。

单碱基延伸与测序过程非常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，测序引物连接dNTP后将继续延伸，只有连接ddNTP后，方终止延伸，因此测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物；单碱基延伸体系中加入只有ddNTP，延伸引物只能连接一个ddNTP，并终止延伸，因此单碱基延伸产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。

本发明中术语“检测产品”，指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品，包括：检测试剂、检测芯片、检测载体，以及检测试剂盒等。

本发明中术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸，本技术方案共采用四种，它们之间存在分子量差异，如ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTTP是修饰后的分子量)。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的核苷酸，将形成分子量差异。通过质谱检测，可分辨出这种差异。例如，某SNP位点若是A/G多态，对应的延伸引物长度为22个碱基(分子量7200Da)，当该SNP位点处是A基因型，延伸引物将延伸一个T核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量7487.2Da的延伸产物，当该SNP位点处是G基因型，延伸引物将延伸一个C核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量7447.2Da的延伸产物，两种产物之间存在40Da的分子量差异。即对该SNP位点而言，若使用此7200Da的延伸引物，G基因型将对应7447.2Da的质谱峰，A基因型将对应7487.2Da的质谱峰。在实际检测过程中，使用者可通过软件对7200Da、7447.2Da、7487.2Da三处进行观察：若7200Da处出现质谱峰，则是有部分或全部延伸引物没有与ddNTP结合；不论7200Da处是否出现质谱峰，若7447.2Da与7487.2Da处仅出现一处质谱峰，则该SNP位点的基因型为纯合型，并与质谱峰的位置对应，如前所述，7447.2Da的质谱峰对应G基因型，7487.2Da的质谱峰对应A基因型；若7447.2Da与7487.2Da两处质谱峰均出现，则该SNP位点的基因型为杂合型；若7447.2Da与7487.2Da两处质谱峰均未出现，则实验失败。

本发明中术语“纯化”，指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的PCR产物纯化有两种方式：一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离杂质，并回收相对较纯的PCR产物，可以认为是第一种纯化方式，该方式一般耗时，操作复杂，特别是样本量大时；碱性磷酸酶的作用是降解(亦称“消化”)dNTP，使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，可以认为是第二种纯化方式。应当指出的是，单独的外切酶ExoI不起纯化作用，当它与碱性磷酸酶混合使用时，其作用是预先将单链DNA(在反应完成后的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP，再由碱性磷酸酶使dNTP继续降解。由于PCR引物被降解，不会进入最后的质谱检测步骤，因此，如果计划纯化步骤中增加ExoI外切酶处理，那么无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外，在单碱基延伸步骤之前，由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温失活，其不会降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等，因此避免对后续实验产生影响。

本发明中术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。其中，在设计延伸引物时，对于不同的SNP位点，根据这些位点所在DNA区域的序列特点，以及SNP位点的基因型，可以设计出分子量不同的延伸引物和延伸产物，避免不同延伸引物及产物之间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对宽阔的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多个SNP位点的检测。

本发明中术语“SNP”基因型，指表示人基因组中单核苷酸多态性的类型。其中，在实际检查中，作为对照的用于检测的基因型既可来自于对照人基因组中，也可来自已克隆入质粒的载体工具，而后者具有可复制和保存便捷、来源稳定而受到实际使用者的欢迎。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

实施例1一种用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组

本实施例提供一种用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组，能同时检测9处耳聋相关基因的SNP，其序列如表1所示。

表1耳聋相关的基因多态位点的引物组的核苷酸序列

其中，每种引物组合包含PCR扩增引物对和与PCR扩增引物对对应的单碱基延伸引物。

实施例2一种检测耳聋相关基因SNP的检测产品

本实施例提供一种检测耳聋相关基因SNP的检测产品，为包含实施例1中引物组的试剂盒，试剂盒包括PCR扩增、PCR产物纯化和单碱基延伸反应所需试剂。具体组分如表2所示：

表2用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分

为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，每条PCR扩增引物的5’端在增加10bp的碱基，碱基序列为ACGTTGGATG，以使PCR引物的分子量增大，从而超出质谱仪检测窗口。

实施例3一种检测与耳聋相关基因SNP的检测方法

本实施例使用实施例2中的试剂盒，提供一种检测与耳聋相关基因SNP的检测方法，具体实施操作如下：

1、PCR扩增

1.1、在PCR配液区，按照待检样品(血液样本)数(含阳性质控品、阴性对照、空白对照)准备210μL PCR反应管，并在管上标记样本编号。

1.2、从试剂盒中取出PCR引物混合液、PCR反应液，使其自然解冻，涡旋振荡使其充分混匀，瞬时离心至管底。

1.3、根据样本数目，按表3的比例取出PCR引物混合液和PCR反应液，置于一个离心管中混匀，按每PCR反应管加入4μL引物混合物进行分装。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份

待测样品时，可按10.5-11份样品配制混合物。

表3PCR反应体系

组分名称	单反应体积(μL)
		反应液I	13.7
酶I	0.8
		扩增引物	4.0
合计	18.5

1.4、在PCR扩增区内向每管混合物中加入1.5μL待测样品，使每份PCR反应体系总体积为20μL。其中，阴性对照为纯化水，空白对照为不加模板。

1.5、将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表4的程序进行PCR扩增反应。

表4PCR反应程序

2、SAP酶消化

从PCR反应管中吸取5μL的PCR扩增产物后，加入2μL酶切反应液，酶切反应液的体系见表5。然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行表6程序。

表5酶切反应液的体系

表6SAP酶消化程序

温度(℃)	时间	循环数
			37	40min	1
85	5min	1
			4	保温

3、单碱基延伸反应

3.1、在PCR配液区，根据样本数目，按表7的比例取出延伸引物混合液和延伸反应液，置于一个离心管中混匀。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份酶切产物时，可按10.5-11份样品配制混合物

表7单碱基延伸反应体系

组分名称	单体积反应(μL)
		反应液Ⅲ	0.83
酶Ⅲ	0.23
		延伸引物	0.94
合计	2

3.2、在PCR扩增区，按每管酶切产物加入2μL反应体系进行分装。

3.3、将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按表8的程序进行延伸反应。

表8单碱基延伸反应程序

4、纯化

在PCR扩增区向每管延伸产物中加入41μL超纯水和15mg阴离子交换树脂，颠倒混匀5分钟后离心(条件为以2250g(标准板离心机的3700rpm)离心5分钟)。

5、点样

使用微量移液器，吸取0.5μL纯化产物，点样至靶片(检测时装样品用的芯片)。

6、上机检测及结果判读。

如前所述，9条延伸引物及它们在9个基因多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量，这些分子量对应各自的质谱峰，若在某分子量处出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的物质(延伸引物或产物)，各位点延伸产物分子量如表9所示：

表9各位点延伸产物分子量

判断标准：

(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；

(2)若野生型或突变型对应的质谱峰仅出现一个，则判断为所出现质谱峰对应的基因型的纯合型；

(3)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为杂合型。

质谱结果如图1-18所示，其中图1-图9是9个阴性对照组的各位点的质谱图，图10-图18为阳性血液样本测得的质谱图，从质谱图可以很清楚的看出有突变的SNP位点的突变情况，如对于位点rs200455203(对比图1和图10)，说明有G向C的纯合突变发生。

以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组，其特征在于：包括如下所示引物组合中的一种或两种以上：

其中，每种引物组合由PCR扩增引物对和与PCR扩增引物对对应的单碱基延伸引物组成。

2.一种如权利要求1所述的用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组在制备检测耳聋相关基因SNP的检测产品中的应用。

3.一种检测耳聋相关基因SNP的检测产品，其特征在于：包含权利要求1所述的用于检测耳聋相关基因SNP组合的引物组。

4.根据权利要求3所述的检测耳聋相关基因SNP的检测产品，其特征在于：所述引物组合中的PCR扩增引物的5’端具有保护碱基序列。

5.根据权利要求3所述的检测耳聋相关基因SNP的检测产品，其特征在于：所述耳聋相关基因SNP分别为SLC26A4基因rs200455203(1975G>C位点)、SLC26A4基因rs201562855(1174A>T位点)、GJB2基因rs1291519904rs80338943#1(257C>G位点，235delC位点)、GJB2基因rs1291519904rs80338943#2(257C>G位点，235delC位点)、GJB2基因rs72474224(109G>A位点)、SLC26A4基因rs786204581(235C>T位点)、12S rRNA基因rs267606619(1494C>T位点)、SLC26A4基因rs768245266(916-917insG位点)和SLC26A4基因rs192366176(IVS15+5G>A位点)。

6.根据权利要求3～5任一项所述的检测耳聋相关基因SNP的检测产品，其特征在于：所述检测产品为试剂盒。

7.根据权利要求6所述的检测耳聋相关基因SNP的检测产品，其特征在于：所述试剂盒包括PCR扩增、PCR产物纯化和单碱基延伸反应所需试剂。

8.一种检测与耳聋相关基因SNP的检测方法，其特征在于：使用如权利要求1所述的引物组或权利要求3～7任一项所述的检测产品；所述检测方法包括如下步骤：

(1)多重PCR扩增：在一个反应体系中使用PCR扩增引物对待测样本进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行纯化；

(2)单碱基延伸反应：在一个反应体系中使用延伸引物对步骤(1)纯化后的产物进行单碱基延伸反应；

(3)质谱仪检测：对步骤(2)单碱基延伸反应的产物纯化后进行质谱仪检测，根据延伸产物的分子量的差异，判断SNP位点的基因型。

9.根据权利要求8所述的检测与耳聋相关基因SNP的检测方法，其特征在于：步骤(1)中PCR扩增的程序为：95℃2min；95℃30s，56.3℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min；4℃保温。

10.根据权利要求8所述的检测与耳聋相关基因SNP的检测方法，其特征在于：所述延伸产物的分子量如下：