CN112538525A - 用于检测与耳聋相关的基因snp的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测20处耳聋相关的基因多态位点的检测方法。该检测方法能实现同时对耳聋相关的20处基因多态位点进行检测。使用检测方法，对人类20处耳聋基因多态位点的基因型进行检测，检测结果结合其他临床指标，可为临床医师合理制定临床治疗方案提供参考，避免不良反应。本发明不需要提取DNA,直接使用血样能在一个反应体系内对不同基因上的20处基因多态位点同时进行检测，较测序、实时荧光定量PCR等技术成本更低，操作更简便，图谱简明、质量范围广、准确度和灵敏度提高。

Description

用于检测与耳聋相关的基因SNP的检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于确定耳聋基因多态位点(SNP)的检测方法及产品，具体而言是无需提取DNA、利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对耳聋相关基因的20个基因多态位点进行检测的方法及相应的试剂盒。

背景技术

耳聋是临床上最常见的遗传病之一，据各国统计，每1000名新生儿中，有1-3例听力障碍儿童，其中至少一半与遗传因素有关。另外在大量的迟发性听力下降患者中，亦有许多患者由自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多态性造成对致聋环境因素易感性增加而致病。在我国，听力语言残疾者达2057万以上，并以每年新生3万聋儿的速度增长，累计在我国有约30万对生有至少1个聋儿的育龄夫妇面临再次生育选择和生育另一个聋儿的风险，他们需要知道发生耳聋的准确病因并需要相应的产前诊断技术来确保再次生育成功。

在我国听力残疾居各类残疾之首，耳聋已成为最常见的出生缺陷之一。其中至少有50％的学语前耳聋是由遗传因素导致的；由环境因素导致的耳聋约占25％，如：感染、耳毒性药物和外伤等；另外25％的耳聋病因不明，但可能有遗传因素，所以遗传因素是导致学语前耳聋的最主要的因素。遗传性耳聋中约70％为非综合征型，其余约30％为综合征型。学语前非综合征型耳聋(nonsyndromic hearing loss，NSHL)中，常染色体隐性遗传方式(autosomal recessive，AR)占80％，常染色体显性遗传方式(autosomal dominant，AD)占15-20％，X 染色体连锁遗传的占1％(X-linked)，线粒体遗传(mitochondrial)的约占1％。

聋病分子流行病学调查显示GJB2基因是中国人群中常见的NSHL致病基因，其中235delC是中国人群中GJB2基因常见的突变形式。GJB3基因突变可以引起常染色体显性或者隐性遗传性非综合征型耳聋。大前庭水管综合征在我国的发病比例较高，其听力下降往往表现为迟发性、渐进性，而且轻微的头部外伤、体质变化和感染因素都可引起患者明显的听力损伤，甚至“一巴掌打聋”；研究发现SLC26A4基因的IVS7-2A>G突变是中国人大前庭水管综合征中的热点突变。此外，氨基糖甙类抗生素(aminoglycoside antibiotic，AmAn)抗菌效果好、使用方便、价格低廉、在中国获得广泛的应用，伴随着出现了大量的由该类药物造成的听力下降病例，甚至“一针致聋”，研究证实线粒体DNA 12S rRNA上的1555A>G突变与此密切相关。

先天性耳聋是人类最常见的出生缺陷之一，是导致交流障碍最常见的疾病，在病因学上是由遗传和(或)环境因素导致的，其中50％～60％是由遗传因素引起的。遗传性耳聋可分为两类：一类为综合征型耳聋(Syndramic Hearing Impairment，SHI)，即除听力障碍外，还伴有其他临床症状(如耳、头颅、视觉器官、皮肤、四肢骨骼系统等的先天性畸形)；另一类为非综合征型耳聋(Non-Syndramic Hearing Impairment，NSHI)，即听力障碍外不伴有其他临床症状。而所有的非综合征型耳聋几乎都符合孟德尔单基因遗传规律，而遗传学家估计约有700多个基因与遗传性耳聋相关，而每个基因又有散在的数目众多的突变位点，因而具有较高的基因和位点遗传异质性。国内开展的大规模耳聋分子流行病学研究表明，突变较为高发的基因或DNA片段主要为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因、以及线粒体DNA 12S rRNA等。这为我们设计检测技术时基因及位点的选择提供了理论依据。

根据遗传方式，遗传性聋又分为常染色体显性、隐性遗传，X染色体连锁和线粒体母系遗传性聋。一般来说，常染色体显性遗传引起的耳聋大多是迟发、进行性和症状较轻的耳聋，而常染色体隐性遗传引起的具有发病早和病情重的特点。随着基因组计划的实施和完善，听觉基因的定位和克隆不断取得飞跃性进展。目前定位的非综合征型听力损失的基因座位已达 137个，其中，常染色体显性遗传型基因座54个，常染色体隐性遗传型基因座67个，X染色体连锁基因座位7个，Y染色体连锁基因座1个。在这些基因座中，己克隆的基因有43 个，包括常染色体显性遗传基因21个、隐性遗传性基因23个(其中6个基因既可见于隐性遗传又可见于显性遗传)，X染色体连锁遗传1个，线粒体遗传4个。

近年来，随着分子生物学和分子遗传学的迅速发展，人类基因组计划的实施和完成，耳聋的基因研究取得了很大发展。

发明内容

本发明原理在于：提供了一种直接使用血样联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测耳聋相关基因多态位点(SNP)的检测方案。其中：在多重PCR中同时扩增多达20个含SNP的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在20个SNP处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与SNP处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各SNP处的基因型。

因此，本发明第一个目的是提供一种检测20处与耳聋相关的基因多态位点的引物系统或引物组，其序列如表1所示。

表1

其中，所述20个与耳聋相关的基因多态位点分别是：GJB2基因35delG位点、167delT 位点、176_191del16位点、235delC位点和299_300delAT位点；GJB3基因538C>T位点和547G>A 位点；SLC26A4基因281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、 1975G>C、2027T>A、2162C>T和2168A>G；12SrRNA基因1494C>T和1555A>G。

其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如表2所示。

表2

在一个实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag(ACGTTGGATG)，例如，PCR引物SEQ ID NO:1为5'-ACGTTGGATG CTGCCAACATCTTACCTTGC-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。

本发明第二个目的是提供了由上述引物系统所制备的用于检测耳聋相关基因多态位点的产品。

在一个实施方案中，该产品为检测试剂盒，包括：

(1)用于PCR的反应试剂，包括：特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs， PCR反应缓冲液；

(2)用于PCR产物纯化的试剂；

(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。

在一个具体实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，人基因组DNA提取试剂等试剂。

在另一个具体实施方案中，用于PCR产物纯化的试剂：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

本发明第三个目的是使用上述引物、产品或试剂盒来检测耳聋相关基因多态位点的方法，包括如下步骤：

(1)多重PCR：使用特异性的PCR引物，在一个反应体系中，直接加入全血样本，对20处与耳聋相关的基因多态位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含20处基因多态位点所在DNA区域的PCR产物；

(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；

(3)单碱基延伸：使用7条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；

(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；

(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行进行检测；

其中，所述20个与耳聋相关的基因多态位点分别是：GJB2基因35delG位点、167delT 位点、176_191del16位点、235delC位点和299_300delAT位点；GJB3基因538C>T位点和 547G>A位点；SLC26A4基因281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T和2168A>G；12SrRNA基因1494C>T和1555A>G。

在一个实施方案中，步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶 ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。

本发明第四个目的是提供前述试剂盒在检测20个耳聋相关的SNP的用途。

有益效果

本发明优点和效果如下：

1.敏感：本发明综合了多重PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用PCR检测多态性SNP，因此它的检测灵敏度很高。

2.特异：单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对DNA分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低；

3.简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染；

4.快速：不需要提取DNA，直接加入血液样本，速度快、高通量，可在5-6小时内完成数百个样本的检测。

5、本发明可对多个已知患者进行检测，分别得到具有不同SNP位点的检测结果，其中患者可以是单个SNP位点发生突变，也可以是多个SNP位点发生突变。这表示患者可以携带一个或多个SNP突变，从而为选择合适剂量提供参考信息。

6、本发明克服了以往技术一次检测SNP位点过少的缺陷,成本低廉。

原理与定义

本发明提供了一种联合多重PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测与耳聋相关基因多态位点(SNP)的检测方案。其原理在于：

在多重PCR步骤中，通过设计并使用合适的引物，从而能同时扩增多达20个SNP位点所在DNA片段。

在单碱基延伸步骤中，对上一步多重PCR的产物依次进行纯化和多重单碱基延伸。其中，延伸引物共20条，分别与20个SNP位点对应，并在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对(如某SNP位点处是A基因型，将在对应的延伸引物上延伸T核苷酸)。在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸。

在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在纯化后，点至含基质的靶片，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与它们的分子量呈负相关，即分子量越大，飞行速度越慢，到达检测器的时间越晚。

术语“35delG、176_191dell6、IVS7-2A>G”则是各位点的一些通俗叫法，其中：(1)35delG 表示GJB2编码区的第30至35位连续的6个G中缺失一个G的单核苷酸突变；(2) 176_191dell6突变是GJB2基因编码区从第176位至191位的16个连续碱基丢失；(3)IVS7-2 A>G位于第8外显子剪切位点的位置，即内含子7的3’末端，其突变使前体mRNA不能正常剪接。

应当指出的是，不同文献中关于IVS7-2A>G基因多态位点有两种表述方式，即A/G和 T/C的SNP位点。如，NCBI数据库中报道是A/G多态性的SNP位点，而在很多文献中，表述为A/G多态。这是因为针对该位点测序采用了不同方向的缘故。当使用某一条DNA链为模板测序时，该位点检测为野生型A或突变型G，表述为A/G，而当使用与之互补的DNA 链为模板进行测序时，对该位点的野生型T或突变型C，检测结果为它们的互补配对碱基A 或G，表述为G/A。基于相同的理由，对于其他位点，也存在A/G和T/C的区别。

术语“保护碱基”，指在PCR引物的5'端额外增加的碱基。由于保护碱基的序列使得PCR 引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。此外，延伸引物的5'端也可以适量增加碱基序列，但其作用并非如同PCR引物的保护碱基，使其超出检测窗口，而是适当调整延伸引物的分子量，使延伸引物及其产物在检测窗口内处于一个合理的位置。例如，当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一个延伸引物增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距，以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清，从而提高检测效果。因此，增加碱基后的延伸引物及产物的分子量，一定不会超出检测窗口。上述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。

术语“碱性磷酸酶消化”，其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使dNTP 的5'-P末端转换成5'-OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一步单碱基延伸的影响。

术语“外切酶ExoI消化”，其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA的dNTP之间3,5-磷酸二酯键，使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR 反应后残余的PCR引物。由于外切酶可以将单链的PCR引物切除，并不会在检测窗口中出现，因此使用该外切酶时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

术语“单碱基延伸”，又被称之为微测序(mini sequence)，指在体系中加入延伸引物和 ddNTP，ddNTP与延伸引物的3'端连接形成延伸产物(即引物延伸了一个碱基)，根据碱基互补配对原则，由SNP位点处基因型决定具体连接何种ddNTP，这个过程类似于PCR过程中dNTP根据互补链的碱基组成，逐个添加到PCR引物上。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基，不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅在SNP位点处连接一个ddNTP，而不能像PCR那样，不断的往下延伸，因此称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，测序引物连接dNTP后将继续延伸，只有连接ddNTP后，方终止延伸，因此测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物；单碱基延伸体系中加入只有ddNTP，延伸引物只能连接一个ddNTP，并终止延伸，因此单碱基延伸产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。

术语“检测产品”，指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品，包括：检测试剂、检测芯片、检测载体，以及检测试剂盒等。

术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸，本技术方案共采用四种，它们之间存在分子量差异，如ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTTP是修饰后的分子量)。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的核苷酸，将形成分子量差异。通过质谱检测，可分辨出这种差异。例如，某SNP位点若是A/G多态，对应的延伸引物长度为22个碱基(分子量7200Da)，当该SNP位点处是A基因型，延伸引物将延伸一个T核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量7487.2Da的延伸产物，当该 SNP位点处是G基因型，延伸引物将延伸一个C核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量7447.2Da的延伸产物，两种产物之间存在40Da的分子量差异。即对该SNP位点而言，若使用此7200Da的延伸引物，G基因型将对应7447.2Da的质谱峰，A基因型将对应7487.2Da 的质谱峰。在实际检测过程中，使用者可通过软件对7200Da、7447.2Da、7487.2Da三处进行观察：若7200Da处出现质谱峰，则是有部分或全部延伸引物没有与ddNTP结合；不论 7200Da处是否出现质谱峰，若7447.2Da与7487.2Da处仅出现一处质谱峰，则该SNP位点的基因型为纯合型，并与质谱峰的位置对应，如前所述，7447.2Da的质谱峰对应G基因型， 7487.2Da的质谱峰对应A基因型；若7447.2Da与7487.2Da两处质谱峰均出现，则该SNP 位点的基因型为杂合型；若7447.2Da与7487.2Da两处质谱峰均未出现，则实验失败。

术语“纯化”，指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的 PCR产物纯化有两种方式：一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离杂质，并回收相对较纯的PCR产物，可以认为是第一种纯化方式，该方式一般耗时，操作复杂，特别是样本量大时；碱性磷酸酶的作用是降解(亦称“消化”)dNTP，使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，可以认为是第二种纯化方式。应当指出的是，单独的外切酶ExoI不起纯化作用，当它与碱性磷酸酶混合使用时，其作用是预先将单链DNA(在反应完成后的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP，再由碱性磷酸酶使 dNTP继续降解。由于PCR引物被降解，不会进入最后的质谱检测步骤，因此，如果计划纯化步骤中增加ExoI外切酶处理，那么无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外，在单碱基延伸步骤之前，由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温失活，其不会降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等，因此避免对后续实验产生影响。

术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。其中，在设计延伸引物时，对于不同的SNP位点，根据这些位点所在DNA区域的序列特点，以及SNP位点的基因型，可以设计出分子量不同的延伸引物和延伸产物，避免不同延伸引物及产物之间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对宽阔的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多个SNP位点的检测。

术语“SNP”基因型，指表示人基因组中单核苷酸多态性的类型。其中，在实际检查中，作为对照的用于检测的基因型既可来自于对照人基因组中，也可来自已克隆入质粒的载体工具，而后者具有可复制和保存便捷、来源稳定而受到实际使用者的欢迎。

术语“SNP突变频率”，指SNP位点发生突变的概率。理论上，本发明能同时检测单个个体中同时存在20个SNP突变。但实践中研究者发现，不同SNP突变在个体中存在一定的突变频率。HapMap项目为国际组织对人基因组中SNP位点在不同人群中进行检测的项目，NCBI数据库中有各位点在不同人群中的详细频率信息。根据这些信息20个位点同时发生多处突变的概率极低。然而，由于以上研究涉及的样本量过低，远远低于预期的数量，例如对于发生频率较低的位点(如0.5％)，理论上需要检测100人的200条染色体，才能出现预期的结果。因此，以上数据仅仅表明同时发生多个SNP位点突变的情况，其发生频率极低，但并非意味着本发明不能检测同时发生20个SNP位点突变的情况。实践中我们发现，PCR 测序法或荧光定量PCR法，每增加一个检测SNP位点的反应，就要增加相应的费用和时间。相比之下，质谱法检测优势在于无论多少个待检位点，只要能在一个反应管内反应，则花费的试剂和时间是不变的，这也是本发明同时检测多个SNP位点突变的优势。

附图说明

图1为实施例四中，对A1样本20个位点的质谱检测结果。

图2为实施例四中，对A2样本20个位点的质谱检测结果。

图3为实施例四中，对A3样本20个位点的质谱检测结果。

图4为实施例四中，对A4样本20个位点的质谱检测结果。

图5为实施例四中，对A5样本20个位点的质谱检测结果。

图6为实施例四中，对A6样本20个位点的质谱检测结果。

图7为实施例四中，对A7样本20个位点的质谱检测结果。

图8为实施例四中，对A8样本20个位点的质谱检测结果。

图9为实施例四中，对A9样本20个位点的质谱检测结果。

图10为实施例四中，对A10样本20个位点质谱的检测结果。

图11为实施例四中，20个SNP位点均为野生型的质粒质谱图。

图12为实施例四中，20个SNP位点均为突变型的质粒质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例一：引物设计及合成。

针对GJB2基因35delG位点、167delT位点、176_191del16位点、235delC位点和299_300delAT位点；GJB3基因538C>T位点和547G>A位点；SLC26A4基因281C>T位点、589G>A位点、IVS7-2A>G位点、1174A>T位点、1226G>A位点、1229C>T位点、IVS15+5G>A位点、 1975G>C位点、2027T>A位点、2162C>T位点和2168A>G位点；12SrRNA基因1494C>T位点和1555A>G位点20个与耳聋相关的基因多态位点，设计对应特异性PCR引物核心序列 (SEQ ID No：1至SEQ ID No：40)和特异性延伸引物核心序列(SEQ ID No：41至SEQ ID No： 60)。

其中，为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，每条PCR引物的5'端可以在核心序列(SEQ ID No：1至SEQ ID No：40)的基础上增加一定数目的碱基，常见如10bp的tag(ACGTTGGATG)，以使PCR引物的分子量增大，从而超出质谱仪检测窗口。

相关引物在上海捷瑞生物工程(上海)有限公司进行合成。

以下检测过程参照毅新博创生物科技有限公司的《耳聋相关基因检测试剂盒(飞行时间质谱法)说明书》(以下简称“说明书”)进行操作。

实施例二：加样。

不需要对血液样本进行处理。按照说明书要求，将血样直接加入到多重PCR体系中，进行多重扩增。采集的血液在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过一个月，并可采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输，建议尽量采用新鲜血液。

实施例三：生物学实验。

使用ABI 9700型PCR仪，按说明书对20个与耳聋相关的基因多态位点进行检验。

试剂盒中用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分为：

序号	组分名称	主要成分	包装规格
				1	反应液I	dNTPs、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>	323μL/管×1管
2	酶I	扩增酶、UNG酶	23μL/管×1管
				3	扩增引物	PCR引物	115μL/管×1管
4	反应液II	Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>	173μL/管×1管
				5	酶II	SAP酶	58μL/管×1管
6	反应液III	ddNTPs、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>	112μL/管×1管
				7	酶III	延伸酶	31μL/管×1管
8	延伸引物	延伸引物	126μL/管×1管
				9	阳性质控品	含纯合突变型位点的质粒混合物	50μL/管×1管
10	阴性质控品	含野生型位点的质粒混合物	50μL/管×1管

按说明书，具体操作方法如下：

1.PCR扩增

1.1在PCR配液区，按照待检样品数(含阳性质控品、阴性对照、空白对照)准备200ul PCR反应管，并在管上标记样本编号；

1.2从试剂盒中取出PCR引物混合液、PCR反应液，使其自然解冻，涡旋振荡使其充分混匀，瞬时离心至管底；

1.3根据样本数目，按下表的比例取出PCR引物混合液和PCR反应液，置于一个离心管中混匀，按每PCR反应管加入4ul混合物进行分装。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份待测样品时，可按10.5-11份样品配制混合物。

组分名称	单反应体积(μL)
		反应液I	13.7
酶I	0.8
		扩增引物	4.0
合计	18.5

1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入1.5ul待测样品，使每份PCR反应体系总体积为20ul。其中，阴性对照为纯化水，空白对照为不加模板。

1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行PCR扩增反应。

2.SAP酶消化

从PCR反应管中吸取5ul的PCR产物后，加入2ul酶切反应液，然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行下表程序。

3.延伸

3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸反应液，置于一个离心管中混匀。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份酶切产物时，可按10.5-11份样品配制混合物

组分名称	单反应体积(μL)
		反应液III	0.83
酶III	0.23
		延伸引物	0.94
合计	2.00

3.2在PCR扩增区，按每管酶切产物加入2ul混合物进行分装。

3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行延伸反应。

4.纯化

在PCR扩增区向每管延伸产物中加入41μL超纯水和15mg树脂，颠倒混匀5分钟。

5.点样

使用微量移液器，吸取0.5ul纯化产物，点样至靶片。

实施例四：上机检测及结果判读。

使用毅新博创生物科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。

另外，分别设置以上位点的野生型对照B1-B10、突变型对照C1-C10。其中，野生型对照B1-B10、突变型对照C1-C10分别来自市售或实验室保藏的人工质粒。本发明中所用的野生型对照质粒B1-B10和突变型对照质粒C1-C10，为在商品化质粒pMD18-T Vector(Takara 公司)的基础上，根据《分子克隆》记载的常规方法，用引物和正常人DNA进行PCR后，将PCR产物插入pMD18-T Vector，即构建野生型质粒B1-B7，再分别定点突变，即构建7个突变型质粒C1-C10。所述质粒B1-B10和C1-C10可长期保存于-20℃甘油中，用时活化并提取质粒DNA。

如前述表2所示，20条延伸引物及它们在20个基因多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量，这些分子量对应各自的质谱峰，若在某分子量处出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的物质(延伸引物或产物)：

判断标准：

(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；

(2)若野生型或突变型对应的质谱峰仅出现一个，则判断为所出现质谱峰对应的基因型的纯合型；

(3)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为杂合型。

质谱结果如图1-12所示，其中图11为20个SNP位点均为野生型的质粒质谱图，图12为20个SNP位点均为突变型的质粒的质谱图。

以前述表2所示各位点延伸引物及延伸产物的分子量检查样本A1-A10的质谱结果(图 1-10)，确定各SNP位点的基因型，结果如表3所示：

表3

即在10例患者样本中，共检测出突变型9例。

对照实施例一

一、根据实施例1，使用以下如表4所示引物，对各位点进行测序：

表4

二、样本DNA来源

为使不同实验之间产生的数据具有可比性，测序验证采用实施例二中从10例患者体内采集的静脉血中提取的人基因组DNA(A1-A10)。

三、测序鉴定

1、PCR反应体系为25μl

反应体系	加样量(L)
		10×PCR Buffer	2.5
2.5mM dNTP	3.0
		Primers(10μmol/L)	1.0
TaqDNA聚合酶(5U/L)	1.0
		模板DNA(30ng/L)	1.0
ddH<sub>2</sub>O	16.5

2、反应条件：反应在ABI公司9700热循环仪上进行，反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环，反应结束后再72℃延伸5 分钟，4℃保存。

3、PCR产物纯化和测序

用试剂盒(OMEGA D2500-01)回收PCR扩增目的条带，定量后进行测序。

测序反应体系为：2μL Mix(Bigdye 3.1、5X sequencing buffer、H₂O)，2μL纯化后的PCR 产物，1μL引物(5μmol/L)；使用ABI9700PCR扩增仪进行测序反应。

循环条件为：

96℃2min→(95℃10s→50℃5s→60℃4min)×30cycles→终止反应。

测序反应产物用试剂盒(OMEGA 1320-01)进行纯化，然后上ABI 3730遗传分析仪进行序列测定。

4.结果分析

对A1-A10样本，使用上表所述的引物，将测序得到的序列，在NCBI上进行 BLAST，确定所扩增序列确实为目的序列后，用SeqMan进行比对，结果汇总如表 5所示。

经过比较，表5与实施例四中的质谱检验结果表3完全一致，说明本发明方法的准确性

对照实施例五：样本盲检

根据本发明的方法，依照实施例1-4中所描述的操作步骤，对79例未知基因型的样本进行盲检。根据实施例四中描述的判定标准对该79例样本进行结果分析，得到表6。由下表6可以看出，本发明所提供的方法可以有效的实现耳聋待检。

Claims (9)

1.一种通过与20处耳聋相关基因多态位点的引物组或检测产品来检测耳聋相关基因多态位点的方法，包括如下步骤：

(1)多重PCR：使用特异性的PCR引物，在一个反应体系中，直接加入全血样本，对20处与耳聋相关的基因多态位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含20处基因多态位点所在DNA区域的PCR产物；

(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；

(3)单碱基延伸：使用7条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；

(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；

(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行进行检测；

其中，所述20个与耳聋相关的基因多态位点分别是：GJB2基因35delG位点、167delT位点、176_191del16位点、235delC位点和299_300delAT位点；GJB3基因538C>T位点和547G>A位点；SLC26A4基因281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T和2168A>G；12SrRNA基因1494C>T和1555A>G。

2.权利要求1的方法，其中，所述引物组包括如下所示的引物：

。

3.权利要求2的检测方法，其中所述延伸引物及对应的产物分子量为：

。

4.权利要求2或3的方法，其中该检测产品为检测试剂盒，包括：

(1)用于PCR的反应试剂，包括：特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；

(2)用于PCR产物纯化的试剂；

(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。

5.权利要求4的方法，其中该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，人基因组DNA提取试剂等试剂。

6.权利要求5的方法，其中用于PCR产物纯化的试剂包括：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。

7.权利要求6的方法，其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

8.权利要求2-7任一所述的方法，其中步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。

9.权利要求9的方法，其中当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。

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