CN111197077A - 降高血压药物硝苯地平用药指导基因检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用不同单核苷酸多态性(SNP)位点具有不同分子量的延伸引物，从而通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI‑TOF MS)同时检测多个位点，最终实现降高血压药物硝苯地平的用药的方法和试剂盒。包括：根据待测的多个目的SNP位点分别设计多重扩增引物和延伸引物；配制多重扩增引物反应体系和延伸引物反应体系；在反应体系中，用多套引物同时分别对多个目的SNP位点进行扩增和单碱基延伸反应；将单碱基延伸反应后的产物进行飞行时间质谱分析，根据质谱峰所代表的不同分子量延伸引物的产物，鉴定不同药物代谢相关SNP的基因型，最终实现降高血压药物硝苯地平的用药。同时提供利用该方法的检测试剂盒。本发明能同时检测3个硝苯地平代谢相关的SNP位点，并具有成本低、无需合成探针、耗时短、结果分析简单便捷、应用领域极其广泛的优点。

Description

降高血压药物硝苯地平用药指导基因检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种利用质谱特征峰图检测多重PCR单碱基延伸产物的方法及其产品，该方法可以在1个多重PCR反应中同时检测多个PCR单碱基延伸扩增的寡核苷酸产物。更具体的说，该方法利用不同目的寡核苷酸片段在质谱分型过程中生成的不同的时间飞行质谱特征峰图，针对多个目的SNP位点同时进行检测，最终判别降高血压药物硝苯地平的个体化用药型。
背景技术
人类的遗传信息储存在基因组中，2002年国际合作项目人类基因组计划的最终完成，绘制出了人类基因组结构的精细图，为相关研究提供了参考序列。人类基因组序列共由30亿个碱基组成，大量研究表明，人群中>1％的遗传差异大约占基因组序列的0.1％左右，即大约300万个碱基的差异，在人群中超过1％的变异频率。这些差异极有可能是造成两个人之间个体差异的遗传因素。发现这些位点，可广泛地应用于遗传标记的研究、评估个体遗传关系、评估物种进化等研究领域。
在人类基因组中，约90％的差异是以单个核苷酸的形式体现出来的，这样的差异位点被称作单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)。SNP具有两个显著的特点：一是数目众多，据估计人类基因组中的SNP数目约在1100万左右，目前NCBI dbSNP数据库中已收录来源于人类基因组的SNP达1083万，其中经过确认的为644万(截至2007年8月22日)，如此大量的SNP方便了选择合适的位点进行疾病研究，也使得绝大多数基因组区域在SNP覆盖范围内；另外一个特点是SNP位点大多数为双态，即在一个位点上仅有两种表现形式(基因型)，这样很容易就能设计出高通量自动化的检测方法。正因为这两个特点，使得SNP位点越来越受到研究者的青睐，被誉为是继限制性片段长度多态性(RestrictionFragment Length Polymorphism，RFLP)和短串联重复序列(short tandem repeat，STR)之后的第三代分子标记物。人类基因组计划完成前后，基因组学研究的重点逐渐转向SNP领域，因此，SNP在遗传标记学、生物群体遗传学、生物分类学、遗传育种学、物种或人类进化学、法科学、药物基因组学等领域都有重要的应用。
我国心血管病患病率处于持续上升阶段。高血压是最常见的心血管疾病之一，也是心血管病的主要危险因素。高血压病人全球约有6.9亿人，发病率高达31.3％。流行病学研究显示，血压水平与心血管病发病率呈线性相关；血压升高是脑卒中和冠心病发病的独立危险因素。高血压是引起危及生命的心、脑血管病如心肌梗死、脑卒中、肾脏功能不全等的主要原因。
临床上用于治疗高血压的药物主要分为五类：利尿剂、β-肾上腺素受体阻滞剂、钙拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂。后两者都是作用于RAAS系统的抗高血压药物。为了降低相关的病死率及致残率，高血压患者通常需要长期服用降压药物。
硝苯地平，用于预防和治疗冠心病心绞痛，特别是变异型心绞痛和冠状动脉痉挛所致心绞痛。具有抑制Ca2+内流作用，能松弛血管平滑肌，扩张冠状动脉,增加冠脉血流量，提高心肌对缺血的耐受性，同时能扩张周围小动脉，降低外周血管阻力，从而使血压下降。小剂量扩张冠状动脉时并不影响血压，为较好的抗心绞痛药。用作抗高血压药，没有一般血管扩张剂常有的水钠潴留和水肿等不良反应。口服吸收良好，经10分钟生效，
Figure BDA0001871555490000011
小时达最大效应，作用维持6-7小时。舌下含服作用较口服迅速。喷雾给药10分钟即出现降压作用，经1小时疗效最显著，约3小时后血压回升(个别可持续11小时)。静脉注射10分钟内可降低血压21％-26％对呼吸功能没有不良影响，故适用于患有呼吸道阻塞性疾病的心绞痛患者，其疗效优于β受体拮抗剂。还适用于各种类型的高血压，对顽固性、重度高血压也有较好疗效。由于能降低后负荷，对顽固性充血性心力衰竭亦有良好疗效，宜于长期服用。
药物基因组学已成为指导临床用药、评估严重药物不良反应发生风险的重要工具。通过检测药物代谢酶和药物靶点基因，可指导临床医生针对特定患者选择合适的降压药物和给药剂量，提高降压药物治疗的有效性和安全性。药物发挥作用的各个环节都可能因基因变异而表现出明显的差异性反应。药物作用的差异表现为药物动力学和药效学的差异。
由美国国立卫生研究院(NIH)创建的药物基因组学知识库(PharmGKB，ThePharmacogenetics&Pharmacogenomics knowledgebase)，收集了史上最完整的与药物基因组相关的基因型和表型信息，并将这些信息系统地归类，是目前全球最重要的药物基因组学知识库，依据其制定的临床药物基因组实施协作组(CPIC，Clinical PharmacogeneticsImplementation Consortium)是药物基因组学临床部署遵循的主要规范。
研究表明，降高血压药物硝苯地平存在多个代谢相关的基因位点。例如，国家卫生计生委合理用药专家委员会和中国医师协会高血压专业委员会共同编写的《高血压合理用药指南(第2版)》筛选出了PharmGKB和CPIC中硝苯地平的吸收、转运、代谢、效应相关的2个基因座位(CACNA1C SLC14A2)的3个多态性位点信息。进行降压药物选择指导的基因检测。根据检测的基因型结果所指向的用药建议，进行更适于个体遗传背景的降压药物种类及剂量选择，从而提高降压药物治疗的有效性和安全性。
例如，SNP的丰富性和双等位基因特性使作物或家畜遗传作图更加精细，使得育种工作者能够更精确的进行标记辅助选择(MAS)和标记辅助导入(MAI)，降低或消除了目的基因之外的遗传背景对这些技术带来的不良影响，同时也给品种资源和品种纯度鉴定带来崭新局面。姜运良等人通过对3种“双肌臀”猪品种的肌肉生长抑制基因3个不同位点进行分析，获得肉质提高的新品种。Monna等人利用SNP标记技术成功地将水稻半矮杆基因sd-1图位克隆，Shen等人构建了水稻全基因组SNP数据库，并成功地筛选多个水稻功能基因。
为了抢占市场，各大生命科学公司都推出了自己的SNP检测方法。其中质谱仪被认为是很有发展前途的仪器，尤其是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，即Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Time-Of-Flight Mass Spectrometry(MALDI-TOF MS)[1，2]是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。仪器主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。MALDI-TOF这种软电离技术，不产生或产生较少的碎片离子。由于分子量是有机化合物最基本的理化性质参数，分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。
MALDI-TOF MS基因分型技术基于“引物延伸法”，即延伸引物在待检测SNP位点上延伸一个或若干个碱基，然后根据延伸产物所带荧光的不同或其分子质量的不同而确定其基因型(图1)。
因此，基于MALDI-TOF MS，开发了一些SNP检测方法，如美国Sequenom公司的hME和iPLEX方法，德国Bruker公司的GOOD assay方法，韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。这些方法的原理是设计一条与待检测SNP位点上游的基因组序列匹配的寡核苷酸探针，根据SNP位点的基因型差异，探针将在待检测SNP位点处连接上不同的脱氧核苷酸。其中，组成DNA片段的四种脱氧核苷酸的分子量分别是：dAMP 313.21Da，dCMP 289.19Da，dGMP329.21Da，dTMP304.20Da。不同脱氧核苷酸之间是存在分子量差异的，其中差异最小的是dAMP与dTMP之间的9.01Da，差异最大的是dCMP与dGMP之间的40.02Da，通过质谱仪能检测到这种差异，从而将分子量不同的探针区分开来。质谱仪的检测效果与探针的分子量相关，探针片段越短，分子量越小，区分效果越明显：例如，在图2中，图2-A标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为5'-ACGT-3'和5'-ACGA-3'，分子量分别为1174.699和1183.770Da，相差9.071Da，B图标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为5'-ACGTACGT-3’和5'-ACGTACGA-3'，分子量分别为2410.628和2419.821Da，相差9.193Da，图2-C标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为5'-ACGTACGTACGT-3'和5'-ACGTACGTACGA-3'，分子量分别为3645.917和3654.736Da，相差8.819Da，同样相差9Da左右，因此，MALDI-TOF MS能够灵敏且准确地测量出单个SNP差异。但如图所示，图2-A中两个峰之间的差异最明显，图2-B次之，图2-C中两个峰之间的差异相对不明显，也就是说，分子量越小，质谱仪的区分效果越明显，即分辨率越高。为了提高质谱仪的分辨率，对SNP位点进行检测倾向于检测分子量较小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通过对含SNP位点的PCR产物进行限制性酶切，产生2000～4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测，而GOOD assay方法通过磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)将含SNP位点的寡核苷酸片段切割成1000～2000Da左右的小片段进行检测。
由美国科学院资深院士、波士顿大学生物高科技中心主任和生物医学工程教授Charles R.Cantor博士发明，并由美国Sequenom公司(San Diego，California)生产的MALDI-TOF MS，被用于SNP的检测分型，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。
目前出现了在利用人类SNP进行判别降高血压药物的用药型的研究中：中国专利申请CN101328502、“一种预测双氢克尿噻降压疗效的方法及试剂盒”，公开了一种预测双氢克尿噻降压疗效的方法及试剂盒，一种预测双氢克尿噻降压疗效的方法，通过测定SLC22A6基因多态位点，进行预测。本发明的优点是：为高血压病患者实现真正意义上的用药提供了科学依据。作为早期的方法，耗时长，准确性低被使用者所诟病
CN1810986“一种预测降血压药物钙拮抗剂药效的方法及其应用”，本发明涉及一种预测降压药药效的方法，特别用于通过测定功能基因多态性位点基因型，来预测钙拮抗剂类降压药药效的方法及其应用。该方法通过测定受试者的肾上腺素受体基因多态性位点的基因型，预测钙拮抗剂类降压药药效；同时根据ADR多态性对钙拮抗剂类降压药药效的影响，设计出调节ADR功能，以增强钙拮抗剂药效的复方药。本发明可指导医生根据个体差异进行药物选择，提高临床用药安全性和治疗的效率，降低发生药物毒副作用和经济负担的风险。CN1465712“一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒、方法、软件和复方药”，本发明涉及一种预测降压药药效的试剂盒、方法和复方药,特别用于通过测定功能基因多态性位点基因型,来预测ACEI类降压药药效的方法及其应用。该试剂盒包括组成包括：引物(Primer)；限制性内切酶NcoI和限制性内切酶缓冲液。方法为通过测定受试者的ADRB2基因Arg16Gly多态性位点的基因型，可定性预测ACEI类降压药药效。当把基因型检测结果作为参数,结合其他基本生理参数和特殊参数通过计算机语言运算后,可得到预测结果更为精确的血压下降的定量值。该方法可应用于制造至少两类药效提高的ACEI类降压药。本发明便于医生在用药时根据个体差异进行选择,提高了临床用药和治疗的效率与安全性，降低了发生毒副作用和经济负担的风险。但这两种方法耗费成本过高，适用面窄，操作复杂繁琐。
作为最接近的现有技术，李清贤、孙倩等(CACNB2基因多态性与钙离子通道阻滞剂降压疗效的相关性研究，《医学研究杂志Journal of Medical Research》2012年03期)报道了钙离子通道辅助β亚基(CACNB2)6个SNP位点多态性对单一钙离子通道阻滞剂(calciumchannelblockers,CCB)治疗原发性高血压疗效的影响。104例原发性高血压患者同时服用单一钙离子通道阻滞剂(纳欣同)20mg，每日1次，随访6周，采用多重聚合酶链反应(multi-PCR)方法及基质辅助激光解析-飞行时间质谱分析技术(MLD1-TOF MS)对患者CACNB2的6个SNP进行基因分型检测，研究不同SNP位点以及同一SNP不同分型对CCB治疗高血压的疗效差异。但是这些方法检测位点少而片面，难以考虑基因互相影响的综合因素，
基于以上基础，需要一种快速、全面、准确、廉价、便捷的方法判断钙通道的影响和阻滞剂硝苯地平用药指导方法。
发明内容
目前，大量文献和现代遗传学的代表性研究表明，SNP是人类基因组中最丰富的遗传标记，已高密度、全方位覆盖人类所有23对染色体。
因此，本发明原理在于：根据现代人类遗传研究成果，在特定基因区域选择能够代表中国人群遗传特征，并且在中国人群中高频变异的SNP位点，组成一套3位点的SNP组合，使用这个SNP组合可有效地在中国人群中进行降高血压药物硝苯地平的用药型判别工作。
基于以上基础，本发明通过大量实验摸索，创造性发现选择由3个SNP位点组成的检测系统，来用于判别降高血压药物的用药型。
因此，本发明的第一个目的是提供一种用于检测人SNP标记进行判别降高血压药物的用药型的引物组合物，其特征在于，该引物组合包括针对能判别降高血压药物的用药型的3个SNP标记的PCR引物对和延伸引物，其中，PCR引物序列对选自如SEQ ID NO:1a-3a所示的序列，延伸引物序列选自如SEQ ID NO:1b-3b所示的序列。
其中，所述SNP选自rs2238032、rs1123617、rs3745009
在一个实施方案中，该引物组合物为独立进行的多重PCR反应引物组合物，并且所述序列如表1所示。
表1
Figure BDA0001871555490000041
其中，SEQ1-3序列代表的位点组成一个独立进行的完整反应体系，这个反应体系包括两个步骤：多重PCR反应和单碱基延伸反应，SEQ1a-SEQ3a引物对参与多重PCR反应，SEQ1b-SEQ3b引物参与单碱基延伸反应；
所述的SNP位点rs2238032、rs1123617、rs3745009，其序列可从已知公开的人基因组序列库中获得。
在另一实施方案中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如表2所示。
表2
Figure BDA0001871555490000042
Figure BDA0001871555490000051
在一个实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag(ACGTTGGATG)，例如，PCR引物对SEQ1a两条PCR引物都为5'-ACGTTGGATGGGTCACATGTGAGGCCATC-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。
本发明第二个目的是提供了由上述引物组合物所制备的用于判别降高血压药物的用药型相关多态位点的产品。
在一个实施方案中，该产品为检测试剂盒，包括：
(1)用于PCR的反应试剂，包括：上述扩增引物对，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；
(2)用于PCR产物纯化的试剂；
(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：上述延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶(SAP酶)，ddNTPs，延伸反应缓冲液。
在一个实施方案中，上述产品还包括用于质谱检测且保护上述SNP组合的载体，该载体包括但不限于：芯片和靶板。
在一个具体实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，人基因组DNA提取试剂等试剂。在另一个具体实施方案中，用于PCR产物纯化的试剂：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
本发明的第三个目的是提供一种利用上述引物组合物或产品，通过不同SNP位点的不同质谱峰图判别用药型的方法，包括：
(1)多重PCR：使用上述PCR引物对，在两个反应体系中，对上述3个SNP位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含3处多态位点所在DNA区域的PCR产物；
(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(3)单碱基延伸：使用上述3条特异性的延伸引物，在两个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；
(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测。
在一个实施方案中，步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。
本发明的第四个目的是提供一种利用上述引物组合物或产品，用于进行判别降高血压药物的用药型的用途。
在一个实施方案中，所述用途包括：指导硝苯地平的个体化用药和人类药物基因组学遗传易感研究等。
技术效果
1、本发明基于一种联合多重PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测与判别用药型相关多态位点(SNP)的检测方案，灵敏度和可靠性明显高于其他方案
2、本技术选取rs3745009、rs1123617、rs2238032三个SNP位点，得到了硝苯地平与降压疗效的关联性
3、使用本方法提供的结果，可以设计个性化的精准治疗方案针对不同的高血压患者
4、本方法更加精准，特异性强。单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对DNA分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低；
5、本方法可任意推测SNP位点的突变对钙通道阻滞剂药物疗效的差异，可用于新型药物设计的基础，为临床有效用药提供药物遗传学依据。
原理与定义
本发明提供了一种联合多重PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测与判别用药型相关多态位点(SNP)的检测方案。其原理在于：
在多重PCR步骤中，通过设计并使用合适的引物，从而能同时扩增多达3个SNP位点所在DNA片段。
在单碱基延伸步骤中，对上一步多重PCR的产物依次进行纯化和多重单碱基延伸。其中，延伸引物共3条，分别与3个SNP位点对应，并在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对(如某SNP位点处是A基因型，将在对应的延伸引物上延伸T核苷酸)。在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸。
在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在纯化后，点至含基质的靶片，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与它们的分子量呈负相关，即分子量越大，飞行速度越慢，到达检测器的时间越晚。
术语“rs3745009、rs1123617、rs2238032”，均是人SNP位点在NCBI db_SNP数据库的统一编号。
术语“引物组合物”，指本发明中由3对PCR扩增引物对和3条延伸引物组成的系统或组合物。该引物是依据各个位点前后各200bp序列设计出来的。
术语“碱性磷酸酶消化”，其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使dNTP的5'-P末端转换成5'-OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一步单碱基延伸的影响。
术语“外切酶ExoI消化”，其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA的dNTP之间3,5-磷酸二酯键，使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR反应后残余的PCR引物。由于外切酶可以将单链的PCR引物切除，并不会在检测窗口中出现，因此使用该外切酶时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
术语“单碱基延伸”，又被称之为微测序(mini sequence)，指在体系中加入延伸引物和ddNTP，ddNTP与延伸引物的3'端连接形成延伸产物(即引物延伸了一个碱基)，根据碱基互补配对原则，由SNP位点处基因型决定具体连接何种ddNTP，这个过程类似于PCR过程中dNTP根据互补链的碱基组成，逐个添加到PCR引物上。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基，不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅在SNP位点处连接一个ddNTP，而不能像PCR那样，不断的往下延伸，因此称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，测序引物连接dNTP后将继续延伸，只有连接ddNTP后，方终止延伸，因此测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物；单碱基延伸体系中加入只有ddNTP，延伸引物只能连接一个ddNTP，并终止延伸，因此单碱基延伸产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。
术语“检测产品”，指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品，包括：检测试剂、检测芯片(如基因芯片、液体芯片等)、检测载体，以及检测试剂盒等。
术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸，它们之间存在分子量差异，如ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTTP是修饰后的分子量)。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的核苷酸，将形成分子量差异。通过质谱检测，可分辨出这种差异。例如，某SNP位点若是G/A多态，对应的延伸引物长度为20个碱基(分子量6153Da)，当该SNP位点处是G基因型，延伸引物将延伸一个C核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量6400.2Da的延伸产物，当该SNP位点处是A基因型，延伸引物将延伸一个T核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量6480.1Da的延伸产物，两种产物之间存在80.1Da的分子量差异。即对该SNP位点而言，若使用此6153Da的延伸引物，G基因型将对应6400.2Da的质谱峰，A基因型将对应6480.1Da的质谱峰。在实际检测过程中，使用者可通过软件对6153Da、6400.2Da、6480.1Da三处进行观察：若6153Da处出现质谱峰，则是有部分或全部延伸引物没有与ddNTP结合；不论6153Da处是否出现质谱峰，若6400.2Da与6480.1Da处仅出现一处质谱峰，则该SNP位点的基因型为纯合型，并与质谱峰的位置对应，如前所述，6400.2Da的质谱峰对应G基因型，6480.1Da的质谱峰对应A基因型；若6400.2Da与6480.1Da两处质谱峰均出现，则该SNP位点的基因型为杂合型；若6400.2Da与6480.1Da两处质谱峰均未出现，则实验失败。
术语“纯化”，指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的PCR产物纯化有两种方式：一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离杂质，并回收相对较纯的PCR产物，可以认为是第一种纯化方式，该方式一般耗时，操作复杂，特别是样本量大时；碱性磷酸酶的作用是降解(亦称“消化”)dNTP，使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，可以认为是第二种纯化方式。应当指出的是，单独的外切酶ExoI不起纯化作用，当它与碱性磷酸酶混合使用时，其作用是预先将单链DNA(在反应完成后的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP，再由碱性磷酸酶使dNTP继续降解。由于PCR引物被降解，不会进入最后的质谱检测步骤，因此，如果计划纯化步骤中增加ExoI外切酶处理，那么无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外，在单碱基延伸步骤之前，由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温失活，其不会降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等，因此避免对后续实验产生影响。
术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。其中，在设计延伸引物时，对于不同的SNP位点，根据这些位点所在DNA区域的序列特点，以及SNP位点的基因型，可以设计出分子量不同的延伸引物和延伸产物，避免不同延伸引物及产物之间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对宽阔的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多个SNP位点的检测。
术语“SNP”基因型，指表示人基因组中单核苷酸多态性的类型。其中，在实际检查中，作为对照的用于检测的基因型既可来自于对照人基因组中，也可来自已克隆入质粒的载体工具，而后者具有可复制和保存便捷、来源稳定而受到实际使用者的欢迎。
术语“SNP突变频率”，指SNP位点发生突变的概率。理论上，本发明能同时检测单个个体中同时存在3个SNP突变。但实践中研究者发现，不同SNP突变在个体中存在一定的突变频率。
3个SNP位点的中国人群(HCB,Han Chinese Beijing)中的变异频率参见：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？rs＝374500
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？rs＝1123617
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？rs＝2238032
术语“SEQ ID NO:1-3”指3个位点的前后各200bp序列，其序列参见序列表。
附图说明
图1：MALDI-TOF MS分型SNP原理图示；
图2：分别是具有相同SNP(T/A)的不同长度的序列分子量与质谱仪分辨率关系的示意图。其中，图例A是5bp长度(5’-ACGT-3’和5’-ACGA-3’)的分子量质谱检测差异，图例B是8bp长度(5’-ACGTACGT-3’和5’-ACGTACGA-3’)的分子量质谱检测差异，图例C是12bp长度(5’-ACGTACGTACGT-3’和5’-ACGTACGTACGA-3’)的分子量质谱检测差异；
图3：某个样品的多个位点同时检测时的质谱峰图结果；其中横坐标单位是分子量，每个位点的延伸引物都有可能在两个位置出现质谱峰，每个位点的质谱峰都没有重叠；
图4：野生型质粒(4-A)和突变型质粒(4-B)质谱峰图。
参考文献
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2.THE MΜLTIDRUG TRANSPORTER,A DOUBLE-EDGED SWORD.Journal ofBiological Chemistry,1988.263(25):p.12163-12166.
3.STR typing of buccal swabs for paternity testing with reference toJapanese popμLation data on the D20S85,D14S118,and D14S543loci.Nihon HoigakuZasshi.1996Dec；50(6):404-11.
4.Production of monoclonal anti-thy mine-dimer antibody and its usefor detection of STR alleles.Nihon Hoigaku Zasshi.1996Oct；50(5):343-8.
具体实施方式
实施例一：引物设计及合成
本试剂盒的目的SNP周边序列是在db_SNP(build 132)和Hapmap(Rel 28,PhaseⅡ+Ⅲ,Aug 10)数据库查询，并使用这些序列设计多重PCR引物和单碱基延伸引物。
针对rs2238032、rs1123617、rs3745009等3个与判别用药型相关的多态位点设计对应特异性PCR引物核心序列(SEQ1a至SEQ3a)和特异性延伸引物核心序列(SEQ1b至SEQ3b)。3对PCR引物3条延伸引物组成独立进行的反应体系：SEQ1a/b至SEQ3a/b组成一个反应体。
相关引物在生工生物工程(上海)有限公司进行合成。
实施例二：样本DNA提取
收集普通中国人DNA样本共10例，分别标记为A1-A10。其中，样本采集、DNA提取等按照说明书要求，采集人静脉血，并以EDTA抗凝管收集。按照说明书要求，采集的血液在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过一个月，并可采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输，建议尽量采用新鲜血液进行基因组DNA提取。由于本试剂盒不提供人基因组DNA提取试剂，因此采用商业化的核酸提取试剂盒(如QIAGEN公司的DNeasy Blood and Tissuekit)，从每位患者的200μL全血中提取人基因组DNA，以NanoDrop 2000(Thermo公司)定量，并标化至30ng/μL(分别为A1-A10)。其中，该试剂盒推荐对浓度为30ng/μL的人基因组DNA进行检测，但对比实验表明，本试剂盒对浓度低至10ng/μL的人基因组DNA也能检测出阳性结果。按照说明书要求，提取后的人基因组DNA，在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过两年，-80℃可长期保存，应避免反复冻融，并置于冰盒中进行运输。
实施例三：生物学实验
使用ABI 9700型PCR仪，按说明书对3个与判别用药型的多态位点进行检验。
试剂盒中用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分为：
序号 组分名称 主要成分 规格
1 PCR引物混合液 PCR引物 24μL/管x1管
2 PCR反应液 Taq酶、dNTP 72μL/管x1管
3 酶切反应液 SAP酶 48μL/管x1管
4 延伸引物混合液 延伸引物 24μL/管x1管
5 延伸反应液 单碱基延伸酶、ddNTP 24μL/管x1管
6 阳性质控品 人基因组DNA(30ng/μL) 10μL/管x1管
其中各引物对浓度均为500nmol/L。
按说明书，具体操作方法如下：
1.PCR扩增
1.1在PCR配液区，按照待检样品数(含阳性质控品、阴性对照、空白对照)准备200μL PCR反应管，并在管上标记样本编号；
1.2从试剂盒中取出PCR引物混合液、PCR反应液，使其自然解冻，涡旋振荡使其充分混匀，瞬时离心至管底；
1.3根据样本数目，按下表的比例取出PCR引物混合液和PCR反应液，置于一个离心管中混匀，按每PCR反应管加入4μL混合物进行分装。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份待测样品时，可按10.5-11份样品配制混合物。
组分名称 单反应体积
PCR引物混合液 1μL
PCR反应液 3μL
合计 4μL
PCR反应的总反应体系为：
Figure BDA0001871555490000091
1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入1μL待测样品，使每份PCR反应体系总体积为5μL。其中，阴性对照为纯化水，空白对照为不加模板。
1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行PCR扩增反应。
Figure BDA0001871555490000101
反应步骤为：于94℃ 120s活化DNA聚合酶后，于94℃变性10s，56℃退火10s和72℃延伸60s，循环45次。
2.SAP酶消化
SAP酶反应体系为：
Figure BDA0001871555490000102
在PCR反应管中加入2μL酶切反应液，然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行下表程序。
温度 时间(分) 循环数
85 5 1
37 20 1
反应步骤为：在反应体系中加入2μl 0.3U SAP酶，于85℃放置5min进行活化，再置于37℃下恒温20min进行多余碱基消减反应。
3.延伸
3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸反应液，置于一个离心管中混匀。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份酶切产物时，可按10.5-11份样品配制混合物。
组分名称 单反应体积
延伸引物混合液 1μL
延伸反应液 1μL
合计 2μL
单碱基延伸反应的总反应体系为：
Figure BDA0001871555490000103
3.2在PCR扩增区，按每管酶切产物加入2μL混合物进行分装。
3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行延伸反应。
Figure BDA0001871555490000111
反应步骤为：于94℃ 30s活化DNA聚合酶后，于94℃变性5s，52℃退火5s和80℃延伸5s，循环200次。最后一步72℃延伸180s。
4.纯化
在PCR扩增区向每管延伸产物中加入16μL纯化水，6mg树脂，颠倒混匀30分钟。
5.点样
使用微量移液器，吸取1μL纯化产物，点样至靶片。
实施例四：上机检测及结果判读
使用毅新兴业(北京)科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。
所述的质谱峰图是单碱基延伸反应完成后，将反应产物点样到质谱芯片上，再用质谱仪进行分析得到的图谱。各个位点的延伸引物分子量各不相同，各个位点的两种等位基因进行单碱基延伸后，也会产生两条不同分子量的延伸产物，这样在不同的分子量横坐标上，不同样品和不同位点产生不同的质谱峰。另外，分别设置以上位点的野生型对照B1-B3、突变型对照C1-C3。其中，野生型对照B1-B3、突变型对照C1-C3分别来自市售或实验室保藏的人工质粒。本发明中所用的野生型对照质粒B1-B3和突变型对照质粒C1-C3，为在商品化质粒pMD18-T Vector(Takara公司)的基础上，根据《分子克隆》记载的常规方法，用引物和正常人DNA进行PCR后，将PCR产物插入pMD18-T Vector，即构建野生型质粒B1-B3，再分别定点突变，即构建3个突变型质粒C1-C3。所述质粒B1-B3和C1-C3可长期保存于-20℃甘油中，用时活化并提取质粒DNA。
如前述表2所示，3条延伸引物及它们在3个多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量，这些分子量对应各自的质谱峰，若在某分子量处出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的物质(延伸引物或产物)：
判断标准：
(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；
(2)若野生型或突变型对应的质谱峰仅出现一个，则判断为所出现质谱峰对应的基因型的纯合型；
(3)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为杂合型。
质谱结果如图4所示，其中图4-A野生型的质粒的质谱图，图4-B为突变型的质粒的质谱图。
以前述表2所示各位点延伸引物及延伸产物的分子量检查样本A1-A10的质谱结果，确定各SNP位点的基因型，结果如表3所示
表3
Figure BDA0001871555490000112
Figure BDA0001871555490000121
对照实施例一
一、根据实施例1所公开的SNP位点，使用以下如表4所示引物，通过常规PCR检测法对各位点进行测序：
表4
Figure BDA0001871555490000122
二、样本DNA来源
为使不同实验之间产生的数据具有可比性，测序验证采用实施例二中从10例待检者体内采集的静脉血中提取的人基因组DNA(A1-A10)。
三、测序鉴定
1、PCR反应体系为25μl
Figure BDA0001871555490000123
用ddHO补齐。
2、反应条件：反应在ABI公司9700热循环仪上进行，反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环，反应结束后再72℃延伸7分钟，4℃保存。
3、PCR产物纯化和测序
(1)向装有PCR产物的96孔板中加入50微升洗涤缓冲液，混匀。
(2)将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。
(3)向纯化板中再次加入50微升的洗涤缓冲液，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。
(4)将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20微升的去离子水，静置15分钟。
(5)再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。
测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。
(6)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。
(7)测序反应体系为5μl，各种试剂加入量如下：PCR产物3-10ng，BigDyev3.1 0.25μl，5*BigDye buffer 0.875μl，引物1.6pmol；
(8)样品放于PCR仪上做如下反应：
步骤：95℃，5分；
95℃，10秒；60℃，4分；重复30个循环；
4℃保持直到准备纯化。
(9)在每个孔中加入20μl 80％乙醇，4,000rpm离心30min；
(10)将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率1000rpm；
(11)在每孔中加入30μl 70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；
(12)重复第11步的操作2次；
(13)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；
(14)加人5μl甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；
(15)测序仪前95℃变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。
(16)使用ABI3730xl型遗传分析仪进行序列测定
四、结果
对A1-A10样本，使用上表所述的引物，分别对上述3个SNP位点rs2238032、rs1123617、rs374500(分别编号NO:1-3)测序，最终测序结果如表5所示：
表5
Figure BDA0001871555490000131
经过比较，表3的结果与表5完全一致，说明本发明检测方法的准确性。
序列表
<110> 北京毅新博创生物科技有限公司
<120> 降高血压药物硝苯地平用药指导基因检测试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg tctccagttt ggattgccgc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg taggtgactt tgctgagcgg 30
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacgaccaat aacccc 16
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg agccaaggtc aagttgtctc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg ttatcacagc cgtacacttg 30
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagattttga gagccatccc c 21
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgttggatg ttggcatctg aggacacttc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggatg tgcacatgga ccagaaaagg 30
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagttgcaca tacatgac 18

Claims (9)

1.一种用于判别降高血压药物硝苯地平的个体化用药型的引物组合物，其特征在于，该引物组合包括针对能判别硝苯地平用药型的3个SNP标记的PCR引物对和延伸引物，其中，PCR引物序列对选自如SEQ ID NO:1a-3a所示的序列，延伸引物序列选自如SEQ ID NO:1b-3b所示的序列。
2.权利要求1所述的引物组合物，其中所述SNP分别选自：
rs2238032、rs1123617、rs3745009。
3.权利要求1所述的引物组合物，其中上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括5-15个保护碱基序列，优选为10bp的tag：ACGTTGGATG。
4.权利要求1-3所述的引物组合物，其中延伸引物5'端可增加作为接头的碱基序列，其中优选为1-15个碱基，更优选1-3个碱基。
5.由权利要求1-4的引物组合物所制备的用于判别硝苯地平用药型的检测产品，包括：
(1)用于PCR的反应试剂，包括：上述扩增引物对耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；
(2)用于PCR产物纯化的试剂；
(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：上述延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶(SAP酶)，ddNTPs，延伸反应缓冲液。
6.权利要求5所述的检测产品，其中还包括用于质谱检测且保护上述SNP组合的载体，优选质谱芯片和质谱仪。
7.使用权利要求1-4的引物组合物，或权利要求5-6的检测产品，进行质谱法判别硝苯地平用药型的方法，包括以下步骤：
(1)多重PCR：使用上述PCR引物对，在两个反应体系中，对上述3个SNP位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含3处多态位点所在DNA区域的PCR产物；
(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；
(3)单碱基延伸：使用上述3条特异性的延伸引物，在两个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；
(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测。
8.权利要求7的方法，其中步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱。
9.使用权利要求1-4的引物组合物，或权利要求5-6的检测产品，用于进行降高血压药物硝苯地平用药型的判别。
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