CN103352073A - 用于检测与遗传性耳聋相关的基因snp的引物系统及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测10处与遗传性耳聋相关的基因多态位点的引物系统。基于该引物系统所制备的产品，能实现同时对遗传性耳聋相关的10处基因多态位点进行检测。使用该产品，对被检者在10处基因多态位点的基因型进行检测，检测结果可以辅助临床诊断，也可用于流行病学调查及产前筛查、新生儿筛查等领域。本发明能在一个反应体系内对不同基因上的10处基因多态位点同时进行检测，较测序、实时荧光定量PCR等技术成本更低，操作更简便，准确度和灵敏度提高。

Description

用于检测与遗传性耳聋相关的基因SNP的引物系统及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于确定遗传性耳聋相关的基因多态位点（SNP）的检测方法及产品，具体而言是利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对遗传性耳聋相关的10个基因多态位点进行检测的方法及相应的试剂盒。

背景技术

根据我国卫生部统计资料表明，我们目前有1.2亿人存在听力障碍，而存在听力语言残疾者高达3000万人，并且每年以3万名新生聋儿的速度在递增，其中50%以上的患者的病因与遗传因素相关。根据国外发达国家的临床统计数据表明，遗传性耳聋患者占总数的80%，因此开展遗传性耳聋的检测对耳聋的分子流行病学研究和聋儿的提前筛查起到重要作用。

目前耳聋基因的相关研究表明，由GJB2、SLC26A4和线粒体基因突变导致的耳聋占30-50%。因此，通过GJB2、SLC26A4和线粒体基因的常规检测可以确定大部分遗传性耳聋。其中最常见的易感基因是GJB2，占先天性重度耳聋患者的一半左右。然而，不同种族中GJB2基因具有不同的突变形式。在中国人群中，GJB2基因的致病突变热点最常见的为235delC，其次为299-300delAT、176del16bp和35delG，该基因突变者多表现为先天性重度耳聋。因此，对新生儿进行GJB2基因突变检测是早期发现潜在耳聋发病风险、早期预防的重要策略。SLC26A4基因突变表现出广泛的等位基因异质性，目前报道的SLC26A4基因突变类型已达150余种，其中以错义突变最为常见，还包括无义突变、剪切点突变、移码突变等形式。不同种族人群间的SLC26A4基因突变谱不同。朱庆文等对安阳市特教学校151例聋哑学生SLC26A4基因突变热点区域序列分析结果显示，31.79%患者检测到了SLC26A4基因的突变，包括双等位基因突变者26例（17.22%），单等位基因突变者22例（14.57%）。这3种基因引起的遗传性耳聋约占整个遗传性耳聋的80%。并且在SLC26A4基因变携带体中，超过30%的人都可能具有发病的危险。线粒体基因12S rRNA突变与链霉素、庆大霉素、卡那霉素等氨基糖甙类药物引起的药物性耳聋有着密切关系，其中以12S rRNA基因的A1555G发生频率最高。综上所述，在中国人群中，特别是新生儿中进行遗传性耳聋易感基因的检测，将对提高中国人健康水平具有重要作用，而且具有重大的社会意义和经济意义。

目前，在耳聋易感基因的检测技术方面，国内外均已发展出多种技术策略和相关产品。直接测序（direct sequencing，DS）是将聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增产物纯化、变性后，通过测序仪进行测序，是寻找突变的标准。中国专利申请200610066222、“一种用于体外诊断非综合征性常染色体隐性遗传耳聋基因GJB2突变的引物及其应用”公开了一种用于检测人GJB2基因的突变热点的233-235位点碱基C缺失（即233-235delC突变）的引物及其试剂盒。该方法通过涉及引物PCR扩增GJB2中的该突变位点，并通过电泳检测和测序而最终确定患者是否发生233-235delC突变。然而，该发明涉及的仪器设备昂贵，且操作复杂、耗时较长，此外，杂合突变、胶回收、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，因此限制了耳聋易感基因的检测应用。

基因芯片法目前已经有试剂盒，采用了基因芯片杂交的原理，可以同时检测四个耳聋基因（GJB2、GJB3、SLC26A4和/或12S rRNA）中的9个位点（应用基因芯片技术检测非综合征型耳聋基因突变.生物技术通讯，2010（1）：张艳等）。中国专利申请200710178153、“中国人群遗传性耳聋基因SLC26A4的突变类型和突变频率及其用途”和中国专利申请201010599419、“用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒”分别公开了针对耳聋基因的可能致聋突变位点设计探针序列，并结合于基因芯片上，可同时检测多个突变位点。该方法的优点是检测时间比较快速，可以高通量筛查，但由于操作过于复杂，成本过高，不易普及。

Tagman探针法主要针对药物性致聋相关基因的检测，配合野生型和突变型两种特异性引物、基因特异性荧光探针、以及PCR反应液和DNA聚合酶等成分，可以在体外扩增检测C1494T和A1555G的4种基因型。中国专利申请200610169639和200610169638分别公开了用于检测母系遗传线粒体耳聋基因C1494T、A1555G突变的TaqMan MGB探针及其用途。该发明设计两条Taqman突变型和野生型MGB探针和一对引物，通过实时定量TaqmanMGB探针法进行针对母系遗传线粒体耳聋基因C1494T、A1555G突变的基因型分析，从而诊断母系线粒体遗传耳聋疾病。然而，这些发明对仪器和操作人员的技术要求较高、成本较高，并且检测的位点数目较少，难以覆盖中国人群中的主要的耳聋易感基因。

中国专利申请200810200587、“一种儿童先天性耳聋基因分析检测试剂盒”公开了一种使用荧光定量PCR检测试剂盒来检测儿童233-235delC缺失突变致聋，试剂盒包括由DNA抽提试剂、预混PCR反应液、标准阳性对照品、标准阴性对照品组成以及扩增与儿童先天性耳聋GJB2基因相关突变的引物。但该方法仅仅针对GJB2基因的233-235delC缺失，突变热点覆盖面过小，且涉及使用荧光SYBR green I标记等昂贵试剂，不符合现有需求。

综上所述，目前存在的技术问题是：缺乏一次能同时检测多个耳聋基因相关的基因多态位点的方法和产品，常见的检测技术，如测序、实时荧光定量PCR等，均需对位点逐一进行检测，当位点较多时操作复杂，费用较高。由于这些现有方法中受到检测能力的限制，不能覆盖中国人群中常见的10种耳聋易感基因位点。因此目前需要一种不同于以往的检测技术，能检测尽量多的SNP位点、且能在同一体系中针对同一个体的多个SNP或者针对多个个体中的一个或多个不同的SNP的技术。该技术将对我国耳聋基因检测提供便捷的技术手段，具有重要的社会和经济意义。

发明内容

本发明原理在于：提供了一种联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测遗传性耳聋相关基因多态位点(SNP)的检测方案。其中：在多重PCR中同时扩增多达10个含SNP的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在10个SNP处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与SNP处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各SNP处的基因型。

因此，本发明第一个目的是提供一种检测10处与遗传性耳聋相关的基因多态位点的引物系统或引物组，其序列如表1所示。

编号	序列(5'→3′)	针对位点	用途
				SEQIDNo:1	AGAAGTCTCCCTGTTCTGTC	rs80338939	PCR引物
SEQIDNo:2	TCTCCCCCTTGATGAACTTC	rsS0338939	PCR引物
				SEQIDNo:3	AGAAGTCTCCCTGTTCTGTC	GJB2176del16	PCR引物
SEQIDNo:4	TCTCCCCCTTGATGAACTTC	GJB2176del16	PCR引物
				SEQIDNo:5	AGAAGTCTCCCTGTTCTGTC	rs80338943	PCR引物
SEQIDNo:6	TCTCCCCCTTGATGAACTTC	RS80338943	PCR引物
				SEQIDNo:7	AGAAGTCTCCCTGTTCTGTC	RS111033204	PCR引物
SEQIDNo:8	TCTCCCCCTTGATGAACTTC	RS111033204	PCR引物
				SEQIDNo:9	TCAGCCTCATCTTCAAGCTC	RS74315319	PCR引物
SEQIDNo:10	CCACCATGAAGTAGGTGAAG	RS74315319	PCR引物
				SEQIDNo11	AATGCGGGTTCTTTGACGAC	RS121908362	PCR引物
SEQIDNo12	CCCTCTTGAGATTTCACTTG	rs121908362	PCR引物
				SEQIDNo13	AGACACAAAATCCCAGTCCC	rs111033313	PCR引物
SEQIDNo14	GGCTCCATATGAAATGGCAG	rs111033313	PCR引物
				SEQIDNo15	TTCGTCCAAGTGCACTTTCC	MIT12SrRNA1494C＞T	PCR引物
SEQIDNo16	AGTTGAACAGGGCCCTGAAG	MIT12SrRNA1494＞T	PCR引物
				SEQIDNo17	TTCGTCCAAGTGCACTTTCC	mit12SrRNA1555A＞G	PCR引物
SEQIDNo18	AGTTGAACAGGGCCCTGAAG	mit12SrRNA1555A＞G	PCR引物
				SEQIDNo19	TCAGCCTCATCTTCAAGCTC	rs7431531	PCR引物
SEQIDNo:20	CCACCATGAAGTAGGTGAAG	rs74315318	PCR引物
				SEQIDNo:21	GTTTGTTCACACCCCC	rs80338939	延伸引物
SEQIDNo:22	GGGAAGTAGTGATCGTAGC	GJB2176del16	延伸引物
				SEQIDNo:23	ctCGAAGATCAGCTGCAGG	rs8033894	延伸引物
SEQIDNo:24	CGTGGCCTACCGGAGAC	rs111033204	延伸引物
				SEQIDNo:25	CGTGGACTGCTACATTGCC	rs7431531	延伸引物
SEQIDNo:26	CATTCTTTTTGACGGTCC	rs121908362	延伸引物
				SEQIDNo:27	GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTC	rs111033313	延伸引物
SEQIDNo:28	CTTTGAAGTATACTTGAGGAG	mit12SrRNA1494C＞T	延伸引物
				SEQIDNo:29	ctCTACGCATTTATATACAGCAG	mit12SrRNA1555A＞G	延伸引物
SEQIDNo:30	GTAGGTGAAGATTTTCTTCT	rs74315318	延伸引物

其中，所述10个与遗传性耳聋相关的基因多态位点分别是：GJB2基因rs80338939（35delG）、GJB2基因176del16、GJB2基因rs80338943（235delC）、GJB2基因rs111033204（299delAT）、GJB3基因rs74315319（538C>T）、GJB3基因rs74315318（547G>A）、SLC26A4基因rs121908362（2168A>G）、SLC26A4基因rs111033313（IVS7-2 A>G）、mit 12S rRNA1494C>T、mit 12S rRNA 1555A>G。

其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如表2所示。

表2

在一个实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag（ACGTTGGATG），例如，PCR引物SEQ ID NO:1为5'-ACGTTGGATGTCCAGGGTTCAAGTGGTTCT-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。

本发明第二个目的是提供了由上述引物系统所制备的用于检测遗传性耳聋相关基因多态位点的产品。

在一个实施方案中，该产品为检测试剂盒，包括：

（1）用于PCR的反应试剂，包括：特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；

（2）用于PCR产物纯化的试剂；

（3）用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。

在一个具体实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，人基因组DNA提取试剂等试剂。

在另一个具体实施方案中，用于PCR产物纯化的试剂：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

本发明第三个目的是使用上述引物、产品或试剂盒来检测遗传性耳聋相关基因多态位点的方法，包括如下步骤：

（1）多重PCR：使用特异性的PCR引物，在一个反应体系中，对10处与华法林用药剂量相关的基因多态位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含10处基因多态位点所在DNA区域的PCR产物；

（2）PCR产物纯化：对步骤（1）得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；

（3）单碱基延伸：使用10条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤（2）得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；

（4）延伸产物纯化：对步骤（3）得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行进行检测；

其中，所述10个与遗传性耳聋相关的基因多态位点分别是：GJB2基因rs80338939（35delG）、GJB2基因176del16、GJB2基因rs80338943（235delC）、GJB2基因rs111033204（299delAT）、GJB3基因rs74315319（538C>T）、GJB3基因rs74315318（547G>A）、SLC26A4基因rs121908362（2168A>G）、SLC26A4基因rs111033313（IVS7-2A>G）、mit12S rRNA1494C>T、mit12S rRNA1555A>G。

在一个实施方案中，步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。

本发明第四个目的是提供前述试剂盒在检测10个遗传性耳聋相关的SNP的用途。

技术效果

1.敏感：本发明综合了多重PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用PCR检测多态性SNP，因此它的检测灵敏度很高。

2.特异：单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对DNA分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低；

3.简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染；

4.快速：速度快、高通量，可在5-6小时内完成数百个样本的检测。

5、本发明可对多个待检个体进行检测，分别得到具有不同SNP位点的检测结果，其中受检者可以是单个SNP位点发生突变，也可以是多个SNP位点发生突变。这表示受检者可以携带一个或多个SNP突变。

6、本发明克服了以往技术一次检测SNP位点过少的缺陷,成本低廉。

原理与定义

本发明提供了一种联合多重PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测与遗传性耳聋相关基因多态位点(SNP)的检测方案。其原理在于：

在多重PCR步骤中，通过设计并使用合适的引物，从而能同时扩增多达10个SNP位点所在DNA片段。

在单碱基延伸步骤中，对上一步多重PCR的产物依次进行纯化和多重单碱基延伸。其中，延伸引物共10条，分别与10个SNP位点对应，并在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对（如某SNP位点处是A基因型，将在对应的延伸引物上延伸T核苷酸）。在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸。

在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在纯化后，点至含基质的靶片，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与它们的分子量呈负相关，即分子量越大，飞行速度越慢，到达检测器的时间越晚。

术语“rs80338939、rs74315319”等，均是人SNP位点在NCBI数据库的统一编号。术语“176del16、1494C>T”则是各位点的一些通俗叫法，其中：（1）176del16表示GJB2基因转录起始点下游176bp处，为16个碱基的缺失；（2）1494C>T表示线粒体12S rRNA转录起始点下游1494bp处，为C>T多态。

术语“保护碱基”，指在PCR引物的5'端额外增加的碱基。由于保护碱基的序列使得PCR引物（即核心引物）的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。此外，延伸引物的5'端也可以适量增加碱基序列，但其作用并非如同PCR引物的保护碱基，使其超出检测窗口，而是适当调整延伸引物的分子量，使延伸引物及其产物在检测窗口内处于一个合理的位置。例如，当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一个延伸引物增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距，以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清，从而提高检测效果。因此，增加碱基后的延伸引物及产物的分子量，一定不会超出检测窗口。上述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。

术语“碱性磷酸酶消化”，其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使dNTP的5'-P末端转换成5'-OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一步单碱基延伸的影响。

术语“外切酶ExoI消化”，其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA的dNTP之间3,5-磷酸二酯键，使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR反应后残余的PCR引物。由于外切酶可以将单链的PCR引物切除，并不会在检测窗口中出现，因此使用该外切酶时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

术语“单碱基延伸”，又被称之为微测序（mini sequence），指在体系中加入延伸引物和ddNTP，ddNTP与延伸引物的3'端连接形成延伸产物（即引物延伸了一个碱基），根据碱基互补配对原则，由SNP位点处基因型决定具体连接何种ddNTP，这个过程类似于PCR过程中dNTP根据互补链的碱基组成，逐个添加到PCR引物上。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基，不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅在SNP位点处连接一个ddNTP，而不能像PCR那样，不断的往下延伸，因此称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，测序引物连接dNTP后将继续延伸，只有连接ddNTP后，方终止延伸，因此测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物；单碱基延伸体系中加入只有ddNTP，延伸引物只能连接一个ddNTP，并终止延伸，因此单碱基延伸产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。

术语“检测产品”，指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品，包括：检测试剂、检测芯片（如基因芯片、液体芯片等）、检测载体，以及检测试剂盒等。

术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸，本技术方案共采用四种，它们之间存在分子量差异，如ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da（其中ddTTP是修饰后的分子量）。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的核苷酸，将形成分子量差异。通过质谱检测，可分辨出这种差异。例如，某SNP位点若是G/A多态，对应的延伸引物长度为20个碱基（分子量6153Da），当该SNP位点处是G基因型，延伸引物将延伸一个C核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量6400.2Da的延伸产物，当该SNP位点处是A基因型，延伸引物将延伸一个T核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量6480.1Da的延伸产物，两种产物之间存在80.1Da的分子量差异。即对该SNP位点而言，若使用此6153Da的延伸引物，G基因型将对应6400.2Da的质谱峰，A基因型将对应6480.1Da的质谱峰。在实际检测过程中，使用者可通过软件对6153Da、6400.2Da、6480.1Da三处进行观察：若6153Da处出现质谱峰，则是有部分或全部延伸引物没有与ddNTP结合；不论6153Da处是否出现质谱峰，若6400.2Da与6480.1Da处仅出现一处质谱峰，则该SNP位点的基因型为纯合型，并与质谱峰的位置对应，如前所述，6400.2Da的质谱峰对应G基因型，6480.1Da的质谱峰对应A基因型；若6400.2Da与6480.1Da两处质谱峰均出现，则该SNP位点的基因型为杂合型；若6400.2Da与6480.1Da两处质谱峰均未出现，则实验失败。

术语“纯化”，指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的PCR产物纯化有两种方式：一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离杂质，并回收相对较纯的PCR产物，可以认为是第一种纯化方式，该方式一般耗时，操作复杂，特别是样本量大时；碱性磷酸酶的作用是降解（亦称“消化”）dNTP，使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，可以认为是第二种纯化方式。应当指出的是，单独的外切酶ExoI不起纯化作用，当它与碱性磷酸酶混合使用时，其作用是预先将单链DNA（在反应完成后的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物）降解成dNTP，再由碱性磷酸酶使dNTP继续降解。由于PCR引物被降解，不会进入最后的质谱检测步骤，因此，如果计划纯化步骤中增加ExoI外切酶处理，那么无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外，在单碱基延伸步骤之前，由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温失活，其不会降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等，因此避免对后续实验产生影响。

术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。其中，在设计延伸引物时，对于不同的SNP位点，根据这些位点所在DNA区域的序列特点，以及SNP位点的基因型，可以设计出分子量不同的延伸引物和延伸产物，避免不同延伸引物及产物之间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对宽阔的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多个SNP位点的检测。

术语“SNP”基因型，指表示人基因组中单核苷酸多态性的类型。其中，在实际检查中，作为对照的用于检测的基因型既可来自于对照人基因组中，也可来自已克隆入质粒的载体工具，而后者具有可复制和保存便捷、来源稳定而受到实际使用者的欢迎。

附图说明

图1为实施例四中，对A1样本10个位点的检测结果；图2为实施例四中，对A2样本10个位点的检测结果；图3为实施例四中，对A3样本10个位点的检测结果；图4为实施例四中，对A4样本10个位点的检测结果；图5为实施例四中，对A5样本10个位点的检测结果；图6为实施例四中，对A6样本10个位点的检测结果；图7为实施例四中，对A7样本10个位点的检测结果；图8为实施例四中，对A8样本10个位点的检测结果；图9为实施例四中，对A9样本10个位点的检测结果；图10为实施例四中，对A10样本10个位点的检测结果；图11为实施例四中，对A1样本rs80338939位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、野生型（G）延伸产物、突变型（DEL，缺失）延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为GG纯合；

图12为实施例四中，对A1样本GJB2基因176del16的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、野生型（GCTGCAAGAACGTGTG）延伸产物、突变型（DEL，缺失）延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为野生型纯合；

图13为实施例四中，对A1样本rs80338943位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、突变型（DEL，缺失）延伸产物、野生型（C）延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为CC纯合；

图14为实施例四中，对A1样本rs111033204位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、野生型（AT）延伸产物、突变型（Del，缺失）延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为野生型纯合；

图15为实施例四中，对A1样本rs74315319位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、野生型（C）延伸产物、突变型（T）延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本CC纯合；

图16为实施例四中，对A1样本rs121908362位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、野生型（A）延伸产物、突变型（G）延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为AA纯合；

图17为实施例四中，对A1样本rs111033313位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、野生型（A）延伸产物、突变型（G）延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为AA纯合；

图18为实施例四中，对A1样本线粒体12S rRNA1494C>T位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、突变型（T）延伸产物、野生型（C）延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为CC纯合；

图19为实施例四中，对A1样本12S rRNA1555A>G位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、野生型（A）延伸产物、突变型（G）延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为AA纯合；

图20为实施例四中，对A1样本rs74315318位点的检测结果，从左至右三条虚线分别是延伸引物、野生型（G）延伸产物、突变型（A）延伸产物的理论峰值，检测结果显示该样本为GG纯合；

图21为对10个位点均为野生型的质粒B1-B10的检测结果，其中：峰1（5015.4）表示rs80338939位点野生型（G），峰2（5431.5）表示rs121908362位点未反应完的延伸引物SEQID No：26，峰3（5467.6）表示rs111033204位点野生型（AT），峰4（5702.7）表示rs121908362位点野生型（A），峰5（5779.8）表示rs74315319位点未反应完的延伸引物SEQ ID No：25，峰6（5837.8）表示rs80338943位点未反应完的延伸引物SEQ ID No：23，峰7（5932.9）表示GJB2176del16位点未反应完的延伸引物SEQ ID No：22，峰8（6026.9）表示rs74315319位点野生型（C），峰9（6125）表示rs80338943位点野生型（C），峰10（6204.1）表示GJB2176del16位点野生型（GCTGCAAGAACGTGTG），峰11（6400.2）表示rs74315318位点野生型（G），峰12（6787.5）表示mit12S rRNA1494C>T位点野生型（C），峰13（7062.6）表示mit12S rRNA1555A>G位点未反应完的延伸引物SEQ ID No：29，峰14（7333.8）表示rsmit12S rRNA1555A>G位点野生型（A），峰15（7888.1）表示rs111033313位点未反应完的延伸引物SEQ ID No：27，峰16（8159.4）表示rs111033313位点野生型（A）；

图22为对10个位点均为突变型的质粒C1-C10的检测结果，其中：峰1（5039.4）表示rs80338939位点突变型（DEL），峰2（5431.5）表示rs121908362位点未反应完的延伸引物SEQ ID No：26，峰3（5483.6）表示rs111033204位点突变型（DEL），峰4（5718.7）表示rs121908362位点突变型（G），峰5（5779.8）表示rs74315319位点未反应完的延伸引物SEQID No：25，峰6（5837.8）表示rs80338943位点未反应完的延伸引物SEQ ID No：23，峰7（5932.9）表示GJB2176del16位点未反应完的延伸引物SEQ ID No：22，峰8（6085）表示rs80338943位点突变型（DEL），峰9（6106.9）表示rs74315319位点突变型（T），峰10（6260）表示GJB2176del16位点突变型（DEL），峰11（6480.1）表示rs74315318位点突变型（A），峰12（6771.5）表示mit12S rRNA1494C>T位点突变型（T），峰13（7062.6）表示mit12S rRNA1555A>G位点未反应完的延伸引物SEQ ID No：29，峰14（7349.8）表示rsmit12S rRNA1555A>G位点突变型（G），峰15（7888.1）表示rs111033313位点未反应完的延伸引物SEQ ID No：27，峰16（8175.4）表示rs111033313位点突变型（G）；

图23为对照实施例一中，对A2样本rs80338939位点的测序结果，显示为G纯合。

图24为对照实施例一中，对A2样本GJB2基因176del16位点的测序结果，显示为GCTGCAAGAACGTGTG纯合。

图25为对照实施例一中，对A2样本rs80338943位点的测序结果，显示为C纯合。

图26为对照实施例一中，对A2样本rs111033204位点的测序结果，显示为AT。

图27为对照实施例一中，对A2样本rs74315319位点的测序结果，显示为C纯合。

图28为对照实施例一中，对A2样本rs121908362位点的测序结果，显示为A纯合。

图29为对照实施例一中，对A2样本rs111033313位点的测序结果，显示为A纯合。

图30为对照实施例一中，对A2样本12S rRNA1494C>T位点的测序结果，显示为C纯合。图31为对照实施例一中，对A2样本12S rRNA1555A>G位点的测序结果，显示为A纯合。图32为对照实施例一中，对A2样本rs74315318位点的测序结果，显示为G纯合。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例一：引物设计及合成。

针对GJB2基因rs80338939（35delG）、GJB2基因176del16、GJB2基因rs80338943（235delC）、GJB2基因rs111033204（299delAT）、GJB3基因rs74315319（538C>T）、GJB3基因rs74315318（547G>A）、SLC26A4基因rs121908362（2168A>G）、SLC26A4基因rs111033313（IVS7-2A>G）、mit12S rRNA1494C>T、mit12S rRNA1555A>G等10个与遗传性耳聋相关的基因多态位点设计对应特异性PCR引物核心序列（SEQ ID No：1至SEQ IDNo：20）和特异性延伸引物核心序列（SEQ ID No：21至SEQ ID No：30）。

其中，为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，每条PCR引物的5'端可以在核心序列（SEQ ID No：1至SEQ ID No：20）的基础上增加一定数目的碱基，常见如10bp的tag（ACGTTGGATG），以使PCR引物的分子量增大，从而超出质谱仪检测窗口。相关引物在生工生物工程（上海）有限公司进行合成。

实施例二：样本DNA提取。

收集耳聋患者共10例。其中，样本采集、DNA提取等按照说明书要求，采集人静脉血，并以EDTA抗凝管收集。按照说明书要求，采集的血液在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过一个月，并可采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输，建议尽量采用新鲜血液进行基因组DNA提取。由于本试剂盒不提供人基因组DNA提取试剂，因此采用商业化的核酸提取试剂盒（如QIAGEN公司的DNeasy Blood and Tissue kit），从每位患者的200ul全血中提取人基因组DNA，以NanoDrop2000（Thermo公司）定量，并标化至30ng/ul（分别为A1-A10）。其中，该试剂盒推荐对浓度为30ng/ul的人基因组DNA进行检测，但对比实验表明，本试剂盒对浓度低至10ng/ul的人基因组DNA也能检测出阳性结果。按照说明书要求，提取后的人基因组DNA，在2-8℃保存不应超过一周，-20℃保存不应超过两年，-80℃可长期保存，应避免反复冻融，并置于冰盒中进行运输。

实施例三：生物学实验。

使用ABI9700型PCR仪，按说明书对10个与遗传性耳聋相关的基因多态位点进行检验。

试剂盒中用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分为：

序号	组分名称	主要成分	规格
				1	PCR引物混合液	PCR引物	24ul/管xl管
2	PCR反应液	Taq酶、dNTP	72ul/管xl管
				3	酶切反应液	SAP酶	48ul/管xl管
4	延伸引物混合液	延亻申引物	24ul/管xl管
				5	延伸反应液	单碱基延伸酶、ddNTP	24u1/管xl管
6	阳性质控品	人基因组DNA(3Ong/ul)	10ul/管xl管

其中各引物对浓度均为500nmol/L。

按说明书，具体操作方法如下：

1．PCR扩增

1.1在PCR配液区，按照待检样品数（含阳性质控品、阴性对照、空白对照）准备200ulPCR反应管，并在管上标记样本编号；

1.2从试剂盒中取出PCR引物混合液、PCR反应液，使其自然解冻，涡旋振荡使其充分混匀，瞬时离心至管底；

1.3根据样本数目，按下表的比例取出PCR引物混合液和PCR反应液，置于一个离心管中混匀，按每PCR反应管加入4ul混合物进行分装。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份待测样品时，可按10.5-11份样品配制混合物。

组分名称	单反应积
		PCR引物混合液	1ul
PCR反应液	3ul
		合计	4ul

1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入1ul待测样品，使每份PCR反应体系总体积为5ul。其中，阴性对照为纯化水，空白对照为不加模板。

1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行PCR扩增反应。

2．SAP酶消化

在PCR反应管中加入2ul酶切反应液，然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行下表程序。

温度	时间(分)	循环数
			37	45	1
85	15	1

3．延伸

3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸反应液，置于一个离心管中混匀。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份酶切产物时，可按10.5-11份样品配制混合物。

组分名称	单反应积
		延伸引物混合液	1ul
延伸反应液	1ul
		合计	2ul

3.2在PCR扩增区，按每管酶切产物加入2ul混合物进行分装。

3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行延伸反应。

4．纯化

在PCR扩增区向每管延伸产物中加入16ul纯化水，6mg树脂，颠倒混匀30分钟。

5．点样

使用微量移液器，吸取1ul纯化产物，点样至靶片。

实施例四：上机检测及结果判读。

使用毅新兴业（北京）科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。

另外，分别设置以上位点的野生型对照B1-B10、突变型对照C1-C10。其中，野生型对照B1-B10、突变型对照C1-C10分别来自市售或实验室保藏的人工质粒。本发明中所用的野生型对照质粒B1-B10和突变型对照质粒C1-C10，为在商品化质粒pMD18-T Vector（Takara公司）的基础上，根据《分子克隆》记载的常规方法，用引物和正常人DNA进行PCR后，将PCR产物插入pMD18-T Vector，即构建野生型质粒B1-B10，再分别定点突变，即构建10个突变型质粒C1-C10。所述质粒B1-B10和C1-C10可长期保存于-20℃甘油中，用时活

化并提取质粒DNA。

如前述表2所示，10条延伸引物及它们在10个基因多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量，这些分子量对应各自的质谱峰，若在某分子量处出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的物质（延伸引物或产物）：

判断标准：

（1）若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；

（2）若野生型或突变型对应的质谱峰仅出现一个，则判断为所出现质谱峰对应的基因型的纯合型；

（3）若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为杂合型。

质谱结果如图1-22所示，其中图21为10个SNP位点均为野生型的质粒B1-B10的质谱图，图22为10个SNP位点均为突变型的质粒C1-C10的质谱图。

以前述表2所示各位点延伸引物及延伸产物的分子量检查样本A1-A10的质谱结果（图1-10），确定各SNP位点的基因型，结果如表3所示：

表3

注：GJB276del16表示其突变为16个碱基的缺失。

对照实施例一

一、根据实施例1，使用以下如表4所示引物，对各位点进行测序：

表4

二、样本DNA来源

为使不同实验之间产生的数据具有可比性，测序验证采用实施例二中从10例待检者体内采集的静脉血中提取的人基因组DNA（A1-A10）。三、测序鉴定

1、PCR反应体系为25μl

用ddHO补齐。

2、反应条件：反应在ABI公司9700热循环仪上进行，反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环，反应结束后再72℃延伸7分钟，4℃保存。

3、PCR产物纯化和测序

(1)向装有PCR产物的96孔板中加入50微升洗涤缓冲液，混匀。

(2)将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。

(3)向纯化板中再次加入50微升的洗涤缓冲液，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。

(4)将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20微升的去离子水，静置15分钟。

(5)再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。

测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。

(6)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。

(7)测序反应体系为5μl，各种试剂加入量如下：PCR产物3-10ng，BigDyev3.10.25μl，5*BigDye buffer0.875μl，引物1.6pmol；

(8)样品放于PCR仪上做如下反应：

步骤：95℃，5分；

95℃，10秒；60℃，4分；重复30个循环；

4℃保持直到准备纯化。

(9)在每个孔中加入20μl80％乙醇，4,000rpm离心30min；

(10)将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率1000rpm；

(11)在每孔中加入30μl70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；

(12)重复第11步的操作2次；

(13)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；

(14)加人5μl甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；

(15)测序仪前95℃变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。

(16)使用ABI3730xl型遗传分析仪进行序列测定

四、结果

对A1-A10样本，使用上表所述的引物，分别对rs80338939、GJB2基因176del16、rs80338943、rs111033204、rs74315319、rs74315318、rs121908362、mit12S rRNA1494C>T、mit12S rRNA1555A>G、rs111033313（分别编号序列1-10）测序，共计100次测序。根据测序的附图23-32，最终测序结果如表5所示：

表5

经过比较，表3的结果与表5完全一致，说明本发明检测方法的准确性。

Claims (10)

1.一种检测10处与遗传性耳聋相关的基因多态位点的引物系统，其序列为： 

。

2.权利要求1的引物系统，其中PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护5-15个碱基序列，优选为10bp的tag：ACGTTGGATG。 

3.权利要求1的引物系统，其中延伸引物5'端可增加作为接头的碱基序列，其中优选为1-15个碱基，更优选1-3个碱基。 

4.由权利要求1至3的引物系统所制备的用于检测遗传性耳聋相关基因多态位点的检测产品。 

5.权利要求4的检测产品，其中产品为检测试剂盒，包括： 

（1）用于PCR的反应试剂，包括：特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液； 

（2）用于PCR产物纯化的试剂； 

（3）用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。 

6.权利要求5的检测产品，其中试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，人基因组DNA提取试剂等试剂。 

7.权利要求5的检测产品，其中用于PCR产物纯化的试剂选自碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。 

8.权利要求7的产品，其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。 

9.使用权利要求1-3的引物，或权利要求4-8的产品来检测遗传性耳聋相关基因多态位点的方法，包括： 

（1）多重PCR：使用特异性的PCR引物，在一个反应体系中，对10处与遗传性耳聋相关的基因多态位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含10处基因多态位点所在DNA区域的PCR产物； 

（2）PCR产物纯化：对步骤（1）得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；（3）单碱基延伸：使用10条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤（2）得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对； 

（4）延伸产物纯化：对步骤（3）得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响； 

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行进行检测； 

其中，所述10个与遗传性耳聋相关的基因多态位点分别是：GJB2基因rs80338939（35delG）、GJB2基因176del16、GJB2基因rs80338943（235delC）、GJB2基因rs111033204（299delAT）、GJB3基因rs74315319（538C>T）、GJB3基因rs74315318（547G>A）、SLC26A4基因rs121908362（2168A>G）、SLC26A4基因rs111033313（IVS7-2A>G）、mit12S rRNA1494C>T、mit12S rRNA1555A>G。 

10.权利要求9的方法，其中步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。 

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