CN106282335A - 一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒、检测方法 - Google Patents

一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒、检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106282335A
CN106282335A CN201610651209.3A CN201610651209A CN106282335A CN 106282335 A CN106282335 A CN 106282335A CN 201610651209 A CN201610651209 A CN 201610651209A CN 106282335 A CN106282335 A CN 106282335A
Authority
CN
China
Prior art keywords
minutes
primer
reaction
pcr
seconds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610651209.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106282335B (zh
Inventor
黄平
欧阳小峰
毛家丽
周宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Kingmed Medical Diagnostics Institute Co., Ltd.
Original Assignee
SICHUAN KINGMED DIAGNOSTICS CENTER CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SICHUAN KINGMED DIAGNOSTICS CENTER CO Ltd filed Critical SICHUAN KINGMED DIAGNOSTICS CENTER CO Ltd
Priority to CN201610651209.3A priority Critical patent/CN106282335B/zh
Publication of CN106282335A publication Critical patent/CN106282335A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106282335B publication Critical patent/CN106282335B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公布了一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒及其操作方法，包括，1）提取DNA模板，提取口腔上皮细胞的基因组DNA；2）PCR扩增反应，反应体系总体积为25uL，PCR反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60 ℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟；3）PCR产物纯化，反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟；4）DNA测序反应，使用DNA测序引物GCGTTTGGTCCTAGCCTTT，反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。本发明所述检测方法，准确度高，操作简单，有很大的市场推广应用价值。

Description

一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒、检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒、检测方法。
背景技术
目前我国每年新生聋儿2万-3万，其中50％是由遗传因素造成的。药物不良反应导致耳聋是新生儿先天性耳聋及成人后天性耳聋的主要原因。
药物性耳聋被破坏的不是外耳和中耳的声音传导系统，即非传导性耳聋，而是感知声音最重要又最脆弱的部位耳蜗毛细胞遭到药毒损害。毛细胞是听觉神经的末梢感受器，正常情况下毛细胞把声能转化成生物电冲动传给听觉神经输入大脑中枢，人才能听到外界的各种声音。耳毒性药物专门伤害毛细胞，让人感受不到外界的声音。这种耳聋属于“感音神经性耳聋”，是不可逆的。
大剂量的氨基糖苷类抗生素具有一定的耳毒性，能导致前庭功能受损，从而使得听力减退，甚至耳聋。然而在氨基糖苷类抗生素引发的耳聋患者中，有些患者对毒性特别敏感，小剂量甚至单次剂量的药物就可能导致耳聋，存在个体差异。一般来讲，这类药物在正常剂量下使用是比较安全的，但是有些病人对该类药物具有家族遗传易感性和个体差异，在使用中即使很小剂量、短疗程、正常途径，也可能出现早期或严重的耳毒性反应。药物性耳聋可以发生在各年龄，但少儿更易发生。因此，在使用氨基糖苷类抗生素之前对用药对象进行药物敏感性筛选，提高合理用药，减少滥用听力损害药物是降低我国目前少儿听力残疾的有效途径。
对母系遗传性耳聋大家系研究表明，线粒体脱氧核糖核酸12SrRNA基因A1555G基因突变与家族性致聋有关，进一步的常染色体全基因组扫描研究发现，45个阳性位点可作为家族系连锁分析的候选位点，表明除线粒体突变外，核基因组中多个基因位点可能与耳聋有关，所以母系遗传性耳聋是多基因决定的，线粒体突变、阳性核基因及不同的环境因素的影响将导致不同的表型。大量家系研究表明线粒体DNA的MTRNR1基因上的A1555G，U1494A，T1095C，961T缺失位点与药物性耳聋有密切关系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒、检测方法，可用于检测评估少儿耳聋性遗传风险。
本发明的通过下述技术方案实现：
一种检测少儿耳聋遗传风险的引物，包括检测MTNR1基因上的A1555G、U1494A，T1095C三个SNP位点的特异性引物为：GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC和GCATCTTTCCCTTGCGGTAC；检测MTNR1基因上的A1555G、U1494A，T1095C三个SNP位点、DEL961T CINS位点的DNA测序引物，DNA测序引物为GCGTTTGGTCCTAGCCTTT。
一种检测少儿耳聋遗传风险的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应套装、PCR产物纯化套装、测序反应套装，所述PCR反应套装由以下组分组成，2.5uL 10X PCR反应缓冲液，0.2uL25mM dNTP混合液，25mM MgCl2溶液1.5ul，0.125ul 5units/ul Taq DNA聚合酶，20uM特异性引物0.25uL，去离子水19.175ul；所述PCR产物纯化套装：1uints/ulSAP酶0.75ul，10uints/ul Exo酶0.375ul，去离子水3.875ul；所述测序反应套装：25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，125mM EDTA溶液1μl，100％乙醇溶液15μl，70％乙醇溶液30μl，HIDI溶液8μl，去离子水2μl。
一种检测少儿耳聋遗传风险的测试方法，其特征在于：包括以下步骤，
（1）提取DNA模板
提取口腔上皮细胞的基因组DNA；
（2）PCR扩增反应
反应体系总体积为25uL，12.5ng/ul DNA模板1uL、10X PCR反应缓冲液2.5 uL，25mMdNTP混合液0.2 uL，25mM MgCl2溶液1.5 uL，5units/ uL Taq DNA聚合酶0.125 uL，20μM特异性引物各0.25 uL，去离子水19.175 Ul；
PCR反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60 ℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟；
（3）PCR产物纯化
反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟；
（4）DNA测序反应
使用DNA测序引物GCGTTTGGTCCTAGCCTTT，反应体系为总体积5 uL，包含PCR纯化产物1uL，25％BigDye mix 1 uL，3.2μM DNA测序引物1 uL， 去离子水2 uL，
反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、 30秒，60℃、4分钟，
反应结束后加入125mM EDTA溶液1 uL和100％乙醇溶液15 uL，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650 转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，以3650转/分的转速离心15分钟，轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明所述检测少儿耳聋遗传风险，利用线粒体DNA的MTRNR1基因上通过国家生物基因检测技术应用评估中心认定的A1555G、U1494A、T1095C三个SNP位点和DEL 961TCIN位点，用于检测评估少儿药物性耳聋易感染遗传风险。整个操作方法简单、检测快速，准确性高。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
一种检测少儿耳聋遗传风险的测试方法，包括以下步骤，
（1）提取DNA模板
提取口腔上皮细胞的基因组DNA；
（2）PCR扩增反应
反应体系总体积为25uL，12.5ng/ul DNA模板1uL、10X PCR反应缓冲液2.5 uL，25mMdNTP混合液0.2 uL，25mM MgCl2溶液1.5 uL，5units/ uL Taq DNA聚合酶0.125 uL，20μM特异性引物各0.25 uL，去离子水19.175 Ul；
PCR反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60 ℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟；
（3）PCR产物纯化
反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟；
（4）DNA测序反应
使用DNA测序引物GCGTTTGGTCCTAGCCTTT，反应体系为总体积5 uL，包含PCR纯化产物1uL，25％BigDye mix 1 uL，3.2μM DNA测序引物1 uL， 去离子水2 uL，
反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、 30秒，60℃、4分钟，
反应结束后加入125mM EDTA溶液1 uL和100％乙醇溶液15 uL，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650 转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，以3650转/分的转速离心15分钟， 轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种检测少儿耳聋遗传风险的引物，其特征在于：包括检测MTNR1基因上的A1555G、U1494A，T1095C三个SNP位点的特异性引物为：GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC和GCATCTTTCCCTTGCGGTAC；检测MTNR1基因上的A1555G、U1494A，T1095C三个SNP位点、DEL961TCINS位点的DNA测序引物，DNA测序引物为GCGTTTGGTCCTAGCCTTT。
2.一种检测少儿耳聋遗传风险的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括PCR反应套装、PCR产物纯化套装、测序反应套装，所述PCR反应套装由以下组分组成，2.5uL 10X PCR反应缓冲液，0.2uL25mM dNTP混合液，25mM MgCl2溶液1.5ul，0.125ul 5units/ul Taq DNA聚合酶，20uM特异性引物0.25uL，去离子水19.175ul；所述PCR产物纯化套装：1uints/ulSAP酶0.75ul，10uints/ul Exo酶0.375ul，去离子水3.875ul；所述测序反应套装：25％BigDyemix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，125mM EDTA溶液1μl，100％乙醇溶液15μl，70％乙醇溶液30μl，HIDI溶液8μl，去离子水2μl。
3.一种检测少儿耳聋遗传风险的测试方法，其特征在于：包括以下步骤，
（1）提取DNA模板
提取口腔上皮细胞的基因组DNA；
（2）PCR扩增反应
反应体系总体积为25uL，12.5ng/ul DNA模板1uL、10X PCR反应缓冲液2.5 uL，25mMdNTP混合液0.2 uL，25mM MgCl2溶液1.5 uL，5units/ uL Taq DNA聚合酶0.125 uL，20μM特异性引物各0.25 uL，去离子水19.175 Ul；
PCR反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60 ℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟；
（3）PCR产物纯化
反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟；
（4）DNA测序反应
使用DNA测序引物GCGTTTGGTCCTAGCCTTT，反应体系为总体积5 uL，包含PCR纯化产物1uL，25％BigDye mix 1 uL，3.2μM DNA测序引物1 uL， 去离子水2 uL，
反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、 30秒，60℃、4分钟，
反应结束后加入125mM EDTA溶液1 uL和100％乙醇溶液15 uL，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650 转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，以3650转/分的转速离心15分钟， 轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。
CN201610651209.3A 2016-08-10 2016-08-10 一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒、检测方法 Active CN106282335B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610651209.3A CN106282335B (zh) 2016-08-10 2016-08-10 一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒、检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610651209.3A CN106282335B (zh) 2016-08-10 2016-08-10 一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒、检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106282335A true CN106282335A (zh) 2017-01-04
CN106282335B CN106282335B (zh) 2017-08-08

Family

ID=57667629

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610651209.3A Active CN106282335B (zh) 2016-08-10 2016-08-10 一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒、检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106282335B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105400874A (zh) * 2015-12-02 2016-03-16 深圳市宝安区妇幼保健院 线粒体12S rRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒
CN107881229A (zh) * 2017-12-26 2018-04-06 武汉艾迪康医学检验所有限公司 一种线粒体相关药物性耳聋基因突变检测的引物和方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101560547A (zh) * 2008-07-08 2009-10-21 上海中优医药高科技有限公司 一种用于个体氨基糖苷类药物致聋致残筛查的方法
CN102787169A (zh) * 2012-08-22 2012-11-21 郭丽敏 一种应用于检测线粒体 dna a1555g、c1494t 突变的混合液及试剂盒和检测系统
CN102925562A (zh) * 2012-10-17 2013-02-13 亚能生物技术（深圳）有限公司 氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测试剂盒及方法
CN103352073A (zh) * 2013-05-14 2013-10-16 向华 用于检测与遗传性耳聋相关的基因snp的引物系统及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101560547A (zh) * 2008-07-08 2009-10-21 上海中优医药高科技有限公司 一种用于个体氨基糖苷类药物致聋致残筛查的方法
CN102787169A (zh) * 2012-08-22 2012-11-21 郭丽敏 一种应用于检测线粒体 dna a1555g、c1494t 突变的混合液及试剂盒和检测系统
CN102925562A (zh) * 2012-10-17 2013-02-13 亚能生物技术（深圳）有限公司 氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测试剂盒及方法
CN103352073A (zh) * 2013-05-14 2013-10-16 向华 用于检测与遗传性耳聋相关的基因snp的引物系统及其用途

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105400874A (zh) * 2015-12-02 2016-03-16 深圳市宝安区妇幼保健院 线粒体12S rRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒
CN105400874B (zh) * 2015-12-02 2018-08-21 深圳市宝安区妇幼保健院 线粒体12S rRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒
CN107881229A (zh) * 2017-12-26 2018-04-06 武汉艾迪康医学检验所有限公司 一种线粒体相关药物性耳聋基因突变检测的引物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106282335B (zh) 2017-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lupetti et al. Horizontal transmission of Candida parapsilosis candidemia in a neonatal intensive care unit
Bar et al. Wide variation in the multiplicity of HIV-1 infection among injection drug users
Samaddar et al. The enigma of low COVID-19 fatality rate in India
Feng et al. Identification of a novel HIV Type 1 circulating recombinant form (CRF65_cpx) composed of CRF01_AE and subtypes B and C in Western Yunnan, China
An et al. Reconstituting the epidemic history of HIV strain CRF01_AE among men who have sex with men (MSM) in Liaoning, northeastern China: implications for the expanding epidemic among MSM in China
Han et al. A large-scale survey of CRF55_01B from men-who-have-sex-with-men in China: implying the evolutionary history and public health impact
Lawrance et al. Molecular evolution of fibropapilloma-associated herpesviruses infecting juvenile green and loggerhead sea turtles
Cantaloube et al. Genotype distribution and molecular epidemiology of hepatitis C virus in blood donors from southeast France
Abalain et al. Fatal congenital tuberculosis due to a Beijing strain in a premature neonate
CN106282335A (zh) 一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒、检测方法
Balakrishnan et al. Complete genome sequence of West Nile virus isolated from Alappuzha district, Kerala, India
Kerr et al. Punctuated evolution of myxoma virus: rapid and disjunct evolution of a recent viral lineage in Australia
Du et al. StIL-17 gene polymorphisms in the development of pulmonary tuberculosis
Hadzic et al. The effect of psychoactive substances (drugs) on the presence and frequency of oral Candida species and Candida dubliniensis
Gu et al. Recombinant BA. 1/BA. 2 SARS-CoV-2 virus in arriving travelers, Hong Kong, february 2022
Gray et al. Unexpected maintenance of hepatitis C viral diversity following liver transplantation
Zeng et al. The epidemic dynamics of four major lineages of HIV-1 CRF01_AE strains after their introduction into China
Xu et al. As the SARS-CoV-2 virus evolves, should Omicron subvariant BA. 2 be subjected to quarantine, or should we learn to live with it?
Taklual et al. Effect of human pegivirus route of transmission on the genetic distribution of the virus: an institution based cross-sectional study
Zhang et al. Phylodynamic analysis revealed that epidemic of CRF07_BC strain in men who have sex with men drove its second spreading wave in China
CN101240319A (zh) 一种检测少儿药物性耳聋遗传风险的试剂盒
Filipe et al. Comparison of tissue tropism and host response to enteric and respiratory enteroviruses
Li et al. The evolutionary and transmission characteristic of HIV‐1 CRF07_BC in Nanjing, Jiangsu
Kerdemelidis et al. Guidelines for sore throat management in New Zealand
Bourgeois et al. X‐chromosome lineages and the settlement of the Americas

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20170621

Address after: 200120, No. 6, building 3377, Kang Xin Road, Shanghai, Pudong New Area

Applicant after: Shanghai Kingmed Medical Diagnostics Institute Co., Ltd.

Address before: 610000 Sichuan city of Chengdu province Chenghua District Longtan Industrial base headquarters into relief road No. 1

Applicant before: Sichuan Kingmed Diagnostics Center Co., Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant