CN101240319A - 一种检测少儿药物性耳聋遗传风险的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测少儿药物性耳聋遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测MTRNR1基因上的四个位点多态性的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与少儿药物性耳聋遗传风险密切相关的MTRNR1基因上的四个位点多态性基因型来评估少儿药物性耳聋遗传风险。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测少儿药物性耳聋遗传风险的试剂盒，通过同时检测MTRNR1基因上的四个位点多态性基因型来评估少儿药物性耳聋遗传风险。
背景技术
目前我国每年新生聋儿2万-3万，其中50％是由遗传因素造成的。药物不良反应导致耳聋是新生儿先天性耳聋及成人后天性耳聋的主要原因。
药物性耳聋被破坏的不是外耳和中耳的声音传导系统，即非传导性耳聋，而是感知声音最重要又最脆弱的部位耳蜗毛细胞遭到药毒损害。毛细胞是听觉神经的末梢感受器，正常情况下毛细胞把声能转化成生物电冲动传给听觉神经输入大脑中枢，人才能听到外界的各种声音。耳毒性药物专门伤害毛细胞，让人感受不到外界的声音。这种耳聋属于“感音神经性耳聋”，是不可逆的。
大剂量的氨基糖苷类抗生素具有一定的耳毒性，能导致前庭功能受损，从而使得听力减退，甚至耳聋。然而在氨基糖苷类抗生素引发的耳聋患者中，有些患者对毒性特别敏感，小剂量甚至单次剂量的药物就可能导致耳聋，存在个体差异。一般来讲，这类药物在正常剂量下使用是比较安全的，但是有些病人对该类药物具有家族遗传易感性和个体差异，在使用中即使很小剂量、短疗程、正常途径，也可能出现早期或严重的耳毒性反应。药物性耳聋可以发生在各年龄，但少儿更易发生。因此，在使用氨基糖苷类抗生素之前对用药对象进行药物敏感性筛选，提高合理用药，减少滥用听力损害药物是降低我国目前少儿听力残疾的有效途径。
对母系遗传性耳聋大家系研究表明，线粒体脱氧核糖核酸12SrRNA基因A1555G基因突变与家族性致聋有关，进一步的常染色体全基因组扫描研究发现，45个阳性位点可作为家族系连锁分析的候选位点，表明除线粒体突变外，核基因组中多个基因位点可能与耳聋有关，所以母系遗传性耳聋是多基因决定的，线粒体突变、阳性核基因及不同的环境因素的影响将导致不同的表型。大量家系研究表明线粒体DNA的MTRNR1基因上的A1555G，U1494A，T1095C，961T缺失位点与药物性耳聋有密切关系。
发明内容
根据国家生物基因检测技术应用评估认证中心颁布的《中国人口健康服务基因位点认证规程》，对与少儿药物性耳聋易感相关基因位点的支持文献、分子生物学机理研究、中国人群适用性等进行综合分析评估后，MTRNR1基因上的A1555G、U1494A、T1095C这三个SNP位点和DEL 961T CINS位点通过国家生物基因检测技术应用评估认证中心认定，可用于检测评估少儿药物性耳聋易感遗传风险。
基于MTRNR1基因上A1555G、U1494A、T1095C这三个SNP位点和DEL 961T CINS位点多态性可用来评估个体少儿药物性耳聋易感遗传风险的基础上，本发明提供一种检测少儿药物性耳聋易感遗传风险的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测MTRNR1基因上A1555G、U1494A、T1095C这三个SNP位点和DEL 961T CINS位点多态性基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、Exo I酶、去离子水等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去离子水等)。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对MTRNR1基因上A1555G、U1494A、T1095C这三个SNP位点和DEL 961T CINS位点，能特异性扩增出包含这4个位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：1和2所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这对引物。
本试剂盒中所述的DNA测序引物是指针对MTRNR1基因上A1555G、U1494A、T1095C这三个SNP位点和DEL 961T CINS位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出这4个位点基因型的DNA测序引物。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：3所示序列的DNA测序引物。DNA测序引物可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的DNA测序引物不限于这条引物，所有可用于DNA测序技术检测本发明中所述的4个位点多态性的DNA测序引物均在本发明范围内。
本发明试剂盒的组分和含量包括：
1.PCR反应套装
10X PCR反应缓冲液2.5μl，
25mM dNTP混合液0.2μl，
25mM MgCl2溶液1.5μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，
20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，
去离子水19.175μl。
2.PCR产物纯化套装
1units/μl SAP酶0.75μl，
10units/μl ExoI酶0.375μl，
去离子水3.875μl。
3.测序反应套装
25％BigDye mix 1μl，
3.2μM DNA测序引物1μl，
125mM EDTA溶液1μl，
100％乙醇溶液15μl，
70％乙醇溶液30μl，
HIDI溶液8μl，
去离子水2μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1.检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2：PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应套装，其中，含有下列引物对：
有义引物1：5’-GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC-3’(SEQ ID NO：1)
反义引物1：5’-GCATCTTTCCCTTGCGGTAC-3’(SEQ ID NO：2)
反应的体系为总体积25μl，包含浓度为12.5ng/μl的DNA模板1μl、10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mMdNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟。
步骤3：PCR产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化套装，反应体系为总体积25μl，包含PCR产物2μl，lunits/μl SAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟。
步骤4：DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应套装，其中，含有下列DNA测序引物：
DNA测序引物：5’-GCGTTTGGTCCTAGCCTTT-3’(SEQ ID NO：3)
反应的体系为总体积5μl，包含PCR纯化产物1μl，25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，去离子水2μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。
反应结束后加入125mM EDTA溶液1μl和100％乙醇溶液15μl，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，以3650转/分的转速离心15分钟，轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。
步骤5：基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测位点的基因型。
实施例2.进行少儿药物性耳聋易感遗传风险检测的服务
步骤1：DNA提取
由医院检验科医师指导被检少儿使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
步骤2：基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测少儿基因组DNA的MTRNR1基因上A1555G、U1494A、T1095C这三个SNP位点和DEL 961T CINS位点多态性进行DNA测序检测，确定这4个位点的多态性基因型。
步骤3：少儿药物性耳聋易感遗传风险的分析
通过对被检测者位点多态性基因型的分析，出具少儿药物性耳聋易感遗传风险的分析报告单。报告中详细说明了被检测少儿药物性耳聋易感遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读少儿药物性耳聋易感遗传风险分析报告单。
序列表
<110>上海主健生物工程有限公司
<120>一种检测少儿药物性耳聋遗传风险的试剂盒
<160>3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
GCGTTTGGTC CTAGCCTTTC 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
GCATCTTTCC CTTGCGGTAC 20
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
GCGTTTGGTC CTAGCCTTT 19
Claims (6)
1. 一种检测少儿药物性耳聋遗传风险的试剂盒，其特征在于：包括检测MTRNR1基因上的A1555G、U1494A、T1095C这三个SNP位点和DEL 961T CINS位点的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、SAP酶、Exo I酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去离子水等。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是指针对MTRNR1基因上的A1555G、U1494A、T1095C这三个SNP位点和DEL 961T CINS位点，能特异性扩增出包含这4个位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的DNA测序引物是指针对MTRNR1基因上的A1555G、U1494A、T1095C这三个SNP位点和DEL 961T CINS位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出这4个位点基因型的DNA测序引物。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO：1和2所示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的DNA测序引物选自具有SEQ ID NO：3所示序列的引物。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括：
1)PCR反应套装：10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mM dNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
2)PCR产物纯化套装：1units/μlSAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
3)测序反应套装：25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，125mM EDTA溶液1μl，100％乙醇溶液15μl，70％乙醇溶液30μl，HIDI溶液8μl，去离子水2μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102154481A (zh) * | 2011-02-11 | 2011-08-17 | 智海生物工程（北京）有限公司 | 一种线粒体突变检测方法及试剂盒 |
| CN103642921A (zh) * | 2013-12-09 | 2014-03-19 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 过氧化氢酶基因标签单核苷酸多态性位点的挑选、检测及其应用 |
| CN105400874A (zh) * | 2015-12-02 | 2016-03-16 | 深圳市宝安区妇幼保健院 | 线粒体12S rRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒 |
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2007
- 2007-02-06 CN CNA2007100371694A patent/CN101240319A/zh active Pending
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