CN101240318A - 一种检测老年性痴呆易感遗传风险的试剂盒 - Google Patents
一种检测老年性痴呆易感遗传风险的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测个体老年性痴呆易感遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与老年性痴呆易感遗传密切相关的APOE基因上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体老年性痴呆易感遗传风险。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测老年性痴呆易感遗传风险的试剂盒，通过同时检测APOE基因上的两个单核苷酸多态性位点基因型来评估个体老年性痴呆易感遗传风险。
背景技术
老年痴呆是指老年期出现的已获得的智能在本质上出现持续的损害，也就是由器质性脑损害导致的基本上不可逆的智能缺失和社会适应能力降低。
主要表现为：在智能方面出现抽象思维能力丧失、推理判断与计划不足、注意力缺失；在人格方面出现兴趣与始动性丧失、迟钝或难以抑制、社会行为不端、不拘小节；在记忆方面出现遗忘，地形、视觉与空间定向力差；在言语认知方面出现说话不流利，综合能力缺失。
欧美国家的统计表明，60岁以上老年人6％～12％发生痴呆，85岁以上的老人则有20％～40％发生痴呆，其中半数以上为老年性痴呆。据统计，全球有超过2000万的人患有老年性痴呆。调查结果表明，我国北方地区65岁以上居民痴呆患病率为6.9％，其中老年性痴呆为4.2％。我国南方地区65岁以上居民痴呆患病率为3.9％，其中老年性痴呆为2.8％。估计我国现有痴呆的老年患者超过400万，其中老年性痴呆约占1/3。2000年我国60岁以上的人口达1.3亿，占人口总数的10％；到2020年将达到2.3亿，占人口总数的20％以上。老年人口的不断增加使老年性痴呆患者的人数大幅度上升。据预测到2030年，全球患老年痴呆的人数将达到6000万，仅我国就将有1200万。
已知APOE基因与老年性痴呆有密切关系。
APOE是一种含299个氨基酸残基的分泌性糖蛋白，它存在于多种脂蛋白的颗粒中，是参与胆固醇代谢的重要血清脂蛋白。该基因定位于19号染色体上，分别由3种等位基因ε2、ε3、ε4编码，并组合产生6种基因型，即ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε2/3、ε2/4、ε3/4，相对应的6种遗传表型为E2/2、E3/3、E4/4、E2/3、E2/4、E3/4。正常人群中APOE基因型以ε3/3最多，APOE基因的多态性是由APOE基因的112和158密码子的单个碱基变异所致。
APOE不能通过血脑屏障，但在脑内可以由星形细胞合成。目前认为ε4是AD的危险因子，有人用实验对照组相关研究发现APOEε4等位基因在AD患者中过量表达，而大量其他的实验研究也相继证实了这点。大约80％迟发型家族性AD和64％散在性AD患者至少携带一个ε4等位基因，而对照组仅为31％。遗传连锁和相关研究也显示APOEε4可使患AD的危险性增加，且呈剂量依赖关系。APOEε4纯合子发病比杂合子早。相反AD患者中APOEε2减少，说明APOEε2在SAD中起保护作用。
在一个著名的美国晚发阿尔森海默氏症的家族中(该家族的祖先是一对18世纪从法国移民到美国的夫妻)，Brogaonkar13发现了在6个感染个体上E4亚型的剂量效应。4个E4/E4个体在60多岁即开始发病，而2个E4/E3个体发病年龄分别是77岁和78岁。YadongHong的综述中提到带有两个E4拷贝的个体在85岁前AD发病的概率为50-90％，有一个E4拷贝的个体AD发病的概率为45％，相应的一般人群在85岁前AD发病的概率为20％。
Talbot等人15发现E2亚型对阿尔森海默氏症具有保护作用，而且其作用不是单纯的因为可以代替E4亚型。Corder等人16在美国人群中研究也发现了E4的剂量效应的同时发现了E2的保护作用。并且发现虽然65％的AD病人是由E4的存在导致的，且在E2/E3的个体中AD发生率非常少，但同时还发现了有23％的病人是由于E2的缺失而造成。
Bickeboller等人23在法国417例病人和1030例正常对照人群中的研究中确认了APOE4与AD发病的相关性，发现APOE4亚型对APOE3的发病危险度为2.7，而APOE2则具有保护作用，OR为0.5。此外E4的剂量效应也得到了证明。与E3纯合子相比，E4纯合子的OR为11.2，而E4杂合子的OR为2.2。
Oh Yong Bang等人针对AD病人的apoE基因型，进行Meta分析。在东亚人群中抽取AD病人1470例，对照组2247例，其结果为病例组，含有E4等位基因26.8％，对照组含有E4等位基因9.2％。结果显示老年痴呆和E4等位基因显著相关。
发明内容
根据国家生物基因检测技术应用评估认证中心颁布的《中国人口健康服务基因位点认证规程》，对与老年型痴呆易感相关基因位点的支持文献、分子生物学机理研究、中国人群适用性等进行综合分析评估后，APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点通过国家生物基因检测技术应用评估认证中心认定，可用于检测评估老年性痴呆易感遗传风险。
基于APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点多态性可用来评估个体老年性痴呆易感遗传风险的基础上，本发明提供一种检测个体老年性痴呆易感遗传风险的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测APOE基因上rs429358号与rs7412号SNP多态性基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、Exo I酶、去离子水等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去离子水等)。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点，能特异性扩增出包含这2个SNPs位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：1和2所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这对引物。
本试剂盒中所述的DNA测序引物是指针对APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出这2个SNPs位点基因型的DNA测序引物。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：3所示序列的DNA测序引物。DNA测序引物可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的DNA测序引物不限于这条引物，所有可用于DNA测序技术检测本发明中所述用来评估个体老年性痴呆易感遗传风险的2个SNPs位点的DNA测序引物均在本发明范围内。
本发明试剂盒的组分和含量包括：
1.PCR反应套装
10X PCR反应缓冲液2.5μl，
25mM dNTP混合液0.2μl，
25mM MgCl2溶液1.5μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，
20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，
去离子水19.175μl。
2.PCR产物纯化套装
1units/μl SAP酶0.75μl，
10units/μl ExoI酶0.375μl，
去离子水3.875μl。
3.测序反应套装
25％BigDye mix 1μl，
3.2μM DNA测序引物1μl，
125mM EDTA溶液1μl，
100％乙醇溶液15μl，
70％乙醇溶液30μl，
HIDI溶液8μl，
去离子水2μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1.检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2：PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应套装，其中，含有下列引物对：
有义引物1：5’-TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGGA-3’(SEQ ID NO：1)
反义引物1：5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’(SEQ ID NO：2)
反应的体系为总体积25μl，包含浓度为12.5ng/μl的DNA模板1μl、10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mMdNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟。
步骤3：PCR产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化套装，反应体系为总体积25μl，包含PCR产物20μl，1units/μl SAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟。
步骤4：DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应套装，其中，含有下列DNA测序引物：
DNA测序引物：5’-TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGG-3’(SEQ ID NO：3)
反应的体系为总体积5μl，包含PCR纯化产物1μl，25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，去离子水2μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。
反应结束后加入125mM EDTA溶液1μl和100％乙醇溶液15μl，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，以3650转/分的转速离心15分钟，轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。
步骤5：基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.对人们进行个体老年性痴呆易感遗传风险检测的服务
步骤1：DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
步骤2：基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点进行DNA测序检测，确定这2个SNPs位点的基因型。
步骤3：个体老年性痴呆易感遗传风险的分析
通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具个体老年性痴呆易感遗传风险的分析报告单。报告中详细说明了被检测者老年性痴呆易感遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体老年性痴呆易感遗传风险分析报告单。
序列表
<110>上海主健生物工程有限公司
<120>一种检测老年性痴呆易感遗传风险的试剂盒
<160>3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGGA 24
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
ACAGAATTCG CCCCGGCCTG GTACAC 26
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGG 23
Claims (6)
1. 一种检测个体老年性痴呆易感遗传风险的试剂盒，其特征在于：包括检测APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、SAP酶、Exo I酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去离子水等。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是指针对APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点，能特异性扩增出包含这2个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的DNA测序引物是指针对APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出这2个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO：1和2所示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的DNA测序引物选自具有SEQ ID NO：3所示序列的引物。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括：
1)PCR反应套装：10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mM dNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
2)PCR产物纯化套装：1units/μlSAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
3)测序反应套装：25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，125mM EDTA溶液1μl，100％乙醇溶液15μl，70％乙醇溶液30μl，HIDI溶液8μl，去离子水2μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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