CN109321658A

CN109321658A - 一种检测宫颈癌易感性的试剂盒

Info

Publication number: CN109321658A
Application number: CN201811406305.7A
Authority: CN
Inventors: 叶枫; 陈怀增; 王浛知; 程琪; 马俊彦; 陈晓静
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2038-11-23
Also published as: CN109321658B

Abstract

本发明公开了一种用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，属于分子生物学与生物医药技术领域。所述试剂盒中含有基于SMUG1基因单核苷酸多态性设计的特异性引物，SMUG1基因中的两个位点的单核苷酸多态性与宫颈癌易感性密切相关，即核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7所示的基因序列的第501位均存在单核苷酸多态性：A>G，即此序列的第501位的碱基包括碱基A和碱基G两种情况。利用PCR技术可以有效检测SMUG1基因中的单核苷酸多态性，进而鉴别宫颈癌易感性，这对于宫颈癌高危人群的筛选和易感个体的检测，对宫颈癌这个复杂性疾病进行早期预防、早期诊断和个性化防治具有重要的现实意义。

Description

一种检测宫颈癌易感性的试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记及其应用。

背景技术

宫颈癌是全世界妇女中第四常见的癌症，估计每年有529572例新诊断病例和274967例死亡。同时宫颈癌也是全世界妇女癌症相关死亡的第三大原因，而且发病率一直在升高。在中国，除了乳腺癌之外，宫颈癌已经成为女性最常见的癌症(98.9/100000)，死亡率高达30.5/100000，发病率也在上升。

高危型人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌发生的主要病因，然而，尽管大约80％的妇女一生中都可能HPV感染，但只有一小部分发展为恶性肿瘤。根据流行病学调查以及现代分子遗传学研究发现，这种现象必然和个体的遗传学背景有关，不同遗传学背景的个体对宫颈癌的易感性是完全不同的。而且宫颈癌的发病从HPV感染到细胞恶性转化，最后到最终病理学诊断为恶性肿瘤的病理周期可以长达十年以上，这期间有漫长的癌前病变时间，这提示我们如果能够做到早期诊断，早期预防，早期治疗，那么宫颈癌患者的治疗效果和预后就能得到明显的提高。

因此探讨宫颈癌发生发展的分子生物学机制，探寻用于鉴定宫颈癌遗传学易感人群的分子标记，宫颈癌患者分子分型和预后预测的分子标记，对于发现宫颈癌易感人群及宫颈癌患者实施有效的早期诊断和个体化治疗具有重要的预防和临床意义。本领域急需进一步找寻宫颈癌易感性相关遗传学分子标记，开发检测宫颈癌高危人群和易感个体的方法、试剂盒和检测方法。

目前研究主要方向在于发现宫颈癌的易感基因和遗传变异，但这些遗传变异只能解释一小部分宫颈癌的遗传易感性。因此，需要更为深入和细致的遗传研究，进一步理解宫颈癌的遗传易感性。

基因组DNA修复系统参与维持基因组的完整性和稳定性，以应对环境攻击、复制错误和累积遗传学错误。在人类中，五种主要的DNA修复途径帮助修复受损的DNA，包括直接逆转、碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复、错配修复和重组修复，其中100多个基因参与了这个过程。

SMUG1(Single Strand Selective Monofunctional Uracil DNA Glycosylase1)是从双链或单链DNA中去除尿嘧啶以保持氧化攻击后基因组稳定性的BER修复机制的主要基因之一。该基因中的单核苷酸多态性(SNP)可能对其修复DNA损伤的能力产生影响，从而导致肿瘤易感性的增高。SMUG1基因中的某些SNP和多种肿瘤(如膀胱癌，乳腺癌等)的易感性相关，但并没有文献报道SMUG1基因的SNP位点和宫颈癌易感性相关。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴别宫颈癌易感性的分子标记，并由此开发出用于检测宫颈癌易感性的试剂盒和检测方法，为发现宫颈癌易感人群及宫颈癌患者实施有效的早期诊断和个体化治疗提供检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明针对大量候选基因的SNP位点在宫颈癌大样本量标本中进行了检测和分析，首次发现了SMUG1基因和宫颈癌易感性密切相关，研究结果表明SMUG1基因的两个SNP位点，具体的：核苷酸序列如SEQ ID NO.1(NC_000012.6,rs3087404)和SEQ ID NO.7(NT_029419,rs2029167)中的第501位(编号是分别基于上述序列)存在单核苷酸多态性：A>G，均与宫颈鳞状细胞癌的发病存在显著相关性，并且这种相关性在其癌前病变CIN III中已经有所表现，501GG纯合子个体罹患CIN III和宫颈鳞状细胞癌的风险明显提高，因此可以作为宫颈癌遗传易感性检测和早期诊断的分子标记。

因此，本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.7所示的分子标记作为检测靶点在制备检测宫颈癌易感性试剂盒中的应用，所述分子标记序列的第501位均存在单核苷酸多态性：A>G，即该序列的第501位的碱基包括碱基A和碱基G两种情况。当为碱基A时表现为正常的SMUG1基因遗传状态，当为碱基G时，表现为异常或者错误的SMUG1基因遗传状态。

作为上述分子标记的应用，本发明提供了两种用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，分别基于SMUG1基因的两个SNP位点设计对应的PCR扩增引物。

一种用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，包括：特异性扩增核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的分子标记的引物对。

针对该SNP位点的碱基多态性，本发明设计并合成了两条特异性的上游引物，和一条特异性的下游引物，每一条特异性上游引物分别对应相应的A和G碱基序列，分别和下游引物作PCR特异性扩增，扩增产物长度为240bp，根据相应配对引物扩增的PCR阳性条带判断对应碱基的型态是纯合子还是杂合子。

同时为提高检测的特异性，在设计上游引物时把上游引物的3’端倒数第二个碱基设计为与互补链相同的碱基，而不是互补的碱基，这能避免非特异性条带的出现，保证了检测结果的特异性。

具体地，所述PCR引物序列为：

上游引物1:5'-CTCATCAAGAGACTGCTGGA-3'(SEQ ID NO.2)；

上游引物2:5'-CTCATCAAGAGACTGCTGGG-3'(SEQ ID NO.3)；

下游引物1:5'-ACTTTCATTGTTCCATAACT-3'(SEQ ID NO.4)；

所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。PCR反应液中各组分之间的用量关系为常规PCR条件下的比例，对所属领域技术人员是常规知识。

所述试剂盒还包括阳性对照Ⅰ和阳性对照Ⅱ，所述阳性对照Ⅰ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的基因片段；所述阳性对照Ⅱ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段。

另一种用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，包括：特异性扩增核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的分子标记的引物对。

针对该SNP位点的碱基多态性，本发明设计并合成了两条特异性的上游引物，和一条特异性的下游引物，每一条特异性上游引物分别对应相应的A和G碱基序列，分别和下游引物作PCR特异性扩增，扩增产物长度为184bp，根据相应配对引物扩增的PCR阳性条带判断对应碱基的型态是纯合子还是杂合子。

具体地，所述PCR引物序列为：

上游引物8:5'-GGGTGGTCCTCAGCTTGGCA-3'(SEQ ID NO.8)；

上游引物9:5'-GGGTGGTCCTCAGCTTGGCG-3'(SEQ ID NO.9)；

下游引物10:5'-GCAGTGACTGGCAGGAGGCG-3'(SEQ ID NO.10)。

所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。

所述试剂盒还包括阳性对照Ⅲ和阳性对照Ⅳ，所述阳性对照Ⅲ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的基因片段；所述阳性对照Ⅳ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的基因片段。

PCR反应体系组成：以总体积25μL计，内含：50ng基因组DNA，上下游引物各5.0pmol，0.2mM dNTP，1.0U Taq DNA polymerase。

作为上述试剂盒的应用，本发明还提供了一种检测体外样本是否存在SMUG1基因的单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

(1)提取体外样本的基因组DNA，作为模板，利用SMUG1基因特异性引物进行PCR扩增得到PCR扩增产物，针对SEQ ID NO.1(rs3087404)的特异性引物为两对，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；针对SEQ ID NO.7(rs2029167)的特异性引物为两对，其核苷酸序列分别SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10、SEQID NO.9和SEQ ID NO.10；

(2)将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，根据电泳结果，判断扩增产物是否存在以下的单核苷酸多态性，两个位点均为501A>G，突变位置编号是分别基于SEQ ID NO.1(NC_000012.6)和SEQ ID NO.7(NT_029419)的序列，进而确定体外样本的SMUG1基因相应位点是否存在单核苷酸多态性。

应用本发明提供的试剂盒对宫颈癌遗传易感性个体进行患病风险检测和诊断时，与正常的SMUG1基因进行比较，如存在差异，即存在单核苷酸多态性：501A>G，则表明该个体罹患宫颈癌的风险可能高于正常人群。

本发明具备的有益效果：

本发明利用SMUG1基因的两个SNP位点rs3087404(A>G)和rs2029167(A>G)均与宫颈癌易感性存在密切相关性，由此开发出两个用于检测宫颈癌易感性的检测试剂盒，试剂盒中具有基于SMUG1基因单核苷酸多态性设计的两对特异性引物，利用PCR技术可以有效检测SMUG1基因中的单核苷酸多态性，该方法检测简单、快捷、特异性高，同时费用低廉、无需特殊的DNA测序设备，便于在各级临床医院推广应用，这对于宫颈癌高危人群的筛选和易感个体的检测，对宫颈癌这个复杂性疾病进行早期预防、早期诊断和个性化防治具有重要的现实意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下的实施例中采用的方法目的是更好地理解本发明，但并不限于本发明。

如无特殊说明，实施例中涉及的实验方法均为常规方法，所用的实验材料均为常规试剂公司购买。

实施例1.SMUG1基因单核苷酸多态性检测和宫颈癌易感性的关联分析

1.1研究对象

随机选取宫颈鳞状细胞癌患者400例，以及宫颈癌癌前病变CIN III病例400例，选取病例时间为2004年6月到2008年12月，来源自浙江大学医学院附属妇产科医院经病理明确诊断的病例，同时选择1200例正常体检的女性志愿者作为正常对照，正常对照的入选标准为无病理细胞学发现、无子宫内膜异位症、无妇科肿瘤和无其他实体癌或免疫性疾病。所有病例和正常对照个体均为汉族居民。所有受试人员均按照浙江大学医学院妇科医院伦理委员会要求征得同意，所有的研究方法均遵循了批准的指导方针和条例。

抽取患者和正常志愿者外周抗凝血2ml左右，于-80℃冷冻保存待用。

1.2外周血基因组DNA提取

选用上海生工生物工程有限公司的外周血抽提试剂盒对150μL的外周血进行基因组DNA的抽提和纯化，实验步骤完全按照试剂盒的要求进行，所有基因组DNA样品溶解在去离子水中并冷冻保存直至进行后续PCR检测。

1.3特异性引物、PCR反应液组成和PCR反应条件

从GenBank库下载SMUG1基因的两段序列(NC_000012.6，NT_029419)，并用在线设计软件Primer-BLAST分别设计引物。根据我们自己的设计原则对上游引物3’端倒数第二位的碱基进行修改，改为与互补链相同的碱基，进一步提高检测的特异性，从而最终确定我们自己设计的上游引物，具体引物序列见表1。

表1.SMUG1单核苷酸多态性检测用上下游引物和产物长度

PCR反应液组成：共25μL体积，内含：50ng基因组DNA，上下游引物各5.0pmol，0.2mMdNTP，1.0U Taq DNA polymerase。

PCR扩增条件：94℃5分钟，(94℃30秒，57℃30秒，72℃60秒)×35个循环，72℃10分钟，10℃保温。PCR产物长度分别为240bp和184bp。

PCR产物观察：10μLPCR产物加入1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离，50V电压电泳20分钟，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察阳性条带。根据不同引物组成的PCR电泳阳性条带分析SMUG1基因中的两个片段SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7中501位点(位置编号基于SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.7)的碱基情况。

经分析我们发现在所有受试样本中存在501A>G这样的单核苷酸多态性，表现为AA、GG纯合子和AG杂合子。

1.4 SMUG1基因单核苷酸多态性基因型和宫颈癌的关联分析

健康对照组作为参考组进行分析。对SMUG1基因单核苷酸多态性的基因型分布与罹患宫颈鳞状细胞癌风险进行相关性评估，通过二元logistic回归分析得到比值比(Oddsratio,OR)95％置信区间(confidence interval,CI)和P值。所有统计值均为双侧检验，统计显著性水平设为P小于等于0.05。所有统计分析均采用SPSS18.0软件(SPSSInc.Chicago,USA)。

a、结果发现SEQ ID NO.1(NC_000012.6,rs3087404)中的501A>G和宫颈鳞状细胞癌的发病存在显著相关性，并且这种相关性在其癌前病变CIN III期间已经有所表现，501GG纯合子明显提高了个体罹患CIN III和宫颈鳞状细胞癌的风险，OR值分别达到了1.78(1.27-2.51)和4.04(2.94-5.55)；501G等位基因频率风险值OR分别达到了1.78(1.00-1.39)和1.86(1.59-2.19)，明显高于对照组，具体数据见表2和表3。

表2.SMUG1(rs3087404)基因变异关联分析及罹患CIN III的风险

表3.SMUG1(rs3087404)基因变异关联分析及罹患宫颈鳞状细胞癌的风险

b、同样我们也发现SEQ ID NO.7(NT_029419,rs2029167)中的501A>G和宫颈鳞状细胞癌的发病存在显著相关性，并且这种相关性在其癌前病变CIN III期间已经有所表现，501GG纯合子明显提高了个体罹患CIN III和宫颈鳞状细胞癌的风险，OR值分别达到了2.56(1.91-3.43)和4.05(3.02-5.44)；501G等位基因频率风险值OR分别达到了1.70(1.45-1.99)和2.34(1.99-2.76)，明显高于对照组，具体数据见表4和表5。

表4.SMUG1(rs2029167)基因变异关联分析及罹患CIN III的风险

表5.SMUG1(rs2029167)基因变异关联分析及罹患宫颈鳞状细胞癌的风险

实施例2.SMUG1基因单核苷酸多态性和宫颈癌易感性检测试剂盒

1、基于实施例1的结果，我们发现SMUG1基因中SEQ ID NO.1(NC_000012.6,rs3087404)和SEQ ID NO.7(NT_029419,rs2029167)中的501A>G的碱基变异与宫颈鳞状细胞癌以及其癌前病变CIN III的发病显著相关，因此我们设计了基于SMUG1基因单核苷酸多态性的特异性引物对患者的外周血DNA模板进行检测的试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ。

2、制备专用试剂盒(100tests)，具体试剂组成见表6和表7，如下：

表6.SMUG1基因SNP位点(rs3087404)检测试剂盒Ⅰ试剂成分组成

试剂名称(浓度)	试剂盒总量
		10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>25mM)	500μL
dNTP Mixture(各2.5mM)	2000μL
		Taq DNA polymerase(5U/μL)	40μL
上游引物1(SEQ ID NO.2)(100pmol)	100μL
		上游引物2(SEQ ID NO.3)(100pmol)	100μL
下游引物1(SEQ ID NO.4)(100pmol)	100μL
		阳性对照1(SEQ ID NO.5)	10μL
阳性对照2(SEQ ID NO.6)	10μL

表7.SMUG1基因SNP位点(rs2029167)检测试剂盒Ⅱ试剂成分组成

3、DNA模板制备：抽取受试者外周血1-2mL，采用常规酚氯仿抽提法，或者第三方外周血DNA抽提试剂盒，抽提得到的基因组DNA溶解于三蒸水，低温保存待集中标本检测时使用。

4、单个检测PCR试剂配方，具体见表8。

表8

10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>25mM)	2.5μL
		dNTP Mixture(各2.5mM)	10μL
Taq DNA polymerase(5U/μL)	0.2μL
		上游引物(100pmol)	1μL
下游引物(100pmol)	1μL
		Total Volume	20μL

5、PCR扩增反应条件：

PCR扩增条件：94℃5分钟，(94℃30秒，57℃30秒，72℃60秒)×35个循环，72℃10分钟，10℃保温。PCR产物长度分别为240bp(试剂盒Ⅰ)和184bp(试剂盒Ⅱ)。

6、PCR产物观察：

10μLPCR产物加入1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离，50V电压电泳20分钟，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察阳性条带。根据不同引物组成扩增得到的PCR产物电泳阳性条带分析SMUG1基因501位点(位置编号基于SEQ ID NO.1(NC_000012.6)和SEQ ID NO.7(NT_029419))的碱基情况。

与正常的SMUG1基因进行比较，存在差异即表明该个体罹患宫颈癌的风险可能高于正常人群。所述差异即存在单核苷酸多态性：501A>G。

申请人声明：在阅读本发明的上述内容之后，在具体实行检测时，对本发明做各种改动或者修整，如为本发明的等价形式替换同样落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种检测宫颈癌易感性的试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<221> variation

<222> (501)..(501)

<223> n is a or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (501)..(501)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

ttattattat tattattatt attattatta ttatttatta ttattattat tattattatt 60

atttcgttta aggatattta ttattgtccc tggactcccg gagtgcctcc aaaggacagg 120

ggagtgcata tgtgatttcg attccttcct cacttcccgg atttgatgtc agagaagtct 180

gacatcagtc tgaagtcggc ccttggtggt cagccttatc gcttggtcca actccgctgt 240

ctttgtgctt aatgtagtat gacaccgtat tttataaaat atctacattt cttaagcctc 300

tggctcttgg ggcgactttg ggtagaactt acaagttcct cctttgggtt ctcttagtgt 360

tttgttccgg gtattaaagc tcacatcaca ctgtattaca gttagttgtt tatttgccct 420

cacagcagat tatgagctta cagaaagcct ggcctacatt ttactctttt tggatttctt 480

cctcatcaag agactgctgc ngtgcctgtc atgtaagaga ctcataagta ttgaaaaaaa 540

aaatgagtta acaggtggta ggttggatgg agtatgtgat tttccataga gaagagagtt 600

aaatgagttg ctcaagagaa ccttcttaga gatgaaacag gagtagaatt caaatcaatt 660

gacttccagc ctgtggctct tgctatgaga tcaggctttg aagttatgga acaatgaaag 720

tagtatcttg ccactctttt ccccagcctt gctgtttcca acacaggtgt ctaaatgtca 780

aaggtgggct caagacttct cgagattcta gagctggagc agccaatctg ctaatgttgg 840

tgttgcatgg ggagatgcaa agcaaggtcc cctgaaacac tggcgttctc cacagcaccc 900

ttctcagctt ttgtatgagc ccagtttgtc ctgggtagcc acctggacaa cagatcagtt 960

aaagactact gagacagtca gggaaggact tcctaagttg g 1001

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcatcaaga gactgctgga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcatcaaga gactgctggg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actttcattg ttccataact 20

<210> 5

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcatcaaga gactgctgca gtgcctgtca tgtaagagac tcataagtat tgaaaaaaaa 60

aatgagttaa caggtggtag gttggatgga gtatgtgatt ttccatagag aagagagtta 120

aatgagttgc tcaagagaac cttcttagag atgaaacagg agtagaattc aaatcaattg 180

acttccagcc tgtggctctt gctatgagat caggctttga agttatggaa caatgaaagt 240

<210> 6

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcatcaaga gactgctgcg gtgcctgtca tgtaagagac tcataagtat tgaaaaaaaa 60

aatgagttaa caggtggtag gttggatgga gtatgtgatt ttccatagag aagagagtta 120

aatgagttgc tcaagagaac cttcttagag atgaaacagg agtagaattc aaatcaattg 180

acttccagcc tgtggctctt gctatgagat caggctttga agttatggaa caatgaaagt 240

<210> 7

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<221> unsure

<222> (501)..(501)

<223> n is a or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (501)..(501)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 7

ccaccctgag ctgagcaggc gcagcagaca gcaagcgcgc ctctcagcaa atcccagccc 60

cattcagcct ggtgattaat ggcgctgccc tccccatgaa cctgccttta atactgagga 120

agttatgaaa ccgctataca tcagcagctc cggccccact gcccccgccc gcgtcctcct 180

cccctctaac ccccaccctc cagctccctc ttcaaaatct catctgggct cctgtctcct 240

gggcccaccc ctcctctggc ctttgctggg gggaggaggg tgtctgtccc tgctgccatc 300

cctggtaagg accacatctc attttccctt cctctctccc ccctgctccg ccctctctcc 360

ctccccccaa cccacggctg catctccgga cccatttaga attgctgaca ttttatctgc 420

attacataca tcactccgtc cccagcagcc atctctcatg gattatcggg gggcgagggc 480

ggggtggtcc tcagcttggg naagtgacag agaaacaggg tggaggtgcg gagatagata 540

gcacttcctc cacacgcttt ttccctcagg gcccaatccc cagccacctg agaggctgtg 600

caggtgggag cctaggatag ctgatggcaa gggttgtacc ctagccgcct cctgccagtc 660

actgctatct cataacatca aaagcctttt tctcagacca cacagactaa ggaaggtcat 720

gttgcgtgtc ttcctgccat gggactcctc ctcaggacat tatgaaaggg gttgtttaac 780

gtcttagcag gccttctcta atattttcca cactgccctt ttaggaagtc tctctgaatg 840

tctaaccact gtgctccatg ctgcagccat tattgtcttc ttgctttgtc cttagaaggt 900

tgaagagcaa tattgttcct caaatgcgtt aaaccctttg ttaggatgcc tgagcaacca 960

taaatacagt cacttttcca cactcctgag gctcataaac a 1001

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gggtggtcct cagcttggca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gggtggtcct cagcttggcg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcagtgactg gcaggaggcg 20

<210> 11

<211> 184

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggtggtcct cagcttggga aagtgacaga gaaacagggt ggaggtgcgg agatagatag 60

cacttcctcc acacgctttt tccctcaggg cccaatcccc agccacctga gaggctgtgc 120

aggtgggagc ctaggatagc tgatggcaag ggttgtaccc tagccgcctc ctgccagtca 180

ctgc 184

<210> 12

<211> 184

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gggtggtcct cagcttgggg aagtgacaga gaaacagggt ggaggtgcgg agatagatag 60

cacttcctcc acacgctttt tccctcaggg cccaatcccc agccacctga gaggctgtgc 120

aggtgggagc ctaggatagc tgatggcaag ggttgtaccc tagccgcctc ctgccagtca 180

ctgc 184

Claims

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.7所示的分子标记作为检测靶点在制备检测宫颈癌易感性试剂盒中的应用，其特征在于，所述分子标记序列的第501位均存在单核苷酸多态性：A>G，即该序列的第501位的碱基包括碱基A和碱基G两种情况。

2.一种用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，其特征在于，包括：特异性扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的分子标记的引物对。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对为两对，其中一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，另一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照Ⅰ和阳性对照Ⅱ，所述阳性对照Ⅰ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的基因片段；所述阳性对照Ⅱ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段。

6.一种用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，其特征在于，包括：特异性扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的分子标记的引物对。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对为两对，其中一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，另一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.10所示。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。

9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照Ⅲ和阳性对照Ⅳ，所述阳性对照Ⅲ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的基因片段；所述阳性对照Ⅳ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的基因片段。