CN109439750A - 一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记、试剂盒及应用，属于分子生物学与生物医药技术领域。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在第501位存在单核苷酸多态性：G>C或者G>T，即此序列的第501位的碱基包括碱基G、碱基C和碱基T三种情况。本发明提供的试剂盒具有基于NEIL2基因单核苷酸多态性设计的三对特异性引物，NEIL2基因单核苷酸多态性与宫颈癌易感性密切相关，利用PCR技术可以有效检测NEIL2基因中的单核苷酸多态性，进而鉴别宫颈癌易感性，这对于宫颈癌高危人群的筛选和易感个体的检测，对宫颈癌这个复杂性疾病进行早期预防、早期诊断和个性化防治具有重要的现实意义。

Description

一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记及其应用。

背景技术

宫颈癌是全世界妇女中第四常见的癌症，估计每年有529572例新诊断病例和274967例死亡。同时宫颈癌也是全世界妇女癌症相关死亡的第三大原因，而且发病率一直在升高。在中国，除了乳腺癌之外，宫颈癌已经成为女性最常见的癌症(98.9/100000)，死亡率高达30.5/100000，发病率也在上升。

高危型人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌发生的主要病因，然而，尽管大约80％的妇女一生中都可能HPV感染，但只有一小部分发展为恶性肿瘤。根据流行病学调查以及现代分子遗传学研究发现，这种现象必然和个体的遗传学背景有关，不同遗传学背景的个体对宫颈癌的易感性是完全不同的。而且宫颈癌的发病从HPV感染到细胞恶性转化，最后到最终病理学诊断为恶性肿瘤的病理周期可以长达十年以上，这期间有漫长的癌前病变时间，这提示我们如果能够做到早期诊断，早期预防，早期治疗，那么宫颈癌患者的治疗效果和预后就能得到明显的提高。

因此探讨宫颈癌发生发展的分子生物学机制，探寻用于鉴定宫颈癌遗传学易感人群的分子标记，宫颈癌患者分子分型和预后预测的分子标记，对于发现宫颈癌易感人群及宫颈癌患者实施有效的早期诊断和个体化治疗具有重要的预防和临床意义。

目前研究主要方向在于发现宫颈癌的易感基因和遗传变异，但这些遗传变异只能解释一小部分宫颈癌的遗传易感性。因此，需要更为深入和细致的遗传研究，进一步理解宫颈癌的遗传易感性。

基因组DNA修复系统参与维持基因组的完整性和稳定性，以应对环境攻击、复制错误和累积遗传学错误。在人类中，五种主要的DNA修复途径帮助修复受损的DNA，包括直接逆转、碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复、错配修复和重组修复，其中100多个基因参与了这个过程。其中NEIL1和NEIL2两个基因遗传变异可能影响蛋白质功能，导致细胞命运的改变和增加致癌风险，但并没有文献报道这两个基因中的SNP位点和宫颈癌易感性相关。因此，本领域急需进一步找寻宫颈癌易感性相关遗传学分子标记，开发检测宫颈癌高危人群和易感个体的方法、试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴别宫颈癌易感性的分子标记，并由此开发出用于检测宫颈癌易感性的试剂盒和检测方法，为发现宫颈癌易感人群及宫颈癌患者实施有效的早期诊断和个体化治疗提供检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1(rs804270)所示，在第501位存在单核苷酸多态性：G>C或者G>T，即此序列的第501位的碱基包括碱基G、碱基C和碱基T三种情况。

当为碱基G时表现为正常的NEIL2基因遗传状态，当为碱基C或者碱基T时，表现为异常或者错误的NEIL2基因遗传状态。

本发明针对大量候选基因的SNP位点在宫颈癌大样本量标本中进行了检测和分析，首次发现了NEIL2(nei like DNA glycosylase 2)基因和宫颈癌易感性密切相关，研究结果表明SEQ ID NO:1(rs804270)中的501G>C和宫颈鳞状细胞癌的发病存在显著相关性，并且这种相关性在其癌前病变CIN III期间已经有所表现，501CC纯合子个体罹患CIN III和宫颈鳞状细胞癌的风险明显提高，因此可以作为宫颈癌遗传易感性检测和早期诊断的分子标记。

本发明还提供了所述的分子标记作为检测靶点在制备检测宫颈癌易感性试剂盒中的应用。

作为上述分子标记的应用，本发明提供了一种用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测所述的分子标记的特异性引物。

针对上述SNP位点的碱基多态性，本发明设计并合成了三条特异性的上游引物，和一条特异性的下游引物，每一条特异性上游引物分别对应相应的G、C、T碱基序列，分别和下游引物作PCR特异性扩增，扩增产物长度为317bp，根据相应配对引物扩增的PCR阳性条带判断对应碱基的型态是纯合子还是杂合子。

同时为提高检测的特异性，在设计上游引物时把上游引物的3’端倒数第二个碱基设计为与互补链相同的碱基，而不是互补的碱基，这能避免非特异性条带的出现，保证了检测结果的特异性。

具体地，所述PCR引物序列为：

上游引物1:5’-CCCCCGGGCAGGGAGGGCGG-3’(SEQ ID NO:2)；

上游引物2:5’-CCCCCGGGCAGGGAGGGCGC-3’(SEQ ID NO:3)；

上游引物3:5’-CCCCCGGGCAGGGAGGGCGT-3’(SEQ ID NO:4)；

下游引物:5’-GACAAAACCGCCAGGCTGGA-3’(SEQ ID NO:5)。

所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。PCR反应液中各组分之间的用量关系为常规PCR条件下的比例，对所属领域技术人员是常规知识。

作为上述试剂盒的应用，本发明还提供了一种检测体外样本是否存在NEIL2基因的单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

(1)提取体外样本的基因组DNA，作为模板，利用NEIL2基因特异性引物进行PCR扩增得到PCR扩增产物，所述NEIL2基因特异性引物为三对，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；

(2)将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，根据电泳结果，判断扩增产物是否存在以下的单核苷酸多态性：501G>C或者501G>T，突变位置编号是基于SEQ ID NO:1的序列，进而确定体外样本的NEIL2基因相应位点是否存在单核苷酸多态性。

应用本发明提供的试剂盒对宫颈癌遗传易感性个体进行患病风险检测和诊断时，与正常的NEIL2基因进行比较，如存在差异，即存在单核苷酸多态性：501G>C，则表明该个体罹患宫颈癌的风险可能高于正常人群。

本发明具备的有益效果：

本发明提供了一种用于检测宫颈癌易感性的检测试剂盒，试剂盒中具有基于NEIL2基因单核苷酸多态性设计的三对特异性引物，NEIL2基因单核苷酸多态性rs804270与宫颈癌易感性密切相关，利用PCR技术可以有效检测NEIL2基因中的单核苷酸多态性，该方法检测简单、快捷、特异性高，同时费用低廉、无需特殊的DNA测序设备，便于在各级临床医院推广应用，这对于宫颈癌高危人群的筛选和易感个体的检测，对宫颈癌这个复杂性疾病进行早期预防、早期诊断和个性化防治具有重要的现实意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下的实施例中采用的方法目的是更好地理解本发明，但并不限于本发明。

如无特殊说明，实施例中涉及的实验方法均为常规方法，所用的实验材料均为常规试剂公司购买。

实施例1.NEIL2基因单核苷酸多态性检测和宫颈癌易感性的关联分析

1.1研究对象

随机选取宫颈鳞状细胞癌患者400例，以及宫颈癌癌前病变CIN III病例400例，选取病例时间为2004年6月到2008年12月，来源自浙江大学医学院附属妇产科医院经病理明确诊断的病例，同时选择1200例正常体检的女性志愿者作为正常对照，正常对照的入选标准为无病理细胞学发现、无子宫内膜异位症、无妇科肿瘤和无其他实体癌或免疫性疾病。所有病例和正常对照个体均为汉族居民。抽取患者和正常志愿者外周抗凝血2ml左右，于-80℃冷冻保存待用。

所有受试人员均按照浙江大学医学院妇科医院伦理委员会要求征得同意，所有的研究方法均遵循了批准的指导方针和条例。

1.2外周血基因组DNA提取

选用上海生工生物工程有限公司的外周血抽提试剂盒对150微升的外周血进行基因组DNA的抽提和纯化，实验步骤完全按照试剂盒的要求进行，所有基因组DNA样品溶解在去离子水中并冷冻保存直至进行后续PCR检测。

1.3特异性引物、PCR反应液组成和PCR反应条件

从GenBank的SNP库下载NEIL2的基因序列(rs804270)，并用在线设计软件Primer-BLAST设计引物，并且根据我们自己的设计原则对上游引物3’端倒数第二位的碱基进行修改，改为与互补链相同的碱基，进一步提高检测的特异性，从而最终确定我们自己设计的上游引物，具体引物序列见表1。

表1NEIL2单核苷酸多态性检测用上下游引物和产物长度

PCR反应液组成：共20μL体积，内含：20ng基因组DNA,上下游引物各5.0pmol，0.25mM dNTP,1.0U Taq DNA polymerase。

PCR扩增条件：94℃5分钟,(94℃30秒，56℃30秒,72℃30秒)×35个循环，72℃10分钟，10℃保温。PCR产物长度为317bp。

PCR产物观察：10μLPCR产物加入2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离，50V电压电泳20分钟，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察阳性条带。根据不同引物组成的PCR电泳阳性条带分析NEIL2基因501位点(位置编号基于SEQ ID NO:1)的碱基情况。

经分析我们发现在所有受试样本中存在501G>C这样的单核苷酸多态性，表现为GG、CC纯合子和GC杂合子，但未检测到TT纯合子和含T碱基的杂合子。

1.4NEIL2基因单核苷酸多态性基因型和宫颈癌的关联分析

健康对照组作为参考组进行分析。对NEIL2基因单核苷酸多态性的基因型分布与罹患宫颈鳞状细胞癌风险进行相关性评估，通过二元logistic回归分析得到比值比(Oddsratio,OR)95％置信区间(confidence interval,CI)和P值。所有统计值均为双侧检验，统计显著性水平设为P小于等于0.05。所有统计分析均采用SPSS18.0软件(SPSSInc.Chicago,USA)。

结果发现SEQ ID NO:1(rs804270)中的501G>C和宫颈鳞状细胞癌的发病存在显著相关性，并且这种相关性在其癌前病变CIN III期间已经有所表现，501CC纯合子可以明显提高了个体罹患CIN III和宫颈鳞状细胞癌的风险，OR值分别达到了1.44(1.06-1.97)和2.22(1.63-3.02)；501C等位基因频率风险值OR分别达到了1.20(1.02-1.41)和1.54(1.31-1.81)，明显高于对照组。具体数据见表2和表3

表2.基因变异关联分析及罹患CIN III的风险

表3.基因变异关联分析及罹患宫颈鳞状细胞癌的风险

实施例2.NEIL2基因单核苷酸多态性和宫颈癌易感性检测试剂盒

1、基于实施例1的结果，我们发现SEQ ID NO:1(rs804270)中的501G>C的碱基变异与宫颈鳞状细胞癌以及其癌前病变CIN III的发病显著相关，因此我们设计了基于NEIL2基因单核苷酸多态性的特异性引物对患者的外周血DNA模板进行检测的试剂盒。

2、制备专用试剂盒(100tests)，具体试剂组成见表4，如下：

表4.NEIL2基因SNP位点检测试剂盒试剂成分组成

试剂名称(浓度)	试剂盒总量
		10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>25mM)	200μL
dNTP Mixture(各2.5mM)	800μL
		Taq DNA polymerase(5U/μL)	20μL
上游引物1(SEQ ID NO:2)(100pmol)	100μL
		上游引物2(SEQ ID NO:3)(100pmol)	100μL
上游引物3(SEQ ID NO:4)(100pmol)	100μL
		下游引物(SEQ ID NO:5)(100pmol)	100μL

3、DNA模板制备：抽取受试者外周血1-2mL，采用常规酚氯仿抽提法，或者第三方外周血DNA抽提试剂盒，抽提得到的基因组DNA溶解于三蒸水，低温保存待集中标本检测时使用。

4、单个检测PCR试剂配方，具体见表5，

表5

10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>25mM)	2μL
		dNTP Mixture(各2.5mM)	8μL
Taq DNA polymerase(5U/μL)	0.2μL
		上游引物(100pmol)	1μL(1,2,3中任选一)
下游引物(100pmol)	1μL
		Total Volume	20μL

5、PCR扩增反应条件：

PCR扩增条件：94℃5分钟,(94℃30秒，56℃30秒,72℃30秒)×35个循环，72℃10分钟，10℃保温。PCR产物长度为317bp。

6、PCR产物观察：10μLPCR产物加入2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离，50V电压电泳20分钟，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察阳性条带。根据不同引物组成扩增得到的PCR产物电泳阳性条带分析NEIL2基因501位点(位置编号基于SEQ ID NO:1)的碱基情况。

与正常的NEIL2基因进行比较，存在差异即表明该个体罹患宫颈癌的风险可能高于正常人群。所述差异即存在单核苷酸多态性：501G>C。

申请人声明：在阅读本发明的上述内容之后，在具体实行检测时，对本发明做各种改动或者修整，如为本发明的等价形式替换同样落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记、试剂盒及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<221> variation

<222> (501)..(501)

<223> n is g,c or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (501)..(501)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

ggccggagtc cacgcccact tgggggagga gccccgcagc ctccacctac aggggcgtcc 60

cctaagggga cggaggccgc atgggccgcc gagccgggaa atctccgccc ccagctggag 120

cggctgtgcg ggctgcgtag cggtgctggg tcgggccgac gtgccaccca cccggagccg 180

gtgagtgcag ccgcccgccc tccggtagat ctgcggcctg gcggagaagt cgggagggga 240

caggaaggga gggcgggccc cgggccctcc tccgtctcag ccgcctgcgg aggtgctgcc 300

cacgcctgga ggcccccact gaccctcaga cccgcgtctg cgcccctctc cccgcacccc 360

gaggcagagt tgggaaagca gtggtcttag accccccacc tcgggcactc ggaagagaac 420

ggcggagaca acccctcctc ttccctggct ggcgcagcgc cagcctcgag ctcctcggta 480

gcccccgggc agggagggcc ngagggtggg cgcggcatct tcagcgactc ttcgaagtcc 540

cttccgcgtc tcatctttca aggctgttgc agaggcggct tgcttcccac ctgtccatct 600

ccataaaaat ccctaaacga aacatgccca cgtgtccgga gattttcagg acttggtgca 660

tttcagatga aggcttttcc agaagcttcc ccgtagaaga ggatcaggca tccaactggt 720

taaggtcagc agcgtttggc acgtctcctt ccagcctggc ggttttgtca ggattccctg 780

gggagtgtct ggaaagcctg atgaggggaa atagtacatc tcagcgaatc ggcaccagcg 840

agtgtaagat gcgcgttatt gaatgtgctg ctgccgaata tgagaatgcc gagattgtga 900

gccgtcacca tttcttagat tttaaaagta ttctaaaatg ttttttagaa tcactgaaat 960

ataatagcta ccccctgccc gatatctact tagttctttt c 1001

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccccgggca gggagggcgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccccgggca gggagggcgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccccgggca gggagggcgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacaaaaccg ccaggctgga 20

Claims (6)

1.一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在第501位存在单核苷酸多态性：G>C或者G>T，即此序列的第501位的碱基包括碱基G、碱基C和碱基T三种情况。

2.如权利要求1所述的分子标记作为检测靶点在制备检测宫颈癌易感性试剂盒中的应用。

3.一种用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，其特征在于，包括：用于检测如权利要求1所述的分子标记的特异性引物。

4.如权利要求3所述的用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物为三对，每个引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，所述下游引物如SEQ ID NO.5所示。

5.如权利要求3所述的用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。

6.一种检测体外样本是否存在NEIL2基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取体外样本的基因组DNA，作为模板，利用NEIL2基因特异性引物进行PCR扩增得到PCR扩增产物，所述NEIL2基因特异性引物为三对，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；

(2)将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，根据电泳结果，判断扩增产物是否存在以下的单核苷酸多态性：501G>C或者501G>T，突变位置编号是基于SEQ ID NO:1的序列，进而确定体外样本的NEIL2基因相应位点是否存在单核苷酸多态性。