CN113584222A - 用于检测covid-19易感性的分子标记、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测COVID‑19易感性的分子标记、试剂盒及应用,属于分子生物和医学技术领域。该分子标记包括在ABO基因序列的第1007位存在一个SNP位点,其中,脱氧核苷酸由T变为TC。其中,用于COVID‑19早期筛查的试剂盒包括SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的用于扩增ABO基因的特异性引物;它还包括PCR反应液,所述PCR反应液由Taq酶、Buffer、dNTP、Mg2+和双蒸水组成。本发明设计的分子标记及试剂盒,能实现对于COVID‑19高危人群及易感人群的早期诊断和筛查,对于实现COVID‑19的有效防控具备重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)及其与COVID-19的相关性研究,属于分子生物 学和医学技术领域,具体地涉及一种用于检测COVID-19易感性的分 子标记、试剂盒及应用。
背景技术
据数据模型研究和血清感染研究估计实际感染人数要大得多,表 明大多数感染者可能有轻度症状或无症状。COVID-19患者表现出广 泛的临床症状:在确诊病例中,多达5%会发展成为包含急性呼吸窘 迫综合征(ARDS)在内的严重肺炎。虽然目前研究已发现高龄、男性、 高血压、糖尿病、肥胖和心血管疾病等因素与COVID-19的发病密切 相关,但仍有大量没有上述危险因素的患者出现严重症状。提示 COVID-19患者的筛选、早期诊断对于疫情防治具有重要意义,因此, 寻找和鉴定COVID-19高危人群和易感个体至关重要。
然而现有技术中,没有与COVID-19易感性相关的遗传变异的报 道,也没有相关的检测试剂盒和检测方法。因此,本领域急需进一步 寻找COVID-19易感性基因,开发检测COVID-19高危人群和易感个 体的方法、试剂盒以及相关的治疗药物。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明公开了一种用于检测COVID-19易 感性的分子标记、试剂盒及应用。具体地通过检测体外样品中是否含 有ABO基因中的单核苷酸多态性,能够实现对于COVID-19高危人 群及易感人群的早期诊断、筛查和对于COVID-19的有效防控。
为实现上述目的,本发明公开了一种用于检测COVID-19易感性 的分子标记,其特征在于:在ABO基因序列的第1007位存在一个 SNP位点,其中,脱氧核苷酸由T变为TC。
本发明公开技术方案的其中一个技术目的是上述分子标记在制 备用于检测COVID-19易感性的试剂盒中的应用。
进一步地,一种用于检测COVID-19易感性的试剂盒,所述试剂 盒包括SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的用于扩增ABO基因的 特异性引物。
进一步地,所述试剂盒还包括PCR反应液,所述PCR反应液由 Taq酶、Buffer、dNTP、Mg2+和双蒸水组成。
进一步地,所述特异性引物对ABO基因扩增后所得产物长度为 250~2010bp。
本发明公开技术方案的另一个技术目的是一种检测体外样品是 否存在基因单核苷酸多态性的方法,它包括如下检测过程:
采用特异性引物SEQ ID No:2和SEQ ID No:3扩增样品的ABO 基因,得到扩增产物,对所述扩增产物进行序列测定,当ABO基因 序列的第1007位存在一个SNP位点,且脱氧核苷酸由T变为TC时, 则为突变ABO基因,仍是T时为正常基因。
进一步地,采用PCR扩增技术对样品进行扩增,且PCR扩增条 件为,94℃:4分钟,94℃:30秒×35次循环,60℃:30秒×35次循环, 72℃:1分钟×35次循环,72℃延伸5分钟。
进一步地,所述样品包括血液、唾液、肺泡冲洗液等。
本发明公开技术方案的余下技术目的是是对个体COVID易感性 或患病风险进行检测或诊断的方法,它包括如下步骤:
(1)提取受试者血液DNA,应用上述检测试剂盒进行PCR反 应,并将产物进行测序,其中,测序引物使用SEQ ID No:2或SEQ ID No:3。
(2)比对测序结果,若出现SEQ ID No:1中1007T>TC的SNP 位点,说明该受试者为COVID-19易感染对象,应提醒该受试者严格 注意防护,减少公众场合活动,避免感染,并优先进行疫苗接种;若 未出现上述中的任意一种,说明该受试者不是COVID-19易感染对象。
检验原理:
SNP是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列 多态性。通过大数据分析研究表明,本发明中SEQ ID No:1中的1007 T>TC位点与新冠肺炎疾病严重程度呈显著相关性,这可能是因为单 个氨基酸的改变或突变,进一步导致蛋白质表达异常或结构异常,进 而导致相应蛋白质功能异常,影响个体的免疫系统或影响机体不能及 时有效清除SARS-Cov-2,最终使得机体感染病毒并发病。
有益效果:
1、本发明设计了一种分子标记及试剂盒,能实现对于COVID-19 高危人群及易感人群的早期诊断和筛查,对于实现COVID-19的有效 防控具备重要意义;
2、本发明设计的检测方法操作简单,且检测过程快速,准确度 也较高,适合对COVID-19高危人群及易感人群的早期筛查。
附图说明
图1为新冠肺炎患者人群中9q34.2位点的Regional plot图。
具体实施方式
术语解释
SNP:单核苷酸多态性,主要是指在基因组水平上由单个核苷酸 的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见 的一种,占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛 存在,平均每300个碱基对中就有1个,估计其总数可达300万个甚至更多。SNP是一种二态的标记,由单个碱基的转换或颠换所引起, 也可由碱基的插入或缺失所致。SNP既可能在基因序列内,也可能在 基因以外的非编码序列上。
本发明的发明人经过广泛深入而深入的研究,通过对多中心大样 本数据的整合分析,对大量候选基因的SNP进行分析和筛选,首次 发现ABO基因SNP位点与COVID-19易感性密切相关,可作为 COVID-19易感性检测或早期诊断的分子标记。因此,本发明提供了 一种用于检测COVID-19易感性的分子标记、试剂盒及应用。
为更好的解释本发明技术方案,以下结合具体实施例进行详细说 明。
实施例1 ABO基因突变的检测及其与COVID-19感染的相关性 分析;
1.1筛选受试者:
选取无合并症的新冠肺炎确诊患者200例,选择年龄、性别匹配 的健康体检对照人群200例。留取受试人员外周血至少1.5mL,-80℃ 冰箱冷冻保存备用。
1.2提取样本DNA:
提取上述步骤1.1的受试人员外周血中DNA;其中,本实施例 提取血液样品DNA采用QIAGEN公司DNA纯化试剂盒,货号:69504。
具体操作过程如下:
取100uL血液样品,加入20uL蛋白酶K,100uL PBS震荡混匀;
加入200uL Buffer AL,震荡混匀后56℃水浴10min;
加入200uL无水乙醇,震荡混匀得混合物;
将混合物转入试剂盒提供的spin column中,6000g离心1min, 弃去废液;
更换收集管,在spin column中加入500μL试剂盒提供的Buffer AW1,其中,所述Buffer AW1按说明书要求提前加入无水乙醇,6000g 离心1min,弃去废液;
继续更换收集管,在spin column中加入500μL试剂盒提供的 Buffer AW2,所述Buffer AW2按说明书要求提前加入无水乙醇, 20000g离心3min,弃去废液;
去除收集管,将spin column转入1.5mL离心管中,加入200uL 试剂盒提供的Buffer AE,完全覆盖膜,室温静置至少1min;
6000g离心1min,获得样品DNA,应用Nanodrop 2000微量紫 外分光光度计测量DNA浓度,其中,所述Nanodrop 2000微量紫外 分光光度计为Thermo公司;
1.3 ABO基因特异性引物设计:
检索GenBank数据库中ABO基因组序列,应用Primer3Plus在 线引物设计工具设计引物,且引物序列信息如SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示。
1.4 PCR扩增:
PCR扩增使用北京擎科新业生物技术有限公司的2×Master Mix 目录号为TSE003。
且PCR扩增条件如下:
1.5测序分析:
上述PCR扩增产物由武汉擎科公司完成测序,测序引物使用SEQ ID No:2,测序结果经DNA测序分析软件Chromas,版本v2.6.5进 行检查,应用Invitrogen Vector NTI 11软件包附带序列比对软件 AlignX进行比对。通过对比分析,确定是否存在ABO基因的单核苷酸多态性。
1.6 SNP分型与COVID-19关联分析:
确定SNP位点后,应用卡方检验对检测结果中SNP位点的分布 特征情况进行统计学分析,应用Logistic回归分析对基因型频率、等 位基因频率和新冠肺炎患者临床表型的相关性进行评估,计算95% 置信区间(confidence interval,CI)和比值比(Odds ratio,OR),应用 SPSS 22.0软件进行统计分析。结果发现SEQ ID No:2中的1007T>TC 位点与新冠肺炎疾病严重程度呈显著相关性(P=8.03×10-2),其中, 95%CI为0.98~1.38,OR值为1.17。因此可以通过判断体外样品中是 否含有ABO基因单核苷酸多态性实现对COVID-19易感性的有效筛 选。如下表1为ABO与COVID-19的相关性;
表1 ABO与COVID-19的相关性
*HGI,即Host Genetics Initiative,宿主遗传学计划。
与此同时,图1为新冠肺炎患者人群中9q34.2位点的Regional plot图,结合图1可知新冠肺炎人群中的ABO基因SNP位点具有显 著差异性。
实施例2
应用COVID-19易感性检测试剂盒判断受试对象COVID-19的易 感性;
根据实施例1的相关结果,发现ABO基因与COVID-19易感性 密切相关,基于该结果中的突变可设计基因特异性引物,从而制出一 种检测试剂盒,用以检测受试患者的血液DNA模板。
上述检测试剂盒(以100人次为例),包含下表2所示试剂。
表2 试剂盒含量列表
其中,上述引物的序列表如下表3所示;
表3 引物序列表
与此同时,所述PCR反应混合液包含PCR反应的常规组件: Buffer、Taq酶、dNTP、Mg2+和双蒸水组成。
实际应用中,试剂盒包括包装盒、海绵衬垫、装有上游引物的试 管、装有下游引物的试管、装有PCR反应Mix的试管、装有阳性对 照品的一个试管和装有阴性对照品的一个试管。
进一步地按照实施例1中步骤1.2所述方法提取受试患者血液 DNA,应用表2中所述检测试剂盒进行PCR反应,并将产物进行测 序,测序引物使用SEQ ID No:2。
结果判定:比对测序结果,若出现SEQ ID No:1中1007T>TC 的SNP位点,则说明该受试者为COVID-19易感染对象,应提醒该 受试者严格注意防护,减少公众场合活动,避免感染,并优先进行疫 苗接种;否则说明该受试者不是COVID-19易感染对象。
此外,正常ABO基因的基因序列表如下所示:
因此,本发明依据SEQ ID No:1中1007T>TC的SNP位点, 开发出一种检测检测新冠肺炎遗传易感性的试剂盒。该试剂盒涉及 SEQ ID No:1中1007T>TC的SNP。具体检测方法为通过常规方法 提取受试患者外周血标本的DNA,应用该易感性检测试剂盒进行 PCR反应,将PCR产物进行常规测序,应用Chromas软件检验测序 结果,应用Invitrogen Vector NTIAlignX软件比对测序序列。若测序 结果含有1007T>TC,即可判定该标本对应患者对新冠肺炎的易感性 高于正常人群。
以上实施例仅为最佳举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。 除上述实施例外,本发明还有其他实施方式。凡采用等同替换或等效 变换形成的技术方案,均落在本发明要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于检测COVID-19易感性的分子标记,其特征在于,在ABO基因序列的第1007位存在一个SNP位点,其中,脱氧核苷酸由T变为TC。
2.一种权利要求1所述分子标记在制备用于检测COVID-19易感性的试剂盒中的应用。
3.一种用于检测COVID-19易感性的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的用于扩增ABO基因的特异性引物。
4.根据权利要求3所述用于检测COVID-19易感性的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括PCR反应液,所述PCR反应液由Taq酶、Buffer、dNTP、Mg2+和双蒸水组成。
5.根据权利要求3或4所述用于检测COVID-19易感性的试剂盒,其特征在于,所述特异性引物对ABO基因扩增后所得产物长度为250~2010bp。
6.一种检测体外样品是否存在基因单核苷酸多态性的方法,其特征在于,它包括如下检测过程:
采用特异性引物SEQ ID No:2和SEQ ID No:3扩增样品的ABO基因,得到扩增产物,对所述扩增产物进行序列测定,当ABO基因序列的第1007位存在一个SNP位点,且脱氧核苷酸由T变为TC时,则为突变ABO基因,仍是T时为正常基因。
7.根据权利要求6所述检测体外样品是否存在基因的单核苷酸多态性的方法,其特征在于,采用PCR扩增技术对样品进行扩增,且PCR扩增条件为,94℃:4分钟,94℃:30秒×35次循环,60℃:30秒×35次循环,72℃:1分钟×35次循环,72℃延伸5分钟。
8.根据权利要求6或7所述检测体外样品是否存在基因的单核苷酸多态性的方法,其特征在于,所述样品包括血液、唾液、肺泡冲洗液等。
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