CN104962655A - 一种与卵巢癌易感性相关的分子标记及检测引物和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与卵巢癌易感性相关的分子标记，及其检测引物和试剂盒，所述与卵巢癌易感性相关的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其与正常的CASR基因相比，第719位存在一个单核苷酸多态性：A>G。所述引物如序列表中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；该引物能特异性的扩增CASR基因，扩增的片段长度为200～2700bp。本发明还提供了一种体外检测样品是否存在CASR基因的单核苷酸多态性的方法。本发明的用于检测与卵巢癌易感性相关的分子标记的引物及试剂盒，检测简单、准确、快速，特异性强，对于高危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。

Description

一种与卵巢癌易感性相关的分子标记及检测引物和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种与卵巢癌易感性相关的分子标记，以及检测与卵巢癌易感性相关的分子标记的引物及试剂盒，具体的涉及CASR基因的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)及其与卵巢癌的相关性，及检测这些SNP的引物和试剂盒，属于医学和分子生物学领域。

背景技术

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统肿瘤，2014年美国新发病例21980人，死亡14270人。由于起病隐匿，症状不明显，多数患者发现时已届晚期，晚期卵巢癌患者5年生存率仅为30～45％左右，预后差，而早期卵巢癌患者5年生存率高达90％，这提示我们提高卵巢癌患者预后和生存的关键是早诊、早治，因此探讨卵巢癌发生发展的生物学机制，寻找鉴定卵巢癌易感人群的分子标记，卵巢癌患者分子分型和预后预测的分子标记，对于高危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。

现有技术中，虽然已经有超过200个候选基因和20个遗传区域的1100个遗传变异与卵巢癌易感性相关，但是与卵巢癌相关性很强的遗传变异却很少。本申请的发明人长期从事与卵巢癌相关性遗传变异的研究，已发现GAAD45A基因和MTDH基因的单核苷酸多态性与卵巢癌的发生相关性很强(分别记载在中国专利申请CN102864236B和CN102994512B)中。但不同基因的单核苷酸多态性与卵巢癌的发生之间并不存在直接相关性，这也就增加了筛查与卵巢癌相关的遗传变异的难度。

目前尚未有钙敏感受体(CaSR)基因SNP与卵巢癌相关性的报道。因此，本领域急需进一步寻找卵巢癌易感基因，开发检测卵巢癌高危人群和易感个体的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

针对上述现有技术，本申请的发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析，首次发现CASR和卵巢癌易感性密切相关，可作为卵巢癌易感性检测或者早期诊断的分子标记，因此，本发明提供了一种用于检测卵巢癌易感性分子标记的引物及试剂盒，以及体外检测样品是否存在CASR基因的单核苷酸多态性的方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种与卵巢癌易感性相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其与正常的CASR基因相比，区别在于：第719位存在一个单核苷酸多态性：A>G，即第719位的碱基包括碱基A和碱基G两种情形，当为碱基A时，为正常的CASR基因，当为碱基G时，为突变的CASR基因。

一种检测与卵巢癌易感性相关的分子标记的引物，所述引物如序列表中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，引物序列具体如下：

上游引物：5'CTGGCAACTGGTAGGCACGC 3'(SEQ ID NO：2)；

下游引物：5'GAGGGACTCGCAGGATGACG 3'(SEQ ID NO：3)。

所述引物能特异性的扩增CASR基因，扩增的片段长度为200～2700bp。

本发明还提供了该引物在制备用于检测卵巢癌易感性的试剂盒或检测传感器中的应用。

本发明进一步提供了一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒，包括一对检测CASR基因719位单核苷酸多态性位点的特异性引物，引物序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

所述试剂盒中，除特异性引物外，还包括有PCR反应液，PCR反应液由dNTP、Mg²⁺、Taq酶和Buffer组成。PCR反应液中各组分的用量关系为常规的，对所属领域技术人员而言是公知常识。

一种非诊断目的的体外检测样品是否存在CASR基因的单核苷酸多态性的方法，步骤如下：

(1)用CASR基因特异性引物扩增样品的CASR基因，得到扩增产物；所述引物为一对，具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列；

(2)对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：719A>G；719A>G突变位置编号基于SEQ ID NO:1的序列。

一种对个体的卵巢癌易感性或患病风险进行检测或诊断的方法，步骤如下：

检测该个体的CASR基因、转录本和/或蛋白，并与正常的CASR基因、转录本和/或蛋白进行比较，存在差异就表明该个体患卵巢癌的可能性低于正常人群。所述差异是指是否存在单核苷酸多态性：719A>G；719A>G突变位置编号基于SEQ ID NO:1的序列。

本发明的有益效果：

(1)本发明对大量候选基因的SNP进行了测定和分析，首次发现CASR和卵巢癌易感性密切相关的SNP位点，可作为卵巢癌易感性检测或者早期诊断的分子标记。

(2)本发明的用于检测与卵巢癌易感性相关的分子标记的引物及试剂盒，检测简单、准确、快速，特异性强，对于高危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。

(3)本发明的检测与卵巢癌易感性相关的分子标记的引物是针对CASR基因上的rs17251221号SNP位点而设计，引物的专一性强，采用本发明的引物进行扩增时，扩增条件易于摸索，方便进行特异性扩增。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1CASR基因突变的检测及与卵巢癌的关联分析

1.1研究对象

选取卵巢癌患者290例，2008年9月～2014年10月于山东大学齐鲁医院确诊治疗，临床资料从病历获得。年龄匹配的对照病人312例，为齐鲁医院健康体检中心健康查体妇女。大部分受试者均为山东省内汉族居民。取受试人员外周血1.5ml，于-80℃冷藏保存。所有受试人员均按照山东大学齐鲁医院伦理委员会要求征得同意。

1.2DNA提取

用常规酚氯仿法提取受试者外周血DNA，具体如下：

(1)取400ul血加于1.5ml离心管中。

(2)加入800ul PBS,混匀，3500g，15min，弃上清；重复一遍。

(3)加入400ul裂解液，37℃，1h。

(4)加入蛋白酶K 4ul，浓度200ug/ml。

(5)55℃水浴消化过夜(4-12h)。

(6)加入400ul的Tris饱和酚，混合摇动10min。

(7)5000g，15min，取水相。

(8)加入100ul NaAc，800ul无水乙醇，-20℃，20min。

(9)12000g，5min，弃上清。

(10)600ul 70％冰乙醇，12000g，5min，弃上清，重复一次。

(11)12000rpm离心，10分钟。弃上清，晾干。溶于100μl TE。

(12)测定浓度和纯度，分装，冻存于-80℃。

1.3引物、PCR扩增和测序

从GenBank下载CASR基因组序列(Gene ID:846；Location：NC_000003.12)，用primerpremier5.0设计引物。具体引物详细信息见表1。

表1 引物序列表

引物名称	序列	SEQ ID NO：
			上游引物	5'CTGGCAACTGGTAGGCACGC 3'	2
下游引物	5'GAGGGACTCGCAGGATGACG 3'	3

PCR扩增条件：94℃3分钟，(94℃30秒，60℃30秒，72℃40秒)×35，72℃7分钟，10℃保温。PCR扩增产物为1255bp。

PCR扩增产物送交上海博尚生物技术公司测序，测序结果应用软件Meglign 7.0和Chromas 2.33进行检验和分析，本实施经分析，发现存在以下SNP：719A>G。

1.4SNP分型和关联分析

应用卡方(X²)检验对受试人员位点的分布进行统计分析；当一个单元格的期望个数少于5个时应用Fisher精确检验进行分析。所有P值均为双侧概率，当P<0.05时认为有显著统计学意义。应用无条件逻辑回归分析对基因型频率、等位基因频率和卵巢癌患病之间的相关性进行评估，计算其比值比(Odds ratio，OR)和95％可信区间(confidence interval，CI)，并应用SPSS17.0软件(SPSS Inc.Chicago,Illinois,USA)进行统计分析。

结果发现SEQ ID NO：1中的rs17251221(719A>G)位点与卵巢癌发病显著相关，其中加性遗传模型(A/A vs.A/G vs G/G)的P值为0.001。隐性遗传模型(A/A vs A/G+G/G)的P值为0.001(OR＝0.349,95％CI[0.181～0.671])。G等位基因为保护性等位基因(P＝0.001，OR＝0.354，95％CI[0.186～0.671])。详细结果见表2。

表2 719A>G位点基因型及等位基因在卵巢癌组和健康对照组中的分布

实施例2

卵巢癌易感性检测试剂盒

由于SEQ ID NO：1中719A>G的突变与卵巢癌发表高度相关，因此可基于这个突变设计CASR基因特异性引物再以病人的DNA为模板进行扩展检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有如表3所示的物质：

表3 试剂盒的组成

抽取受试者外周血2ml，常规方法提取DNA。利用卵巢癌易感性检测试剂盒进行PCR反应，将反应产物进行测序，将测序结果利用Meglign 7.0和Chromas 2.33软件进行检验和分析。检测结果含有rs17251221(719A>G)的受试者卵巢癌易感性低于正常人群。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明做各种修改或改动，但这些改动或修改的等价形式同样落在本发明所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种与卵巢癌易感性相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其与正常的CASR基因相比，区别在于：第719位存在一个单核苷酸多态性：A>G。

2.一种检测权利要求1所述的与卵巢癌易感性相关的分子标记的引物，其特征在于，所述引物如序列表中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

3.如权利要求2所述的检测与卵巢癌易感性相关的分子标记的引物，其特征在于，所述引物能特异性的扩增CASR基因，扩增的片段长度为200～2700bp。

4.权利要求2或3任一项所述的引物在制备用于检测卵巢癌易感性的试剂盒或检测传感器中的应用。

5.一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3任一项所述的检测与卵巢癌易感性相关的分子标记的引物。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，除特异性引物外，还包括有PCR反应液，PCR反应液由dNTP、Mg²⁺、Taq酶和Buffer组成。

7.一种非诊断目的的体外检测样品是否存在CASR基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)用CASR基因特异性引物扩增样品的CASR基因，得到扩增产物；所述引物为一对，具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列；

(2)对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：719A>G；719A>G突变位置编号基于SEQ ID NO:1的序列。