CN104745719A - 用于ret融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于RET融合基因检测的引物、探针，包括RET融合突变特异性反转录引物及RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；一种用于RET融合基因检测的检测试剂盒，包括mRNA反转录cDNA体系，所述的mRNA反转录cDNA体系用于所述的检测试剂盒的PCR反应；本发明采用了特异引物和探针技术，可以特异检测人类RET基因融合突变；建立了实时荧光PCR体系，可同时检测RET基因17种融合突变；灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；操作简单，检测廉价，临床应用范围广；样本检测范围广，样本可以为新鲜病理组织，石蜡包埋组织或胸腔液；检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒。
背景技术
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率居各种癌症之首。每年全世界有超过130万的患者死于肺癌，近一半发生在发展中国家。据2010年我国卫生部的统计，肺癌死亡率为30.83/10万，肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤。（Orras
JM,Fernandez E,Gonzalez JR, et al.Lung
cancer mortality in European regions(1955-1997).Ann Oncol,2003,14(1):159-161;中华人民共和国卫生部，《2010年中国卫生统计》年鉴）。
肺癌从组织病理学上可以分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer ,NSCLC）两大类，其中非小细胞肺癌约占肺癌总病例的85%。在我国肺癌患者5年生存率仅为13%，其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及与之相配的科学治疗方案，从而使患者错失了治疗的最佳时机。
目前化疗仍是肺癌的主要治疗手段，然而多数化疗会产生较大的毒副作用，不同患者间的化疗效果会有较大差异。随着肿瘤分子生物学的发展，肺癌的分子靶向治疗因其特异性高，毒副作用低，日益成为临床医生首选治疗方式。RET基因为原癌基因，定位于第10号外显子的q11.2位置，编码一个受体酪氨酸激酶。研究发现，RET基因在乳头状甲状腺癌和非小细胞肺癌中还可以和CCDC6，NCOA4，PRKAR1A，TRIM24, GOLGA5, TRIM33, KTN1, ERC1, MBD1 和
TRIM27发生融合，激活下游RAS/MAPK/ERK, PI3K/AKT, 和 phospholipase Cɤ信号途径，引起癌症的发生（Gainor JF，Shaw AT， The Oncologist2013;18:865–875 ）。
以卡博替尼、凡德他尼为代表的药物是针对RET基因融合突变开发的小分子靶向药物，通过抑制RET酪氨酸激酶区域的活性，阻断其下游异常信号通路，从而抑制肿瘤细胞的生长。临床研究表明卡博替尼对RET融合突变患者的有效率可达61%以上，而对野生型的患者几乎没有疗效。因此，检测RET融合突变情况是指导卡博替尼类药物用药的前提和基础，在治疗之前通过高敏度的检测方法检测RET融合基因突变对于提高患者的生存率，延长生存期，提高生存质量有着重要意义。
目前，RET融合突变的检测方法主要为荧光原位杂交（FISH）法，然而FISH法检测特异性差，灵敏度低，检测时间长。此外，FISH检测需要昂贵的专用仪器设备，试剂成本较高，操作复杂，使临床检测广泛使用受到了限制。FISH检测要求检测样本保存时间不宜过长，采用保存时间长的样本进行检测会导致假阴性的发生，影响了检测的准确性。因此，FISH检测法无法满足临床医生检测实际应用的需求，临床迫切需要开发一种高灵敏度的可以同时检测RET多种基因融合的检测方法，以实现快速对RET多种融合突变进行同时检测，从而为临床肺癌个体化治疗方案提供科学参考依据。
发明内容
本发明的目的：提供一种用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒，可以一次同时检测RET基因的17种融合突变，检测灵敏度高，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，廉价快速，操作简单等优点，可以满足临床快速检测的实际需求。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种用于RET融合基因检测的引物、探针，包括RET融合突变特异性反转录引物及RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的RET融合突变特异性反转录引物具体为：
RET反转录1： TGAAGGAGAAGAGGACAGCG SEQ ID NO：01
RET反转录2：
CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC
SEQ ID NO：02
RET反转录3：
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：03
Actin反转录4： CAGGAGGAGCAATGATCTTG SEQ ID NO：04。
所述的RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列包括KIF5B和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、CCD1、CCD2、ERC和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、GOLGA7F、NCOA8F、HOOK11F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、TRIM24、TRIM33和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、KIF5B-24和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列及KIF5B-15和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的KIF5B和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
KIF15F
GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT
SEQ ID NO：05
KIF16F
TAGCAGCATGTCAGCTTCGTAT SEQ ID NO：06
KIF22F
CTCTTTGTTCAGGACCTGGCTAC
SEQ ID NO：07
KIF23F
AATCTTGAACAGCTCACTAAAGTGC
SEQ ID NO：08
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：09
Taqman Ret12 FAM-5-
ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：10。
所述的CCD1、CCD2、ERC和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
CCDC1F GCACTGCAGGAGGAGAACC SEQ ID NO：11
CCDC2F
TTCCTCACTAATGAGCTCTCCAG
SEQ ID NO：12
ERC11F
TTGGAGCAGAAGAAGGAGGAG
SEQ ID NO：13
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：14
Taqman Ret12 FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：15。
所述的GOLGA7F、NCOA8F、HOOK11F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
GOLGA7F
GAAGCTGATGGGCCAGATACAT
SEQ ID NO：16
NCOA8F
CAGGACTGGCTTACCCAAAAG
SEQ ID NO：17
HOOK11F
AGTTAAGAAAGGCCAACGCAG
SEQ ID NO：18
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：19
Taqman Ret12 FAM-5-
ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：20。
所述的PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
PCM29F
GACCGGCAAATTAAAGCAATTAT
SEQ ID NO：21
PRKAR7F
AATGTGAAATTGTGGGGCATC
SEQ ID NO：22
KTN29F
GCCATGCTAAAAGAGAGGGAG
SEQ ID NO：23
RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO：24
Taqman Ret12
FAM-5-ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB
SEQ ID NO：25。
所述的TRIM24、TRIM33和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
TRIM24-9F
GCACCTGTGGGTTTACCAAAC
SEQ ID NO：26
TRIM33-16F GTAAGAAGGGGAAAACTGCGC SEQ ID NO：27
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：28
Taqman Ret12
FAM-5-ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB
SEQ ID NO：29。
所述的KIF5B-24和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
KIF24F
TCGCATAAAGGAAGCAGTCAG
SEQ ID NO：10
K24R11R
TGAAGGAGAAGAGGACAGCG
SEQ ID NO：10
TaqmanK24R11
FAM-5-AAGAGGGCATTCTGCAC-3-BHQ-MGB
SEQ ID NO：30。
所述的KIF5B-15和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
KIF15F
GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT SEQ
ID NO：31
K15R11R CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC SEQ ID NO：32
TaqmanK15R11 FAM-5-ATCTCCTCAGCTGAGATGAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：33。
上述的用于RET融合基因检测的引物、探针，其中，还包括参考基因特异性引物和探针核苷酸序列，具体为：
ACTBF
CTGGCATTGCCGACAGGA SEQ
IDNO：34
ACTBR
AGGAGCAATGATCTTGATCTTC SEQ IDNO：35
ACTtaqman FAM-5-AAGGAGATCACTGCCCTG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：36。
一种用于RET融合基因检测的检测试剂盒，其中，包括mRNA反转录cDNA体系，所述的mRNA反转录cDNA体系用于所述的检测试剂盒的PCR反应，所述的mRNA反转录cDNA体系包括：
5×RT
buffer 4µL
引物终浓度 200nM
dNTP 1mM
super RT 200U
RNA 6µL
补DEPC水至 20µL；
所述的检测试剂盒的PCR反应扩增体系为：
10XPCR
Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
上述的用于RET融合基因检测的检测试剂盒，其中，所述的mRNA反转录cDNA体系包括如下操作步骤：
步骤1：取逆转录反应混合液 13µL，super RT逆转录酶1µl，加入无菌离心管中，混匀。
步骤2：加入待测样品RNA 6µL，RNA总量在0.1～5µg范围内至20µl。
步骤3：将所述的步骤2中的样品42°保温1个小时，85°C孵育5分钟，反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
步骤4：逆转录产物可直接用于后续PCR反应和荧光定量PCR反应。
上述的用于RET融合基因检测的检测试剂盒，其中，所述的检测试剂盒的PCR反应的条件如下：
一种用于RET融合基因检测的检测试剂盒的检测方法，其中，方法至少包括如下步骤：
步骤1：根据COSMIC数据公布的人类RET基因为野生型基因序列，针对RET基因17种融合突变，来设计特异引物和探针。
步骤2：提取检测样本的RNA。
步骤3：通过荧光PCR扩增仪运行实时荧光PCR扩增反应体系。
步骤4：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
上述的用于RET融合基因检测的检测试剂盒的检测方法，其中，在所述的步骤2中，所述的检测样本包括新鲜病理组织或石蜡包埋组织或胸腔液。
上述的用于RET融合基因检测的检测试剂盒的检测方法，其中，所述的步骤4还包括如下分析及判定分步骤：
步骤4.1：运行无模板对照时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
步骤4.2：运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，继续分析实验结果。
步骤4.3：运行MIX8的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，继续分析；如果Ct值>42.0，则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
步骤4.4：有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
步骤4.5：在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，阳性为存在融合，阴性为不存在融合。
步骤4.6：根据所述的步骤4.1至步骤4.5判定实验结果。
| mix1 | mix2 | mix 3 | mix 4 | mix 5 | mix 6 | mix 7 | |
| 阳性 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 |
| 阴性 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 |
本发明采用了特异引物和探针技术，可以特异检测人类RET基因融合突变；建立了实时荧光PCR体系，可同时检测RET基因17种融合突变；灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；操作简单，检测廉价，临床应用范围广；样本检测范围广，样本可以为新鲜病理组织，石蜡包埋组织或胸腔液；检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
附图说明
图1是本发明用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒的检测KIF5B-15和RET-12基因融合质粒Q-PCR图。
图2是本发明用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒的检测KIF5B-15和RET-12基因融合质粒灵敏度分析实验结果Q-PCR图。
图3是本发明用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒的检测临床样本突变阳性（KIF5B和RET基因融合）Q-PCR图。
图4是本发明用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒的检测临床样本KIF5B和RET基因融合野生型Q-PCR图。
具体实施方式
以下结合附图进一步说明本发明的实施例。
请参见附图1至附图4所示，一种用于RET融合基因检测的引物、探针，包括RET融合突变特异性反转录引物及RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的RET融合突变特异性反转录引物具体为：
RET反转录1： TGAAGGAGAAGAGGACAGCG SEQ ID NO：01
RET反转录2：
CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC
SEQ ID NO：02
RET反转录3：
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：03
Actin反转录4： CAGGAGGAGCAATGATCTTG SEQ ID NO：04；
所述的RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列包括KIF5B和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列（mix1）、CCD1、CCD2、ERC和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列（mix2）、GOLGA7F、NCOA8F、HOOK11F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列（mix3）、PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列（mix4）、TRIM24、TRIM33和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列（mix5）、KIF5B-24和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列（mix6）及KIF5B-15和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列（mix7）；所述的KIF5B和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
KIF15F
GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT
SEQ ID NO：05
KIF16F
TAGCAGCATGTCAGCTTCGTAT
SEQ ID NO：06
KIF22F
CTCTTTGTTCAGGACCTGGCTAC
SEQ ID NO：07
KIF23F
AATCTTGAACAGCTCACTAAAGTGC
SEQ ID NO：08
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：09
Taqman Ret12 FAM-5-
ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：10；
所述的CCD1、CCD2、ERC和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
CCDC1F GCACTGCAGGAGGAGAACC SEQ ID NO：11
CCDC2F TTCCTCACTAATGAGCTCTCCAG SEQ ID NO：12
ERC11F
TTGGAGCAGAAGAAGGAGGAG
SEQ ID NO：13
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：14
Taqman Ret12 FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：15；
所述的GOLGA7F、NCOA8F、HOOK11F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
GOLGA7F
GAAGCTGATGGGCCAGATACAT
SEQ ID NO：16
NCOA8F
CAGGACTGGCTTACCCAAAAG
SEQ ID NO：17
HOOK11F
AGTTAAGAAAGGCCAACGCAG
SEQ ID NO：18
RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO：19
Taqman Ret12 FAM-5-
ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：20；
所述的PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
PCM29F
GACCGGCAAATTAAAGCAATTAT
SEQ ID NO：21
PRKAR7F AATGTGAAATTGTGGGGCATC SEQ ID NO：22
KTN29F
GCCATGCTAAAAGAGAGGGAG
SEQ ID NO：23
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：24
Taqman Ret12
FAM-5-ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB
SEQ ID NO：25；
所述的TRIM24、TRIM33和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
TRIM24-9F
GCACCTGTGGGTTTACCAAAC SEQ
ID NO：26
TRIM33-16F
GTAAGAAGGGGAAAACTGCGC SEQ
ID NO：27
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ
ID NO：28
Taqman Ret12
FAM-5-ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB
SEQ ID NO：29；
所述的KIF5B-24和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
KIF24F
TCGCATAAAGGAAGCAGTCAG
SEQ ID NO：10
K24R11R
TGAAGGAGAAGAGGACAGCG
SEQ ID NO：10
TaqmanK24R11
FAM-5-AAGAGGGCATTCTGCAC-3-BHQ-MGB
SEQ ID NO：30；
所述的KIF5B-15和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
KIF15F
GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT SEQ
ID NO：31
K15R11R
CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC SEQ
ID NO：32
TaqmanK15R11 FAM-5-ATCTCCTCAGCTGAGATGAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：33。
还包括参考基因特异性引物和探针核苷酸序列（mix8），具体为：
ACTBF
CTGGCATTGCCGACAGGA SEQ IDNO：34
ACTBR
AGGAGCAATGATCTTGATCTTC SEQ
IDNO：35
ACTtaqman FAM-5-AAGGAGATCACTGCCCTG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：36。
一种用于RET融合基因检测的检测试剂盒，包括mRNA反转录cDNA体系，所述的mRNA反转录cDNA体系用于所述的检测试剂盒的PCR反应，所述的mRNA反转录cDNA体系包括：
5×RT buffer 4µL
引物终浓度 200nM
dNTP 1mM
super RT 200U
RNA 6µL
补DEPC水至 20µL；
所述的检测试剂盒的PCR反应扩增体系为：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
所述的mRNA反转录cDNA体系包括如下操作步骤：
步骤1：取逆转录反应混合液 13µL，super RT逆转录酶1µl，加入无菌离心管中，混匀。
步骤2：加入待测样品RNA
6µL，RNA总量在0.1～5µg范围内至20µl。
步骤3：将所述的步骤2中的样品42°保温1个小时，85°C孵育5分钟，反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
步骤4：逆转录产物可直接用于后续PCR反应和荧光定量PCR反应。
所述的检测试剂盒的PCR反应的条件为：
一种用于RET融合基因检测的检测试剂盒的检测方法，该方法至少包括如下步骤：
步骤1：根据COSMIC数据公布的人类RET基因为野生型基因序列，针对RET基因17种融合突变，来设计特异引物和探针。
步骤2：提取检测样本的RNA。
步骤3：通过荧光PCR扩增仪运行实时荧光PCR扩增反应体系。
步骤4：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
在所述的步骤2中，所述的检测样本包括新鲜病理组织或石蜡包埋组织或胸腔液。
所述的步骤4还包括如下分析及判定分步骤：
步骤4.1：运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
步骤4.2：运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
步骤4.3：运行MIX8（ref）的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0，则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
步骤4.4：有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
步骤4.5：在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，阳性为存在融合，阴性为不存在融合。
步骤4.6：根据所述的步骤4.1至步骤4.5判定实验结果。
| mix1 | mix 2 | mix 3 | mix 4 | mix 5 | mix 6 | mix7 | |
| 阳性 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 |
| 阴性 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 |
实施例1：
利用本发明体系检测质粒，实验用质粒模板（含KIF5B-15和RET-12基因融合），利用上述荧光PCR检测RET基因融合突变的方法如下：
（1）质粒处理与提取
质粒的提取采用TIANGEN（HighPure Plasmid kid，DP116）的质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明操作。所提DNA溶于Tris-HCl (10mM,pH 8.0), 经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl (10mM,pH 8.0)溶液调整DNA浓度到20ng/ul作为稀释母液。
根据公式C拷贝浓度=（C质量浓度X6.02X1023）/MWDNA稀释野生型质粒为106个拷贝数/微升。
(2)建立PCR扩增反应体系：
将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增：
10XPCR
Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
实时PCR反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
实验结束以后，按以下步骤进行分析、判定：
1. 运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
2. 运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
3. 运行MIX8（ref）的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0,则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
4. 有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
5. 在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，阳性为存在融合，阴性为不存在融合。
根据下表判定结果：
| mix1 | mix 2 | Mix3 | mix 4 | mix 5 | mix 6 | mix 7 | |
| 阳性 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 |
| 阴性 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 |
重复性试验：每个反应分别加入突变质粒DNA1000拷贝、100拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.5个循环。
检测结果表明，本发明的检测体系可以准确检测质粒RET融合突变，检测的灵敏度可达到5-10拷贝。
实施例2
运用本发明检测临床样本，取送待检测的临床肺癌石蜡包埋组织样本130例，男性81例，女性49例，年龄为35-76岁，平均年龄为55岁，中位年龄51岁。利用本发明特异引物和探针荧光PCR体系检测130例临床样本的RET的基因融合突变步骤如下：
(1)样本处理与RNA的提取
a．取约1×1 cm2的各肺癌样本切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入1 ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
b．12,000 rpm（～13,400×g）离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉。c．加入1 ml无水乙醇，涡旋震荡混匀。12,000
rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
d．打开管盖，室温或最高至37°C孵育10分钟，直至无乙醇残留。
e．加入150 μl
Buffer PKD，重悬沉淀；加入10 μl
Proteinase K，涡旋震荡混匀。
f．56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解。80℃孵育15分钟。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
g．加入320 μl
Buffer RBC，涡旋震荡彻底混匀。
h.将步骤9中所得到的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的过滤柱（DNA Remover Column）中。10,000 rpm离心1分钟，收集滤液。
i.在步骤10得到的滤液中，加入720 μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
j.将步骤11中所得的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RS）中。10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
k.向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2，10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
l.12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
m.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50 μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，10,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，准备后续实验。
(2)建立PCR扩增反应体系
将所提上述RNA溶于0.1%DEPC水中，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度OD260/OD280为1.9-2.1，并读其含量。取0.1～5µg的RNA A作为其c DNA合成的模板，采用康为世纪的RNA逆转录试剂盒合成cDNA,cDNA合成体系如下：
5×RT
buffer 4µL
引物终浓度 200nM
dNTP 1mM
super RT 200U
RNA 6µL
补DEPC水至 20µL
应用上述反转录体系按如下步骤进行逆转录
(a)取逆转录反应混合液13µL, super RT逆转录酶1µL,加入无菌离心管中，混匀。
(b)加入待测样品RNA 6µL,RNA总量在 0.1～5µg范围内至20µL。
（c）42°C保温1个小时。
(d)85°C保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA 模板。
将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增：
10XPCR
Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
实时PCR反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
实验结束以后，按以下步骤进行分析、判定：
1. 运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
2. 运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
3. 运行MIX8（ref）的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0,则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
4. 有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
5. 在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，阳性为存在融合，阴性为不存在融合。
根据下表判定实验结果：
| mix 1 | mix 2 | mix 3 | mix 4 | mix 5 | mix 6 | mix 7 | |
| 阳性 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 | 曲线呈 S型且 Ct≤42 |
| 阴性 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 | 无扩增曲线 |
检测结果表明所检测130例肺癌样本中有3例发生有RET融合突变（为KIF5B和RET基因融合），突变率为2.2%，同时对上述所有样本进行FISH对比检测，FISH结果表明突变有2例，经测序证明FISH结果未检出的样本为融合阳性，进一步证明了本发明体系检测的结果优于FISH检测。
附表1：RET基因17 种融合突变：
| 融合基因 | 融合基因 | 融合外显子位点 | COSMIC |
| KIF5B | RET | K15-R12 | COSF1233 |
| KIF5B | RET | K16-R12 | COSF1610 |
| KIF5B | RET | K22-R12 | COSF1254 |
| KIF5B | RET | K23-R12 | COSF1235 |
| KIF5B | RET | K15-R11 | COSF1256 |
| KIF5B | RET | K24-R11 | COSF1263 |
| CCDC6 | RET | C1-R12 | COSF1272 |
| CCDC6 | RET | C2-R12 | COSF1516 |
| ERC1 | RET | E11-R12 | COSF1508 |
| GOLGA5 | RET | G7-R12 | COSF1504 |
| HOOK3 | RET | H11-R12 | COSF1510 |
| NCOA4 | RET | N8-R12 | COSF1492 |
| PCM1 | RET | P29-R12 | COSF1482 |
| PRKAR1A | RET | P7-R12 | COSF1512 |
| KTN1 | RET | K29-R12 | COSF1514 |
| TRIM24 | RET | T9-R12 | COSF1522 |
| TRIM33 | RET | T16-R12 | COSF1526 |
附表2：RET基因17种融合突变PCR反应各管检测突变点：
| 管号 | 试剂管 | 体积 |
| Mix1 | KIF5B-15,16,22,23和RET-12基因融合检测反应混合液MIX1 | 210ul |
| Mix2 | CCD1、CCD2、ERC和RET-12基因融合检测反应混合液MIX2 | 210ul |
| Mix3 | GOLGA7F、NCOA8F、HOOK11F和RET-12基因融合检测反应混合液MIX3 | 210ul |
| Mix4 | PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合检测反应混合液MIX4 | 210ul |
| Mix5 | TRIM24、TRIM33和RET-12基因融合检测反应混合液MIX5 | 210ul |
| Mix6 | KIF5B-24和RET-11基因融合检测反应混合液MIX6 | 210ul |
| Mix7 | KIF5B-15和RET-11基因融合检测反应混合液MIX7 | 210ul |
| Mix8 | 参考混合液MIX8 | 210ul |
附表3：临床样本检测结果比较：
综上所述，本发明采用了特异引物和探针技术，可以特异检测人类RET基因融合突变；建立了实时荧光PCR体系，可同时检测RET基因17种融合突变；灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；操作简单，检测廉价，临床应用范围广；样本检测范围广，样本可以为新鲜病理组织，石蜡包埋组织或胸腔液；检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
<110>上海允英医疗科技有限公司
<120>用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒
<160>37
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
TGAAGGAGAAGAGGACAGCG
20
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC
22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
22
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
CAGGAGGAGCAATGATCTTG
20
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT
24
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
TAGCAGCATGTCAGCTTCGTAT
22
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>7
CTCTTTGTTCAGGACCTGGCTAC
23
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>8
AATCTTGAACAGCTCACTAAAGTGC
25
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>9
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
22
<210>10
<211>18
<212>DDNA
<213>人工合成
<400>10
ATCCAAAGTGGGAATTCC
18
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>11
GCACTGCAGGAGGAGAACC
19
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>12
TTCCTCACTAATGAGCTCTCCAG
23
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>13
TTGGAGCAGAAGAAGGAGGAG
21
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>14
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
22
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>15
ATCCAAAGTGGGAATTCC
18
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>16
GAAGCTGATGGGCCAGATACAT
22
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>17
CAGGACTGGCTTACCCAAAAG 21
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>18
AGTTAAGAAAGGCCAACGCAG
21
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>19
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
22
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>20
GACCGGCAAATTAAAGCAATTAT
23
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>21
AATGTGAAATTGTGGGGCATC
21
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>22
GCCATGCTAAAAGAGAGGGAG
21
<210>23
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>23
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
22
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>24
ATCCAAAGTGGGAATTCC
18
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>25
GCACCTGTGGGTTTACCAAAC 21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>26
GTAAGAAGGGGAAAACTGCGC
21
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>27
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
22
<210>28
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>28
ATCCAAAGTGGGAATTCC-
18
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>29
TCGCATAAAGGAAGCAGTCAG
21
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>30
TGAAGGAGAAGAGGACAGCG
20
<210>31
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成
<400>31
AAGAGGGCATTCTGCAC
17
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>32
GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT
24
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>33
CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC
22
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>34
ATCTCCTCAGCTGAGATGAC
20
<210>35
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>35
CTGGCATTGCCGACAGGA
18
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>36
AGGAGCAATGATCTTGATCTTC
22
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>37
AAGGAGATCACTGCCCTG
18
Claims (8)
1.一种用于RET融合基因检测的引物、探针，其特征在于：包括RET融合突变特异性反转录引物及RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的RET融合突变特异性反转录引物具体为：
RET反转录1： TGAAGGAGAAGAGGACAGCG SEQ ID NO：01
RET反转录2： CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC SEQ ID NO：02
RET反转录3： CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO：03
Actin反转录4： CAGGAGGAGCAATGATCTTG SEQ ID NO：04；
所述的RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列包括KIF5B和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、CCD1、CCD2、ERC和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、GOLGA7F、NCOA8F、HOOK11F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、TRIM24、TRIM33和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、KIF5B-24和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列及KIF5B-15和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的KIF5B和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
KIF15F
GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT
SEQ ID NO：05
KIF16F TAGCAGCATGTCAGCTTCGTAT SEQ ID NO：06
KIF22F
CTCTTTGTTCAGGACCTGGCTAC
SEQ ID NO：07
KIF23F
AATCTTGAACAGCTCACTAAAGTGC
SEQ ID NO：08
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：09
Taqman
Ret12 FAM-5-
ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：10；
所述的CCD1、CCD2、ERC和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
CCDC1F
GCACTGCAGGAGGAGAACC
SEQ ID NO：11
CCDC2F
TTCCTCACTAATGAGCTCTCCAG
SEQ ID NO：12
ERC11F
TTGGAGCAGAAGAAGGAGGAG
SEQ ID NO：13
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：14
Taqman Ret12
FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ
ID NO：15；
所述的GOLGA7F、NCOA8F、HOOK11F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
GOLGA7F
GAAGCTGATGGGCCAGATACAT SEQ ID NO：16
NCOA8F
CAGGACTGGCTTACCCAAAAG
SEQ ID NO：17
HOOK11F
AGTTAAGAAAGGCCAACGCAG
SEQ ID NO：18
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：19
Taqman
Ret12 FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：20；
所述的PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
PCM29F
GACCGGCAAATTAAAGCAATTAT
SEQ ID NO：21
PRKAR7F
AATGTGAAATTGTGGGGCATC
SEQ ID NO：22
KTN29F
GCCATGCTAAAAGAGAGGGAG SEQ ID NO：23
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：24
Taqman
Ret12
FAM-5-ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB
SEQ ID NO：25；
所述的TRIM24、TRIM33和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
TRIM24-9F
GCACCTGTGGGTTTACCAAAC
SEQ ID NO：26
TRIM33-16F
GTAAGAAGGGGAAAACTGCGC
SEQ ID NO：27
RET12R
CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG
SEQ ID NO：28
Taqman
Ret12
FAM-5-ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB
SEQ ID NO：29；
所述的KIF5B-24和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
KIF24F
TCGCATAAAGGAAGCAGTCAG
SEQ ID NO：10
K24R11R
TGAAGGAGAAGAGGACAGCG
SEQ ID NO：10
TaqmanK24R11
FAM-5-AAGAGGGCATTCTGCAC-3-BHQ-MGB
SEQ ID NO：30；
所述的KIF5B-15和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：
KIF15F
GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT SEQ
ID NO：31
K15R11R
CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC SEQ
ID NO：32
TaqmanK15R11 FAM-5-ATCTCCTCAGCTGAGATGAC-3-BHQ-MGB SEQ ID
NO：33。
2.根据权利要求1所述的用于RET融合基因检测的引物、探针，其特征在于：还包括参考基因特异性引物和探针核苷酸序列，具体为：
ACTBF
CTGGCATTGCCGACAGGA SEQ IDNO：34
ACTBR
AGGAGCAATGATCTTGATCTTC SEQ
IDNO：35
ACTtaqman FAM-5-AAGGAGATCACTGCCCTG-3-BHQ-MGB SEQ IDNO：36。
3.一种用于RET融合基因检测的检测试剂盒，其特征在于：包括mRNA反转录cDNA体系，所述的mRNA反转录cDNA体系用于所述的检测试剂盒的PCR反应，所述的mRNA反转录cDNA体系包括：
5×RT buffer 4µL
引物终浓度
200nM
dNTP 1mM
super RT 200U
RNA 6µL
补DEPC水至 20µL；
所述的检测试剂盒的PCR反应扩增体系为：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
4.根据权利要求3所述的用于RET融合基因检测的检测试剂盒，其特征在于：所述的mRNA反转录cDNA体系包括如下操作步骤：
步骤1：取逆转录反应混合液 13µL，super RT逆转录酶1µl，加入无菌离心管中，混匀；
步骤2：加入待测样品RNA 6µL，RNA总量在0.1～5µg范围内至20µl；
步骤3：将所述的步骤2中的样品42°保温1个小时，85°C孵育5分钟，反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却；
步骤4：逆转录产物可直接用于后续PCR反应和荧光定量PCR反应。
5.根据权利要求3所述的用于RET融合基因检测的检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒的PCR反应的条件如下。
6.一种用于RET融合基因检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：该方法至少包括如下步骤：
步骤1：根据COSMIC数据公布的人类RET基因为野生型基因序列，针对RET基因17种融合突变，来设计特异引物和探针；
步骤2：提取检测样本的RNA；
步骤3：通过荧光PCR扩增仪运行实时荧光PCR扩增反应体系；
步骤4：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
7.根据权利要求6所述的用于RET融合基因检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：在所述的步骤2中，所述的检测样本包括新鲜病理组织或石蜡包埋组织或胸腔液。
8.根据权利要求6所述的用于RET融合基因检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的步骤4还包括如下分析及判定分步骤：
步骤4.1：运行无模板对照时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况；
步骤4.2：运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，继续分析实验结果；
步骤4.3：运行MIX8的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，继续分析；如果Ct值>42.0，则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要；
步骤4.4：有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算；
步骤4.5：在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，阳性为存在融合，阴性为不存在融合；
步骤4.6：根据所述的步骤4.1至步骤4.5判定实验结果。
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| C06 | Publication | ||
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| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150701 |
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