CN109321569A

CN109321569A - 一种引物探针组合物及其应用

Info

Publication number: CN109321569A
Application number: CN201811269364.4A
Authority: CN
Inventors: 程雪涛; 吴子侠; 金丽琴; 张亚飞
Original assignee: Qiagen (suzhou) Translational Medicine Co Ltd
Current assignee: Qiagen (suzhou) Translational Medicine Co Ltd
Priority date: 2018-10-29
Filing date: 2018-10-29
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2038-10-29
Also published as: CN109321569B

Abstract

本发明提供了一种引物探针组合物及其应用，所述组合物包括四条探针及十二条引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑12所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13‑16所示；本发明针对雄激素受体V7的目的区域设计特异性的引物和探针，以引物探针组合物为基础，摸索实验条件，优化检测体系，二者相辅相成，实现高灵敏度和强特异性的检测，特异性地定量检测人类AR‑V7表达量，检测样品范围广，检测灵敏度高，操作方便，简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种引物探针组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种引物探针组合物及其应用。

背景技术

前列腺癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，雄激素受体(AR)在前列腺癌的发生、发展中起着重要作用，其通过调节下游基因的表达，促进前列腺癌的进展和转移。手术治疗仍然是早期前列腺癌的一线治疗方案，晚期前列腺癌的治疗方法主要是内分泌治疗，即雄激素剥夺治疗(ADT)。美国FDA已经批准包括CYP17A1抑制剂阿比特龙和强效抗雄激素药物恩杂鲁胺作为治疗转移性前列腺癌的二线治疗方案。但在前列腺癌的治疗过程中，常常对其产生耐药，并发展成为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。患者经阿比特龙和恩杂鲁胺治疗，AR-V7阳性患者与阴性患者相比，临床或影像学无进展生存时间和总体生存时间都明显缩短。

AR基因位于X染色体q11-12，包含由8个外显子组成的一个2757bp的阅读框架，分子质量约110kb。全长的AR(AR-FL)包含四个结构：(1)氨基端结构域(amino-terminaldomain，NTD)，由exon 1编码，包含555个氨基酸，占了AR蛋白总长度的60％左右；(2)DNA结合域(DNA binding domain，DBD)，由exon 2和3编码，包含68个氨基酸；(3)铰链区(Hingedomain，HD)，连接DBD和LBD；(4)配体结合域(Ligand binding domain，LBD)，由exon 4-8编码，包含295个氨基酸。AR-Vs的产生是通过AR基因重组、AR前mRNA剪接或基因突变等机制，AR-V7(又称AR3)是最常见的AR-Vs。AR-V7具有完整的NTD结构域和DBD结构域，但缺乏LBD结构域和铰链区，代之而起的是神秘外显子3(CE3)编码的一段短肽序列。而LBD结合域是恩杂鲁胺所针对的靶点，从而导致患者产生耐药。因此，AR-V7参与了恩杂鲁胺和阿比特龙耐药性的发展。

根据最新的研究资料表明(Anna Katharina Seitz et al.AR-V7in PeripheralWhole Blood of Patients with Castration-resistant Prostate Cancer：Associationwith Treatment-specific Outcome Under Abiraterone and Enzalutamide，EuropeanUrology,2017.)，基于数字PCR平台检验了85例用阿比特龙或恩杂鲁胺治疗的患者及28例健康人做对照，以确定AR-V7表达量的背景值。研究发现在健康人中AR-V7最高的表达量为0.6％，以此将AR-V7的表达量划分为高表达组(AR-V7/AR-FL>0.6％)与低表达组(AR-V7/AR-FL≤0.6％)。在85例用阿比特龙或恩杂鲁胺治疗的患者中高AR-V7表达水平达到18％，且无PSA应答，而仍有部分低AR-V7表达的患者有PSA应答。高AR-V7表达水平的患者无进展生存期更短(median 2.4vs 3.7months；p<0.001)，总生存期也更短(median4.0vs.13.9months；p<0.001)。有此可得出，AR-V7的表达量差异会导致CPRC患者的PSA应答(耐药性)以及生存期的差异，因此，准确检测AR-V7的表达量是十分必要的。CN108070641A公开了一套基于qPCR或数字PCR技术开发的用于检测囊泡中AR-V7及AR的引物及探针，序列分别如SEQ ID NO:1-6所示，利用所述引物及探针建立了一种基于囊泡的无创、快速、高灵敏度的AR-V7及全长AR的qPCR或数字PCR检测方法。该体系及其数字PCR方法采用单荧光检测，只能计算拷贝数，不能直接反映AR-V7在mRNA水平上的表达百分比。

数字PCR即Digital PCR(dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。其原理是将大量稀释后的含有核酸模板的PCR反应溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统PCR相比，数字PCR能够实现对模板的精准定量，且不用依赖标准品。

目前市面上尚未有成熟的，能够定量检测AR-V7表达的数字PCR试剂盒，因此，基于数字PCR技术开发一种能够精确定量AR-V7的引物探针组合物及相关检测试剂盒具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种引物探针组合物及其应用，通过针对AR-V7的目的区域进行设计特异性的引物和探针，并结合对扩增体系的优化，二者相辅相成，相互配合，实现了高灵敏度和高特异性的检测，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种引物探针组合物，所述组合物包括四条探针及十二条引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-12所示，所述探针的核苷酸序列如SEQID NO.13-16所示。

所述序列见表1；

表1

所述探针均带有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团包括FAM和VIC，所述淬灭基团包括BHQ；即SEQ ID NO.13的5’端带有FAM基团，SED ID NO.14-16的5’端带有VIC基团，SEQ ID NO.13-16的3’端带有BHQ基团。

本发明中，发明人在长期科研实践过程中，深入研究雄激素受体V7(AndrogenReceptor，AR)的检测技术的进展，为精确灵敏地实现对AR-V7的检测，将数字PCR技术应用到雄激素受体V7的检测领域，针对AR-V7的目的区域设计特异性引物和探针，摸索实验条件，优化检测体系，采用双荧光检测通道，配合多条引物探针，各方面相辅相成，经过大量实验探索验证，实现了对AR-V7的高灵敏度检测，精准高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

在PCR扩增时，引物3’末端碱基必须与模板DNA互补才能有效扩增，当引物3’末端碱基与模板形成错配时，扩增效率会大大降低；当PCR扩增时，AR-V7特异性引物的3’末端能与AR-V7基因模板完全结合，从而进行有效扩增；当AR-V7特异性引物与野生型基因模板结合时，由于3’末端形成错配，PCR扩增不能有效进行，从而达到区分突变型和野生型的目的，该设计方法可有效提高引物的特异性；同时，在SEQ ID NO.1的引物的3’末端倒数第三位碱基引入一个错配，当AR-V7特异性引物与野生型基因模板结合时，相当于有两个错配碱基，能够进一步降低非特异扩增；由于该方法是靠引物来识别突变位点，对探针的要求相对较低，因此不需要MGB探针，只用普通TaqMan探针即可实现较好的特异性，一定程度上节省了成本。

第二方面，一种数字PCR扩增体系，所述体系包括如下组分：：1×的3D数字PCR预混液，即1×的QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix、93.33-133.33ng/μL的模板cDNA、600-1000nM的引物和200-500nM探针。

其中，所述模板cDNA的浓度例如可以是93.33ng/μL、95ng/μL、98ng/μL、100ng/μL、105ng/μL、110ng/μL、115ng/μL、120ng/μL、125ng/μL、130ng/μL、133ng/μL或133.33ng/μL；即在15μL的体系内加入2μL的700-1000ng/μL的cDNA。

所述引物的浓度例如可以是600nM、700nM、800nM、900nM或1000nM。

所述探针的浓度例如可以是200nM、300nM、400nM或500nM。

其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1-12所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 13-16所示。

具体地，所述扩增体系如下(15μL)，见表1：

表1 1×digital PCR Reaction

组分	添加量
		QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix	6.0-8.0μL
模板cDNA	1.0-3.0μL
		引物	600-1000nM
探针	200-500nM
		补水至	15μL

第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物探针组合物或第二方面所述的扩增体系。

第四方面，本发明提供一种采用第一方面所述的引物探针组合物、第二方面所述的扩增体系或第三方面所述试剂盒制备检测雄激素受体V7的药物和或试剂的应用。

优选地，所述检测雄激素受体V7的方法，包括如下步骤：

(1)提取检测样本的RNA，合成cDNA；

(2)采用第一方面所述的组合物配制如第二方面所述的扩增体系；

(3)通过数字PCR仪采集荧光信号，分析得到拷贝数并计算百分表达量。

优选地，所述样品包括冷冻病理组织、新鲜病理组织或福尔马林固定石蜡包埋组织中的任意一种。

具体地，所述其方法包括以下步骤：

(1)根据NCBI数据库公布的人类AR-V7及AR-FL基因序列(NM_001348061.1；NM_000044.4)，分别设计特异性引物和探针。

(2)提取检测样本的RNA，检测样本包括冷冻或新鲜病理组织，福尔马林固定石蜡包埋组织；

(3)cDNA的合成；

(4)配制数字PCR扩增反应体系；

(5)用步骤(1)的引物和探针特异性扩增待测基因突变靶序列；

(6)通过数字PCR仪可采集并计算AR-V7及AR-FL的荧光信号点数，在结果分析时能够得到AR-V7及AR-FL的拷贝数，并计算百分比表达量。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的引物探针组合物，基于数字PCR技术，结合优化好后的检测体系，二者相辅相成，能够特异性、定量的检测人类AR-V7表达量；

(2)本发明提供的方法：建立了基于数字PCR平台，能够特异性的、定量的检测人类AR-V7表达的方法；灵敏度高，可以检测低至0.1％的表达水平；样本检测范围广，包括冷冻或新鲜病理组织，福尔马林固定石蜡包埋组织；

附图说明

图1为本发明的实施例1的质粒检测结果图；

图2为本发明的实施例2的假病毒检测结果图；

图3为本发明的实施例3的AR-V7高表达结果图；

图4为本发明的实施例3的AR-V7低表达结果图；

图5为本发明的实施例3的野生型表达结果图；

图6为本发明的实施例4的福尔马林固定石蜡包埋组织样本检测结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

本发明以NCBI数据库公布的人类AR-V7及AR-FL基因序列(NM_001348061.1；NM_000044.4)为模板，通过基因工程构建AR-V7质粒和AR-FL质粒，并构建AR-V7假病毒与AR-FL假病毒；以此工程质粒，以及假病毒RNA反转录后得到的cDNA分别作为反应模板，建立AR-V7及AR-FL数字PCR扩增反应体系，以FAM荧光为AR-V7检测通道，以VIC荧光为AR-FL检测通道，针对AR-V7以及AR-FL设计引物和探针，通过引物及检测体系的筛选优化实现高度灵敏和高度特异的检测；

所述AR-V7质粒和AR-FL质粒的序列如下：

AR-V7：SEQ ID NO.17

CATGTTTTGCCCATTGACTATTACTTTCCACCCCAGAAGACCTGCCTGATCTGTGGAGATGAAGCTTCTGGGTGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGGAAGCTGCAAGGTCTTCTTCAAAAGAGCCGCTGAAGGGAAACAGAAGTACCTGTGCGCCAGCAGAAATGATTGCACTATTGATAAATTCCGAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGCAGGGATGACTCTGGGAGAAAAATTCCGGGTTGGCAATTGCAAGCATCTCAAAATGACCAGACCCTGAAGAAAGGCTGACTTGCCTCATTCAAAAATGAGGGCTCTAGAGGGCTCTAGTGGATAGTCTGGAGAAACCTGGCGTCTGAGGCTTAGGAGCTTAGGTTTTTGCTCCTCAACACAGACTTTGACGTTGGGGTTGGGGGCTACTCTCTTGATTGCTGACTCCCTCCAGCGGGACCAATAGTGTTTTCCTACCTCACAGGGATGTTGTGAGGACGGGCTGTAGAAGTAATAGTGGTTACCATTCATGTAGTTGTGA

AR-FL:SEQ ID NO.18

GGATGTACAGCCAGTGTGTCCGAATGAGGCACCTCTCTCAAGAGTTTGGATGGCTCCAAATCACCCCCCAGGAATTCCTGTGCATGAAAGCACTGCTACTCTTCAGCATTATTCCAGTGGATGGGCTGAAAAATCAAAAATTCTTTGATGAACTTCGAATGAACTACATCAAGGAACTCGATCGTATCATTGCATGCAAAAGAAAAAATCCCACATCCTGCTCAAGACGCTTCTACCAGCTCACCAAGCTCCTGGACTCCGTGCAGCCTATTGCGAGAGAGCTGCATCAGTTCACTTTTGACCTGCTAATCAAGTCACACATGGTGAGCGTGGACTTTCCGGAAATGATGGCAGAGATCATCTCTGTGCAAGTGCCCAAGATCCTTTCTGGGAAAGTCAAGCCCATCTATTTCCACACCCAGTGAAGCATTGGAAACCCTATTTCCCCACCCCAGCTCATGCCCCCTTTCAGATGTCTTCTGCCTGTTATAACTCTGCA

检测AR-V7以及AR-FL的方法包括以下步骤：

(1)针对AR-V7以及AR-FL设计特异性引物和探针：

根据NCBI数据库公布的人类AR-V7及AR-FL基因序列(NM_001348061.1；NM_000044.4)，通过PrimerExpress软件针对目的区域分别设计特异性引物和探针，通过引物及检测体系的筛选和优化实现高度灵敏和高度特异的检测。

(2)样本处理与RNA提取：

样本使用范围包括：冷冻或新鲜病理组织，福尔马林固定石蜡包埋组织。冷冻或新鲜病理组织，取不少于30mg，用QIAGEN试剂盒RNeasy mini kit提取RNA；福尔马林固定石蜡包埋组织，切片5-10μm厚，取2-3片组织，用QIAGEN试剂盒RNeasy FFEP kit提取RNA；上述具体操作步骤按试剂盒说明书操作。所提取的RNA用微量紫外分光光度计检测其浓度与纯度。

(3)cDNA合成：

使用Takara试剂盒PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，以上述所提取的RNA作为模板，合成cDNA；具体操作步骤按试剂盒说明书操作。所得到的cDNA用微量紫外分光光度计检测其浓度。

(4)建立数字PCR反应体系

以上述质检合格的cDNA为模板，建立如下数字PCR反应体系，见表1：

表1 1×digital PCR Reaction

制备数字PCR反应芯片，使反应体系均匀分布到芯片中，制备方法按照ABIQuantStudio 3D Digital PCR仪器说明书进行操作；制备好反应芯片后，将芯片放入PCR仪进行扩增，其PCR扩增程序如下：1)：96℃10min；2)：60℃2min，98℃30s，39个循环；3)：60℃2min，15℃∞。

(5)读取荧光信号，分析结果

扩增完成后，将芯片放入数字PCR读取仪，导出读取结果后，通过仪器自带软件可自动采集并计算AR-V7及AR-FL的荧光信号点数，在结果分析时能够得到AR-V7及AR-FL的拷贝数，并计算百分比表达量。

以下结合具体实施例，进一步对本发明进行阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本发明所述的科学术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。

实施例1

本实施例以质粒检测本发明体系，通过基因工程构建的AR-V7质粒模板和AR-FL质粒模板各1株，利用本发明实施数字PCR检测如下：

(1)质粒构建与处理：

根据NCBI数据库公布的人类AR-V7及AR-FL基因序列(NM_001348061.1；NM_000044.4)分别构建AR-V7质粒和AR-FL质粒；两种质粒分别溶于超纯水中，用微量分光光度计NanoDrop One进行质控，并测定其浓度，将两种质粒按照AR-V7/AR-FL的比例分别为1％，0.6％以及0.1％进行混合，然后调整质粒浓度到5000拷贝/uL，取2uL作为数字PCR模板进行PCR扩增，每种比例的模板做2个重复。

(2)建立数字PCR扩增反应体系：

将上述所得质粒作为模板，作为实时数字PCR扩增的模板，按如下扩增体系和程序进行PCR扩增。

其PCR扩增体系如下：

表1 1×digital PCR Reaction

制备数字PCR反应芯片，使反应体系均匀分布到芯片中；制备方法按照ABIQuantStudio 3D Digital PCR仪器说明书进行操作；制备好反应芯片后，将芯片放入PCR仪进行扩增，其PCR扩增程序如下：

1)：96℃10min；2)：60℃2min，98℃30s，39个循环；3)：60℃2min，15℃∞。

(3)读取荧光信号，分析结果

扩增完成后，将芯片放入数字PCR读取仪，导出读取结果后，通过仪器自带软件可自动采集并计算AR-V7及AR-FL的荧光信号点数，在结果分析时能够得到AR-V7及AR-FL的拷贝数，并计算百分比表达量；

AR-V7/AR-FL＝0.1％的质粒检测结果如图1；检测结果表明，本发明的检测体系可特异性检测质粒AR-V7及质粒AR-FL，1％、0.6％和0.1％定量结果准确且可重复，最低可检测至0.1％的AR-V7。

实施例2

本实施例以假病毒检测本发明体系，通过生物工程构建的AR-V7假病毒和AR-FL假病毒各1株(委托厦门致善生物科技股份有限公司制备，以SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18的质粒序列合成RNA然后包括噬菌体蛋白质外壳，形成装甲RNA，模拟病毒结构)；

利用本发明实施数字PCR检测如下：

(1)假病毒构建与处理：

根据NCBI数据库公布的人类AR-V7及AR-FL基因序列(NM_001348061.1；NM_000044.4)分别构建AR-V7假病毒和AR-FL假病毒；两种假病毒分别置于95℃5min得到假病毒RNA，用微量紫外分光光度计进行质控，并测定其浓度，将两种假病毒RNA按照AR-V7/AR-FL的比例分别为1％，0.6％以及0.1％进行混合，然后调整假病毒RNA浓度到10^9拷贝/uL，取2uL作为cDNA合成的模板。

(2)cDNA合成：

(3)建立数字PCR扩增反应体系：

将上述合格的cDNA模板，作为实时数字PCR扩增的模板，按如下扩增体系和程序进行PCR扩增。

其PCR扩增体系如下：

表1 1×digital PCR Reaction

组分	添加量
		QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix	6.0μL
模板cDNA	1.0μL
		引物	600nM
探针	200nM
		补水至	15μL

制备数字PCR反应芯片，使反应体系均匀分布到芯片中。制备方法按照ABIQuantStudio 3D Digital PCR仪器说明书进行操作；制备好反应芯片后，将芯片放入PCR仪进行扩增，其PCR扩增程序如下：

(3)读取荧光信号，分析结果

AR-V7/AR-FL＝0.1％的假病毒检测结果如图2；该检测结果表明，本发明的检测体系可特异性检测假病毒AR-V7及假病毒AR-FL，1％、0.6％和0.1％定量结果准确且可重复，最低可检测至0.1％的AR-V7。

实施例3

本实施例以新鲜组织样本RNA检测本发明体系，取送本公司待测的临床前列腺癌新鲜组织样本4例；利用本发明实施数字PCR检测如下：

(1)样本处理与提取：

取不少于30mg样本，用QIAGEN试剂盒RNeasy mini kit提取RNA，提取步骤按照试剂盒说明书进行操作；所提取的RNA用微量紫外分光光度计检测其浓度。

(2)cDNA合成：

(3)建立数字PCR扩增反应体系：

其PCR扩增体系如下：

表1 1×digital PCR Reaction

组分	添加量
		QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix	8.0μL
模板cDNA	3.0μL
		引物	1000nM
探针	500nM
		补水至	15μL

(3)读取荧光信号，分析结果

检测结果中AR-V7高表达2例(AR-V7/AR-FL>0.6％)(图3)，低表达1例(0.1％≤AR-V7/AR-FL≤0.6％)(图4)，野生型(或AR-V7表达量低于0.1％)1例(图5)，该检测结果表明，本发明的检测体系可特异性定量检测雄激素受体V7(AR-V7)在临床新鲜组织样本中的表达量。

实施例4

本实施例以福尔马林固定石蜡包埋组织RNA检测本发明体系，取送本公司待测的临床前列腺癌福尔马林固定石蜡包埋组织1例；利用本发明实施数字PCR检测如下：

(1)样本处理与提取：

石蜡切片5-10μm厚，取2-3片组织，用QIAGEN试剂盒RNeasy FFEP kit提取RNA；上述具体操作步骤按试剂盒说明书操作；所提取的RNA用微量紫外分光光度计检测其浓度与纯度。

(2)cDNA合成：

(3)建立数字PCR扩增反应体系：

其PCR扩增体系如下：

表1 1×digital PCR Reaction

组分	添加量
		QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix	7.5μL
模板cDNA	2.0μL
		引物	900nM
探针	250nM
		补水至	15μL

3)读取荧光信号，分析结果

一例福尔马林固定石蜡包埋组织样本检测结果如图6；检测结果为AR-V7高表达(AR-V7/AR-FL>0.6％)，该检测结果表明，本发明的检测体系可特异性定量检测雄激素受体V7(AR-V7)在福尔马林固定石蜡包埋组织样本中的表达量。

图1-图6的结果数值见表2；

表2

对比例1

与实施例4相比，除了引物SEQ ID NO.1的3’末端倒数第三位碱基不引入错配，将样品改为阴性对照AR-FL野生型的质粒外，其他条件与实施例1相同。

对比例2

与实施例4相比，除了模板cDNA添加量改为5μL外，其他条件与实施例1相同。

对比例3

与实施例4相比，除了引物的浓度改为300nM外，其他条件与实施例1相同。

对比例4

与实施例4相比，除了探针的浓度改为50nM外，其他条件与实施例1相同。

经检测，对比例1出现AR-V7的假阳性结果，对比例2的数字PCR结果图上FAM和VIC信号的点不能成簇分布，导致FAM和VIC信号不能有效区分，从而影响AR-V7和AR-FL的拷贝数计数和百分比的计算，对比例3检测结果均为假阴性结果，即AR-V7即检测不到其表达或低表达，对比例4的荧光信号偏弱，导致无法与空白点有效区分，从而影响AR-V7和AR-FL的拷贝数计数和百分比的计算，表明本发明提供的优化后的扩增体系能与引物探针相配合，不采用本发明提供的引物或浓度超范围后，即无法实现高灵敏度和高准确度的检测。

综上所述，提供了一种引物探针组合物及其应用，所述组合物包括四条探针及十二条引物；针对雄激素受体V7的目的区域设计特异性的引物和探针，以引物探针组合物为基础，摸索实验条件，优化检测体系，二者相辅相成，实现高灵敏度和强特异性的检测，特异性地定量检测人类AR-V7表达量，检测样品范围广，检测灵敏度高，操作方便，简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 凯杰（苏州）转化医学研究有限公司

<120> 一种引物探针组合物及其应用

<130> 2018年

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcagggatga ctctgggtga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcagggatga ctctgggaga 20

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccatcttgtc gtcttcggaa atgttatgaa gc 32

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

caaaagagcc gctgaaggg 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tcctaagcct cagacgccag 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctttcttcag ggtctggtca ttt 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ctggactccg tgcagcctat 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cttgggcact tgcacagaga t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

catcctgctc aagacgcttc t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

atgcagctct ctcgcaatag g 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ggcacctctc tcaagagttt gg 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cagtgctttc atgcacagga a 21

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ccgggttggc aattgcaagc atctc 25

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

cgagagagct gcatcagttc acttttgacc 30

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ccagctcacc aagctcctgg actcc 25

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

tggctccaaa tcacccccca gg 22

<210> 17

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

catgttttgc ccattgacta ttactttcca ccccagaaga cctgcctgat ctgtggagat 60

gaagcttctg ggtgtcacta tggagctctc acatgtggaa gctgcaaggt cttcttcaaa 120

agagccgctg aagggaaaca gaagtacctg tgcgccagca gaaatgattg cactattgat 180

aaattccgaa ggaaaaattg tccatcttgt cgtcttcgga aatgttatga agcagggatg 240

actctgggag aaaaattccg ggttggcaat tgcaagcatc tcaaaatgac cagaccctga 300

agaaaggctg acttgcctca ttcaaaaatg agggctctag agggctctag tggatagtct 360

ggagaaacct ggcgtctgag gcttaggagc ttaggttttt gctcctcaac acagactttg 420

acgttggggt tgggggctac tctcttgatt gctgactccc tccagcggga ccaatagtgt 480

tttcctacct cacagggatg ttgtgaggac gggctgtaga agtaatagtg gttaccattc 540

atgtagttgt ga 552

<210> 18

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ggatgtacag ccagtgtgtc cgaatgaggc acctctctca agagtttgga tggctccaaa 60

tcacccccca ggaattcctg tgcatgaaag cactgctact cttcagcatt attccagtgg 120

atgggctgaa aaatcaaaaa ttctttgatg aacttcgaat gaactacatc aaggaactcg 180

atcgtatcat tgcatgcaaa agaaaaaatc ccacatcctg ctcaagacgc ttctaccagc 240

tcaccaagct cctggactcc gtgcagccta ttgcgagaga gctgcatcag ttcacttttg 300

acctgctaat caagtcacac atggtgagcg tggactttcc ggaaatgatg gcagagatca 360

tctctgtgca agtgcccaag atcctttctg ggaaagtcaa gcccatctat ttccacaccc 420

agtgaagcat tggaaaccct atttccccac cccagctcat gccccctttc agatgtcttc 480

tgcctgttat aactctgca 499

Claims

1.一种引物探针组合物，其特征在于，所述组合物包括四条探针及十二条引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-12所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-16所示。

2.一种数字PCR扩增体系，其特征在于，所述体系包括如下组分：1×的3D数字PCR预混液、93.33-133.33ng/μL的模板cDNA、600-1000nM的引物和200-500nM探针；

其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-12所示，所述探针的核苷酸序列如SEQID NO.13-16所示。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合物或权利要求2所述的扩增体系。

4.一种采用权利要求1所述的引物探针组合物、权利要求2所述的扩增体系或权利要求3所述试剂盒制备检测雄激素受体V7的药物和或试剂的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测雄激素受体V7的方法包括如下步骤：

(1)提取检测样本的RNA，合成cDNA；

(2)采用权利要求1所述的组合物配制如权利要求2所述的扩增体系；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样品包括冷冻病理组织、新鲜病理组织或福尔马林固定石蜡包埋组织中的任意一种。