CN105063049A - 用于肝癌预后评估的微小核酸序列、探针以及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肝癌检测领域，特别涉及用于肝癌预后评估的微小核酸序列、探针以及试剂盒。用于肝癌预后评估的微小核酸序列包括SEQ？ID？No.1-SEQ？ID？No.12核酸序列中的任一种或多种。本发明还提供了根据上述微小核酸序列制备的探针和用于肝癌预后评估的试剂盒，该试剂盒含有根据SEQ？ID？No.1-SEQ？ID？No.12所示核酸序列制备的探针，将特异微小核酸分子作为分子标记，利用特异微小核酸分子的特异性探针，结合原位杂交探针试剂，检测特异微小核酸分子在肝癌组织中的表达量，预测肝细胞癌手术后复发、转移等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监控和治疗具有非常重要的指导意义。

Description

用于肝癌预后评估的微小核酸序列、探针以及试剂盒

技术领域

本发明涉及肝癌检测领域，具体而言，涉及用于肝癌预后评估的微小核酸序列、探针以及试剂盒。

背景技术

原发性肝癌是世界第五大常见恶性肿瘤，超过90％的原发性肝癌是肝细胞性肝癌(HepatocellularCarcinomas,HCCs，简称肝癌)。我国是肝癌高发地区，其死亡率在恶性肿瘤中上升至第二位。但是，HCC患者就诊时往往已是晚期，出现包括远处转移或肝内转移等并发症，手术的根治性切除率很低，预后通常很差，而转移复发也一直是影响肝癌治疗效果的重要因素。肝癌的转移是一个涉及许多调控因素的复杂过程。目前已知有肝癌及间质细胞遗传学与表面遗传学的改变引起的基因、细胞表面结构和粘附能力、局部血管生成能力、细胞代谢功能以及癌细胞与宿主、癌细胞与细胞间质之间相互作用等过程的改变参与肝癌的转移。

肿瘤侵袭和转移过程中癌细胞和癌旁基质之间的相互调节作为一个动态系统已被广泛研究。由于肝细胞癌引起死亡的主要原因是肿瘤的进展和转移，因此深入研究肿瘤转移过程中重要的节点分子将有助于系统性阐述肝癌转移的分子机理。微小核酸分子的发现描述了一种全新的基因活动形式，即转录后翻译水平的修饰。大量互相影响并且在幕后控制分子的微小核酸分子参与了这种活动。近年来，有大量关于促转移和抑制转移基因、微小核酸分子和细胞代谢在肝癌转移中作用机制的研究，在一定程度上揭示了肝癌的转移复发的调控机制。但是对于肝细胞癌的基础研究和临床治疗而言，一个必须重视的命题是对肝细胞癌的预后影响因素进行深入研究。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于肝癌预后评估的微小核酸序列，所述的微小核酸序列在肝癌中高表达，除了可影响肝癌干细胞的生长，化疗抵抗及自我更新能力之外，还可以通过靶向抑制其他分子调节肝癌细胞的转移侵袭能力。通过对这些肝癌特异性的微小核酸进行检测，可预测肝细胞癌手术后复发、转移等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监控和序贯治疗具有非常重要的指导意义。

本发明的第二目的在于提供一种探针，该探针根据SEQIDNo.1-SEQIDNo.12所示核酸序列制得，利用该探针通过原位杂交的方法检测微小核酸序列，灵敏度高，特异性强。

本发明的第三目的在于提供一种试剂盒，该试剂盒含有上述探针，该试剂盒针对这些肝癌特异性的微小核酸进行检测，可预测肝细胞癌手术后复发、转移等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监控和治疗具有非常重要的指导意义。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种用于肝癌预后评估的微小核酸序列，包括SEQIDNo.1-SEQIDNo.12核酸序列中的任一种或多种。

SEQIDNo.1-SEQIDNo.12核酸序列具体如下：

SEQNo.1：5’-UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3’

SEQNo.2：5’-TAATACTGTCTGGTAAAACCGT-3’

SEQNo.3：5’-ACGGUUUUACCAGACAGUAUUA-3’

SEQNo.4：5’-ACGGTTTTACCAGACAGTATTA-3’

SEQNo.5：5’-UGAGGUUGGUGUACUGUGUGUGA-3’

SEQNo.6：5’-TGAGGTTGGTGTACTGTGTGTGA-3’

SEQNo.7：5’-UCACACACAGUACACCAACCUCA-3’

SEQNo.8：5’-TCACACACAGTACACCAACCTCA-3’

SEQNo.9：5’-CUGCGCAAGCUACUGCCUUGCU-3’

SEQNo.10：5’-CTGCGCAAGCTACTGCCTTGCT-3’

SEQNo.11：5’-AGCAAGGCAGUAGCUUGCGCAG-3’

SEQNo.12：5’-AGCAAGGCAGTAGCTTGCGCAG-3’。

本发明通过收集临床肝癌病人门静脉癌栓/肝癌原发灶/癌旁正常肝组织新鲜冰冻配对样本，利用实时定量PCR对门静脉癌栓/肝癌原发灶/癌旁正常肝组织样本中特异微小核酸分子的表达水平进行验证，再利用锁核酸(LNA)探针-原位杂交技术，检测特异微小核酸分子在门静脉癌栓/肝癌原发灶/癌旁正常肝组织样本的表达丰度。结果发现特异微小核酸分子在门静脉癌栓中高表达，且在肝癌原发灶及癌旁正常组织中的表达逐渐降低，并可以通过靶向抑制其他分子调节肝癌细胞的转移侵袭能力，表明特异微小核酸分子表达水平可作为肝癌转移复发的潜在预测指标。

经验证，对SEQIDNo.1-SEQIDNo.4核酸序列中的任一种进行检测，可用于肝癌预后评估，特异性好，反应灵敏，可靠性更高。优选地，包括SEQIDNo.1-SEQIDNo.4核酸序列中的任一种。

更优选地，包括SEQIDNo.1核酸序列。

本发明还提供了根据上述微小核酸序列制备的探针。

该探针根据SEQIDNo.1-SEQIDNo.12所示核酸序列制得，利用该探针通过原位杂交的方法检测微小核酸序列，灵敏度高，特异性强。

优选地，所述探针与SEQIDNo.1-SEQIDNo.12所示核酸序列和/或其互补序列的全部或连续15个以上核苷酸片段互补。即可达到检测的特异性和灵敏度的要求。

微小核酸分子的特异性探针，为可任意能够特异性与特异微小核酸分子结合的脱氧/核糖核酸探针，或经过修饰、标记的核酸片段。进一步地，所述探针为脱氧核糖核酸探针或核糖核酸探针。

进一步地，所述探针包括锁核酸探针、荧光探针、地高辛标记探针、生物素标记探针中的任一种。以这些标记物制备的探针，得到的检测信号便于区分。

本发明还提供了一种用于肝癌预后评估的试剂盒，包括上述的探针。

该试剂盒含有根据SEQIDNo.1-SEQIDNo.12所示核酸序列制备的探针，将特异微小核酸分子作为分子标记，利用特异微小核酸分子的特异性探针，结合原位杂交探针试剂，检测特异微小核酸分子在肝癌组织中的表达量，预测肝细胞癌手术后复发、转移等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监控和治疗具有非常重要的指导意义。

为了便于检测，优选地，所述试剂盒还包括原位杂交试剂。

根据原位杂交的需要，可选择原位杂交试剂。进一步地，所述原位杂交试剂包括但并不限于以下这些试剂：二甲苯、乙醇、DEPC水、PBS、蛋白酶K、甘氨酸、PBS、多聚甲醛、杂交液、清洗液、封闭液、平衡液、显色剂。

采用微小核酸序列能够进行肝癌预后评估，步骤如下：

制备待检测样本的组织芯片；

将所述组织芯片进行原位杂交，所述原位杂交采用的探针为本发明提供的根据SEQIDNo.1-SEQIDNo.12所示核酸序列制备；

根据原位杂交后的组织芯片的信号强度进行判断。

为了使检测的样本可靠性更高，进一步地，所述组织芯片由组织芯片制作仪制备，所述组织芯片的厚度为3-5μm。

利用组织芯片制作仪依次从供体蜡块上穿取直径为1mm的组织芯，插入有240个点阵的受体蜡块中，以3-5μm的厚度连续切片即得。

通过对供体组织的多个位点测定，以增加准确性。

进一步地，所述组织芯片的信号强度通过生物图像处理软件分析得到。通过生物图像处理软件对得到的信号强度进行分析，方便快捷，并减少人为操作的误差。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了一种用于肝癌预后评估的微小核酸序列，所述的微小核酸序列在肝癌中高表达，除了可影响肝癌干细胞的生长，化疗抵抗及自我更新能力之外，还可以通过靶向抑制其他分子调节肝癌细胞的转移侵袭能力。通过对这些肝癌特异性的微小核酸进行检测，可预测肝细胞癌手术后复发、转移等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监控和序贯治疗具有非常重要的指导意义。

(2)本发明还提供了一种探针，该探针根据SEQIDNo.1-SEQIDNo.12所示核酸序列制得，利用该探针通过原位杂交的方法检测微小核酸序列，灵敏度高，特异性强。

(3)本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒含有根据SEQIDNo.1-SEQIDNo.12所示核酸序列制备的探针，通过探针对这些肝癌特异性的微小核酸进行检测，可预测肝细胞癌手术后复发、转移等事件，并判断预后，对于肝细胞癌病人术后监控和治疗具有非常重要的指导意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中不同肝组织样本中的特异微小核酸分子表达水平图；

图2为本发明实施例2中基于肝癌病人组织芯片的锁核酸原位杂交实验制备的石蜡切片样本中特异微小核酸分子染色强度评分标准示意图；

图3为本发明实施例2中对207例肝癌病人的组织芯片进行预后评估的生存期曲线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。

实施例1

特异微小核酸分子在肝癌门静脉癌栓中的表达

1.临床组织样本的选取：

临床组织样本来源于上海某医院，以上样本均获得本人的知情同意，获取18例肝癌组织样本及其配对门静脉癌栓，癌旁正常肝组织。

2.特异微小核酸分子在肝癌门静脉癌栓中表达异常：

对18例HCC病人的门静脉癌栓(PVTT)/原发灶/癌旁正常肝组织样本中的特异微小核酸分子(SEQIDNo.1-SEQIDNo.4)表达水平进行的定量PCR检测。

具体为：将各个待检测样本分别提取RNA，然后反转录成cDNA，用探针进行定量PCR检测。

其中，定量PCR检测所使用的反转录、上下游引物及探针，如下所示：

反转录引物如SEQIDNo.13所示：

5’-TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACGGTTTTACCAG-3’；

上游引物如SEQIDNo.14所示：

5’-ACACTCCAGCTGGGTAATACTGTCTGGTA-3’；

下游引物如SEQIDNo.15所示：

5’-GTACGACTCACTATAGGGACTCAACTGGTGTCGTGGAG

-3’；

探针如SEQIDNo.16所示：

5’-TTCAGTTGAGAGCAAGGCAGTAG-3’。

检测的微小核酸序列为SEQIDNo.1-SEQIDNo.4所示的核酸序列。

其中，SEQIDNo.1所示的微小核酸序列的表达结果如图1所示。

图1结果显示：在门静脉癌栓/原发灶/癌旁正常肝组织中，SEQIDNo.1所示的特异微小核酸分子的表达逐渐降低，这表明，该特异微小核酸分子在肝癌转移过程中表达升高。

同样地，SEQIDNo.2-SEQIDNo.4核酸序列在门静脉癌栓/原发灶/癌旁正常肝组织中的表达状况同SEQIDNo.1所示的特异微小核酸分子。

另外，同样的方法对SEQIDNo.5-SEQIDNo.12核酸序列在门静脉癌栓/原发灶/癌旁正常肝组织中进行表达检测，结果与SEQIDNo.1所示的特异微小核酸分子一致。

实施例2

1.试剂盒组成如下：

1)地高辛标记的SEQIDNo.1所示的特异微小核酸分子原位杂交锁核酸探针的核酸序列如SEQIDNo.16所示：

5’-TTCAGTTGAGAGCAAGGCAGTAG-3’；该探针可自行合成或从丹麦Exiqon公司购买；

2)地高辛标记的阳性对照U6SnRNA的原位杂交锁核酸探针的核酸序列如SEQIDNo.17所示：

5’-CGCAGGGGCCATGCTAAT-3’，该探针可自行合成或从丹麦Exiqon公司购买；

3)原位杂交试剂：

二甲苯，乙醇，DEPC水，PBS，蛋白酶K，甘氨酸，PBS，多聚甲醛，杂交液，清洗液，封闭液，平衡液，显色剂，各试剂的具体浓度见原位杂交步骤中所用的浓度。

2.使用上述试剂盒进行检测：

1)组织芯片的构建：

显微镜下对所需穿取的目标组织进行定位，分别选取有代表性的癌和癌旁组织各3个位点，利用组织芯片制作仪依次从供体蜡块上穿取直径为1mm的组织芯，全部插入受体蜡块中。然后，以4μm的厚度连续切片2-3片，其中1片切片用作阳性对照，利用阳性对照探针进行原位杂交分析；第二片切片作为特异微小核酸分子检测，利用特异微小核酸分子探针进行原位杂交分析；第三片切片备用。所得的组织芯片的每个点都经过病理诊断。

2)原位杂交步骤如下：

(1)脱蜡至水

(2)脱蛋白

(3)杂交

(4)免疫显色

3.结果判定方法：

利用生物图像处理软件分析整张组织芯片阳性信号强度，生物图像处理软件可采用(但不仅限于)ImageScope(Aperio公司)软件，对组织芯片进行扫描，每个样本的癌(3个位点)和癌旁组织(3个位点)给出评分。

评分的规则如下：

首先检查阳性对照组的显色情况，癌和癌旁组织的6个位点均需显示出明显的染色(评分需>1分)；随后根据3个位点评分的平均分分别计算癌及癌旁组织中特异微小核酸分子的相对表达量水平。

若癌组织3个位点评分的平均分高于癌旁组织3个位点评分的平均分，则判定为特异微小核酸分子高表达组，相反为低表达组。

其中，以图2为例对切片后的癌及癌旁组织染色强度进行评分。

用本发明提供的试剂盒对207例肝癌病人的组织芯片进行分析后发现：

1)SEQIDNo.1特异微小核酸分子高表达组和低表达组在肿瘤体积(p＝0.0003)、数量(p＝0.0126)、微血管侵润(p＝0.0001)这3项临床病理特征上具有显著性差异，且与该特异微小核酸分子表达水平呈正相关具体见表1所示。

表1特异微小核酸分子与不同指标之间的关系

其中，表1中的直径表示如下：

肿瘤直径分3个评估阶段：<3cm组；3-5cm组；>5cm组；

微小核酸低表达组在肿瘤直径分布的情况是：<3cm组有29例病人；3-5cm组有47例病人；>5cm组有41例病人；

微小核酸高表达组在肿瘤直径分布的情况是：<3cm组仅有8例病人；3-5cm组有25例病人；>5cm组则有57例病人。

P值为0.0003，说明微小核酸低表达组与微小核酸高表达组在肿瘤直径分布的情况中有显著性差异。

表1中的肿瘤数目表示如下：

在微小核酸低表达组，单肿瘤数目有98例病人；多肿瘤数目有19例病人；

在微小核酸高表达组，单肿瘤数目有62例病人；多肿瘤数目有28例病人。

P值为0.0126，说明微小核酸低表达组与微小核酸高表达组在肿瘤数目的情况中有显著性差异。

表1中的微血管侵润表示如下：

在微小核酸低表达组，微血管侵润有52例病人；非微血管侵润有65例病人；

在微小核酸高表达组，微血管侵润有67例病人；非微血管侵润有23例病人。

P值为0.0001，说明微小核酸低表达组与微小核酸高表达组在微血管是否侵润情况中有显著性差异。

2)特异微小核酸分子高表达的病人与低表达的病人相比，无复发生存率和总体生存率如图3所示。从图3可以看出，其总体生存期(51.4月vs.32.1月，p<0.001)与无复发生存期(42.1月vs.23.4月,p<0.001)显著缩短。

SEQIDNo.2-SEQIDNo.12所示的每个特异微小核酸分子均采用实施例2的207例肝癌病人的组织芯片和方法进行测定，结果均与SEQIDNo.1一致。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种用于肝癌预后评估的微小核酸序列，其特征在于，包括SEQIDNo.1-SEQIDNo.12核酸序列中的任一种或多种。

2.根据权利要求1所述的微小核酸序列，其特征在于，包括SEQIDNo.1-SEQIDNo.4核酸序列中的任一种。

3.根据权利要求1所述的微小核酸序列，其特征在于，包括SEQIDNo.1核酸序列。

4.一种根据权利要求1-3任一项所述的微小核酸序列制备的探针。

5.根据权利要求4所述的探针，其特征在于，所述探针与SEQIDNo.1-SEQIDNo.12所示核酸序列和/或其互补序列的全部或连续15个以上核苷酸片段互补。

6.根据权利要求4所述的探针，其特征在于，所述探针为脱氧核糖核酸探针或核糖核酸探针。

7.根据权利要求4所述的探针，其特征在于，所述探针包括锁核酸探针、荧光探针、地高辛标记探针、生物素标记探针中的任一种。

8.一种用于肝癌预后评估的试剂盒，其特征在于，包括权利要求4-7任一项所述的探针。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括原位杂交试剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述原位杂交试剂包括：二甲苯、乙醇、DEPC水、PBS、蛋白酶K、甘氨酸、PBS、多聚甲醛、杂交液、清洗液、封闭液、平衡液、显色剂。