CN104878086A - 肿瘤的分子谱分析 - Google Patents

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Abstract

本申请提供疾病如癌症的分子谱分析的方法和系统。在一些实施方案中，分子谱分析可以用于确定用于疾病的治疗，如最初未被确定为疾病治疗或预期不是特定疾病的治疗。

Description

肿瘤的分子谱分析
本申请是申请日为2010年02月11日、申请号为201080016438.9、发明名称为“肿瘤的分子谱分析”的发明专利申请的分案申请。
交叉引用
本申请要求2009年2月11日提交的美国临时专利申请61/151,758、2009年4月17日提交的美国临时专利申请61/170,565和2009年7月29日提交的美国临时专利申请61/229,686的优先权，所有这些申请均通过引用全文并入本文。
背景
患者的疾病状态一般用根据基于临床的标准选择的治疗方案或疗法来治疗；即，根据患者已经被诊断为特定疾病的决定因素(已经从传统诊断试验作出诊断)为患者选择治疗或方案。尽管各种疾病状态的分子机制是多年来研究的主题，但是患病个体的分子谱在确定用于该个体的治疗方案和疗法中的特定应用是疾病特异性的，并且没有广泛使用。
已经使用分子谱分析结合患者的临床表征确定了一些治疗方案，该临床表征例如是医生的观察(如国际疾病分类编码，例如，确定该编码的日期)、实验室检验结果、x-射线、活检结果、患者主诉和医生一般依据其作出特定疾病的诊断的任何其它医疗信息。但是，使用基于分子谱分析的选择材料和临床表征(例如特定癌症类型的诊断)的组合确定治疗方案或疗法存在对特定个体的有效治疗方案可能被忽略的危险，因为某些治疗方案可能对不同疾病状态有效，即使它们与治疗特定类型的疾病状态有关。
患有难治的和转移的癌症的患者是经治医生特别关注的。大多数转移癌患者最终用尽对于其肿瘤的治疗选择。这些患者在肿瘤进展后使用标准前线和二线(有时三线和以上)治疗具有极其有限的选择。尽管这些患者可以加入新抗癌药的I期和II期临床试验，但是他们通常必须满足非常严格的入组标准。研究表明，当患者加入这些类型的试验时，新抗癌药在I期研究中可以产生平均5％-10％的应答率，在II期研究中可以产生5％-12％的应答率。这些患者也具有接受最佳支持性疗法以治疗其症状的选择。
最近对开发更加针对细胞表面受体或上调的或扩增的基因产物的新抗癌药具有强烈的兴趣。该方法满足某些成功(例如抗乳腺癌细胞中的HER2/neu的曲妥珠单抗、抗淋巴瘤细胞中的CD20的利妥昔单抗、抗VEGF的贝伐珠单抗和抗EGFR的西妥昔单抗)。然而，尽管有这些治疗，患者的肿瘤最后仍然进展。如果在患者的肿瘤中检测了大量的靶标或分子发现如分子机制、基因、基因表达的蛋白质和/或它们的组合，可以发现额外的可以使用特定治疗剂针对研究的靶标或分子发现。确定多种能够治疗多种靶标或基础机制的药物将为癌症患者提供可替代现有治疗方案的可行的治疗选择。
分子谱分析分析确定一种或多种个别谱，该谱推动更具信息的和有效的个性化治疗选择，它可导致改善的患者医护和提高的治疗结果。本发明提供通过对来自个体的样品进行分子谱分析确定用于这些个体的治疗的方法和系统。
发明内容
本发明提供用于分子谱分析的方法和系统，使用来自分子谱分析的结果确定对个体的治疗。在一些实施方案中，所述治疗在开始时未被确定为对于该疾病的治疗。
在一方面，本发明提供了一种确定用于需要的受试者的候选治疗的方法，包括：对来自该受试者的样品进行免疫组化(IHC)分析以确定至少五种蛋白质的IHC表达谱；对该样品进行微阵列分析以确定至少10种基因的微阵列表达谱；对该样品进行荧光原位杂交(FISH)分析以确定至少一种基因的FISH突变谱；对该样品进行DNA测序以确定至少一种基因的测序突变谱；和相对于规则数据库比较IHC表达谱、微阵列表达谱、FISH突变谱和测序突变谱。该规则数据库包含其对癌细胞的生物活性已知的治疗图谱，该癌细胞：i)过表达或欠表达IHC表达谱中包括的一种或多种蛋白质；ii)过表达或欠表达微阵列表达谱中包括的一种或多种基因；iii)在FISH突变谱中包括的一种或多种基因中没有突变或具有一个或多个突变；和/或iv)在测序突变谱中包括的一种或多种基因中没有突变或具有一个或多个突变。如果：i)比较步骤表明该治疗应当对癌症具有生物活性；和ii)比较步骤没有表明该治疗不能用于治疗癌症，则确定为候选治疗。
在一些实施方案中，IHC表达谱分析包括测定SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c-kit、AR、CD52、PDGFR、TOP2A、TS、ERCC1、RRM1、BCRP、TOPO1、PTEN、MGMT和MRP1中的一种或多种。
在一些实施方案中，微阵列表达谱分析包括测定ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGF1、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCC1、ERCC3、ESR1、FLT1、FOLR2、FYN、GART、GNRH1、GSTP1、HCK、HDAC1、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、MGMT、MLH1、MS4A1、MSH2、NFKB1、NFKB2、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA1、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1和ZAP70中的一种或多种。
在一些实施方案中，FISH突变谱分析包括测定EGFR和/或HER2。
在一些实施方案中，测序突变谱分析包括测定KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR中的一种或多种。
在另一方面，本发明提供一种为需要的受试者确定候选治疗的方法，包括：对来自该受试者的样品进行免疫组化(IHC)分析，以确定以下至少5种的IHC表达谱：SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c-kit、AR、CD52、PDGFR、TOP2A、TS、ERCC1、RRM1、BCRP、TOPO1、PTEN、MGMT和MRP1；对该样品进行微阵列分析以确定以下至少5种的微阵列表达谱：ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGF1、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCC1、ERCC3、ESR1、FLT1、FOLR2、FYN、GART、GNRH1、GSTP1、HCK、HDAC1、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、MGMT、MLH1、MS4A1、MSH2、NFKB1、NFKB2、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA1、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1和ZAP70；对该样品进行荧光原位杂交(FISH)分析以确定EGFR和/或HER2的FISH突变谱；对该样品进行DNA测序以确定KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR中至少一个的测序突变谱；和相对于规则数据库比较IHC表达谱、微阵列表达谱、FISH突变谱和测序突变谱。该规则数据库包含其对癌细胞的生物活性已知的治疗图谱，该癌细胞：i)过表达或欠表达IHC表达谱中包括的一种或多种蛋白质；ii)过表达或欠表达微阵列表达谱中包括的一种或多种基因；iii)在FISH突变谱中包括的一种或多种基因中没有突变或具有一个或多个突变；和/或iv)在测序突变谱中包括的一种或多种基因中没有突变或具有一个或多个突变。如果：i)比较步骤表明该治疗应当对癌症具有生物活性；和ii)比较步骤没有表明该治疗不能用于治疗癌症，则确定为候选治疗。在一些实施方案中，对列出的生物标志物的至少50％、60％、70％、80％或90％进行IHC表达谱分析。在一些实施方案中，对列出的生物标志物的至少50％、60％、70％、80％或90％进行微阵列表达谱分析。
在第三方面，本发明提供一种确定用于需要的受试者的癌症的候选治疗的方法，包括：对来自该受试者的样品进行免疫组化(IHC)分析以确定至少下组蛋白质的IHC表达谱：SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c-kit、AR、CD52、PDGFR、TOP2A、TS、ERCC1、RRM1、BCRP、TOPO1、PTEN、MGMT和MRP1；对该样品进行微阵列分析以确定至少下组基因的微阵列表达谱：ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGF1、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCC1、ERCC3、ESR1、FLT1、FOLR2、FYN、GART、GNRH1、GSTP1、HCK、HDAC1、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、MGMT、MLH1、MS4A1、MSH2、NFKB1、NFKB2、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA1、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1和ZAP70；对该样品进行荧光原位杂交(FISH)分析以确定至少下组基因的FISH突变谱：EGFR和HER2；对该样品进行DNA测序以确定至少下组基因的测序突变谱：KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR；和相对于规则数据库比较IHC表达谱、微阵列表达谱、FISH突变谱和测序突变谱。该规则数据库包含其对癌细胞的生物活性已知的治疗图谱，该癌细胞：i)过表达或欠表达IHC表达谱中包括的一种或多种蛋白质；ii)过表达或欠表达微阵列表达谱中包括的一种或多种基因；iii)在FISH突变谱中包括的一种或多种基因中具有0个或更多个突变；和/或iv)在测序突变谱中包括的一种或多种基因中具有0个或更多个突变。如果：i)比较步骤表明该治疗应当对癌症具有生物活性；和ii)比较步骤没有表明该治疗不能用于治疗癌症，则确定为候选治疗。
在本发明的方法的一些实施方案中，样品包括福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织、新鲜冷冻(FF)组织，或保存核酸或蛋白质分子的溶液中包含的组织。在一些实施方案中，不进行微阵列分析、FISH突变分析或测序突变分析中的任一种。例如，可以不进行一种方法，除非样品通过质量控制测试。在一些实施方案中，质量控制测试包括A260/A280比或RPL13a mRNA的RT-PCR的Ct值。例如，质量控制测试可能需要A260/A280比＜1.5或RPL13a Ct值＞30。
在一些实施方案中，使用低密度微阵列、表达微阵列、比较基因组杂交(CGH)微阵列、单核苷酸多态性(SNP)微阵列、蛋白质组阵列或抗体阵列进行微阵列表达谱分析。
本发明的方法可能需要测定某些标志物，包括额外的标志物。在一些实施方案中，至少对SPARC、TOP2A和/或PTEN进行IHC表达谱分析。可以至少对CD52进行微阵列表达谱分析。IHC表达谱分析进一步包括测定DCK、EGFR、BRCA1、CK 14、CK 17、CK 5/6、E-钙粘着蛋白、p95、PARP-1、SPARC和TLE3中的一种或多种。在一些实施方案中，IHC表达谱分析进一步包括测定Cox-2和/或Ki-67。在一些实施方案中，微阵列表达谱分析进一步包括测定HSPCA。在一些实施方案中，FISH突变谱分析进一步包括测定c-Myc和/或TOP2A。测序突变谱分析可以包括测定PI3K。
大量基因和基因产物可以根据本发明的方法测定。例如，用于IHC表达谱分析的、微阵列表达谱分析、FISH突变谱分析和测序突变谱分析的基因独立地包括以下一种或多种：ABCC1、ABCG2、ACE2、ADA、ADH1C、ADH4、AGT、雄激素受体、AR、AREG、ASNS、BCL2、BCRP、BDCA1、BIRC5、B-RAF、BRCA1、BRCA2、CA2、小窝蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDK2、CDW52、CES2、CK 14、CK 17、CK 5/6、c-KIT、c-Myc、COX-2、细胞周期蛋白D1、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、E-钙粘着蛋白、ECGF1、EGFR、EPHA2、表皮调节素、ER、ERBR2、ERCC1、ERCC3、EREG、ESR1、FLT1、叶酸受体、FOLR1、FOLR2、FSHB、FSHPRH1、FSHR、FYN、GART、GNRH1、GNRHR1、GSTP1、HCK、HDAC1、Her2/Neu、HGF、HIF1A、HIG1、HSP90、HSP90AA1、HSPCA、IL13RA1、IL2RA、KDR、KIT、K-RAS、LCK、LTB、淋巴毒素β受体、LYN、MGMT、MLH1、MRP1、MS4A1、MSH2、Myc、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、ODC1、OGFR、p53、p95、PARP-1、PDGFC、PDGFR、PDGFRA、PDGFRB、PGP、PGR、PI3K、POLA、POLA1、PPARG、PPARGC1、PR、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SPARC MC、SPARC PC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活蛋白、TK1、TLE3、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TOPO1、TOPO2B、拓扑异构酶II、TS、TXN、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VEGFA、VEGFC、VHL、YES1和ZAP70。
在一些实施方案中，微阵列表达分析包括确定一种基因相对于参照是以统计学显著性上调还是下调。该统计学显著性可以在小于或等于0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005或0.0001的p值确定。p值也可以对多次比较进行校正。对多次比较的校正可以包括Bonferroni校正或其改变形式。
在一些实施方案中，IHC分析包括确定是否所述样品的30％或更多的染色强度为+2或更高。
本发明的方法使用的规则数据库内包含的标准可以基于各种治疗的有效性，特别是对于靶基因或基因产物。规则数据库可以包括表1和/或表2中列出的标准。
在本发明的方法的一个实施方案中，确定候选治疗的优先级列表。优先化可包括将治疗从较高优先级到较低优先级排序，按照基于微阵列分析和IHC或FISH分析的治疗；基于IHC分析而不基于微阵列分析的治疗；和基于微阵列分析但不基于IHC分析的治疗。
在本发明的方法的一个实施方案中，候选治疗包括施用一种或多种候选治疗剂。该一种或多种候选治疗剂可以是5-氟尿嘧啶，阿巴瑞克，阿仑珠单抗，氨鲁米特，阿那曲唑(Anastrazole)，芳香酶抑制剂(阿那曲唑，来曲唑)，天冬酰胺酶，阿司匹林，ATRA，阿扎胞苷，贝伐单抗，贝沙罗汀，比卡鲁胺，硼替佐米，骨化三醇，卡培他滨，卡铂，塞来考昔，西妥昔单抗，化学内内分泌治疗，胆骨化醇，顺铂，卡铂，环磷酰胺，环磷酰胺/长春新碱，阿糖胞苷，达沙替尼，地西他滨，多柔比星，表柔比星，表阿霉素，厄洛替尼，依托泊苷，依西美坦，氟嘧啶，氟他胺，氟维司群，吉非替尼，吉非替尼和曲妥珠单抗，吉西他滨，戈那瑞林，戈舍瑞林，羟基脲，伊马替尼，伊立替康，伊沙匹隆，拉帕替尼，来曲唑，亮丙瑞林，脂质体多柔比星，甲羟孕酮，甲地孕酮，氨甲喋呤，丝裂霉素，nab-紫杉醇，奥曲肽，奥沙利铂，紫杉醇，帕尼单抗，培门冬酶，培美曲塞，喷司他丁，索拉非尼，舒尼替尼，他莫昔芬，基于他莫昔芬的治疗、替莫唑胺，托泊替康，托瑞米芬，曲妥珠单抗，VBMCP/环磷酰胺，长春新碱，或其任意组合。一种或多种候选治疗药物也可以是5FU，贝伐珠单抗，卡培他滨，西妥昔单抗，西妥昔单抗+吉西他滨，西妥昔单抗+伊立替康，环磷酰胺，己烯雌酚(diethylstibesterol)，多柔比星，厄洛替尼，依托泊苷，依西美坦，氟嘧啶，吉西他滨，吉西他滨+依托泊苷，吉西他滨+培美曲塞，伊立替康，伊立替康+索拉非尼，拉帕替尼，拉帕替尼+他莫昔芬，来曲唑，来曲唑+卡培他滨，丝裂霉素，nab-紫杉醇，nab-紫杉醇+吉西他滨，nab-紫杉醇+曲妥珠单抗，奥沙利铂，奥沙利铂+5FU+曲妥珠单抗，帕尼单抗，培美曲塞，索拉非尼，舒尼替尼，舒尼替尼，舒尼替尼+丝裂霉素，他莫昔芬，替莫唑胺，替莫唑胺+贝伐珠单抗，替莫唑胺+索拉非尼，曲妥珠单抗，长春新碱，或其任意组合。
在本发明的方法的实施方案中，样品包括癌细胞。癌症可以是转移癌。癌症可以是现有治疗难治的。现有治疗可以是癌症的标准治疗。有时，患者以前已经用一种或多种治疗剂治疗癌症。有时，患者以前未用一种或多种确定的候选治疗剂治疗。
在一些实施方案中，癌症包括前列腺癌、肺癌、黑素瘤、小细胞(食道/腹膜后)癌、胆管上皮癌、间皮瘤、头颈癌(SCC)、胰腺癌、胰腺神经内分泌癌、小细胞、胃癌、腹膜假黏液瘤、肛管癌(SCC)、阴道癌(SCC)、宫颈癌、肾癌、小汗腺腺瘤、唾液腺腺瘤、子宫软组织肉瘤(子宫)、GIST(胃)或甲状腺退行发育性癌。在一些实施方案中，癌症包括附件，鼻窦，中耳和内耳，肾上腺，阑尾，造血系统，骨骼和关节，脊髓，乳腺，小脑，子宫颈，结缔组织和软组织，子宫体，食管，眼，鼻，眼球，输卵管，肝外胆管，口，肝内胆管，肾，阑尾-结肠，喉，唇，肝，肺和支气管，淋巴结，脑，脊柱，鼻软骨，视网膜，眼，口咽部，内分泌腺体，女性生殖器，卵巢，胰腺，阴茎和阴囊，垂体，胸膜，前列腺，直肠肾盂，输尿管，腹膜，唾液腺，皮肤，小肠，胃，睾丸，胸腺，甲状腺，舌，未知的，膀胱，子宫，阴道，阴唇，和阴户的癌症。在一些实施方案中，样品包括选自下组的细胞：脂肪，肾上腺皮质，肾上腺髓质，阑尾，膀胱，血液，血管，骨，软骨，脑，乳房，软骨，子宫颈，结肠，乙状结肠，树突细胞，骨骼肌，子宫内膜，食道，输卵管，成纤维细胞，胆囊，肾，喉，肝，肺，淋巴结，黑色素细胞，间皮衬里，肌上皮细胞，成骨细胞，卵巢，胰腺，腮腺，前列腺，唾液腺，鼻窦组织，骨骼肌，皮肤，小肠、平滑肌，胃，滑膜，关节内衬组织，肌腱，睾丸，胸腺，甲状腺，子宫和子宫体。在一些实施方案中，癌症包括乳腺癌，结肠直肠癌，卵巢癌，肺癌，非小细胞肺癌，胆管上皮癌，间皮瘤，汗腺癌，或GIST癌。
利用本发明的方法可以延长患者的无进展存活期(PFS)或无病存活期(DFS)。例如，与现有治疗相比，PFS或DFS可以延长至少大约10％、大约15％、大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％或至少大约100％。另外，利用本发明的方法选择候选治疗可以延长患者的寿命。例如，患者的寿命可以延长至少1周、2周、3周、4周、1个月、5周、6周、7周、8周、2个月、9周、10周、11周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、2年、21/2年、3年、4年或至少5年。
参考引入
本说明书中提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请具体且分别地通过引用并入本文。
本发明还涉及以下项目：
1.一种为需要的受试者确定候选治疗的方法，包括：
(a)对来自该受试者的样品进行免疫组化(IHC)分析以确定至少五种蛋白质的IHC表达谱；
(b)对该样品进行微阵列分析以确定至少10种基因的微阵列表达谱；
(c)对该样品进行荧光原位杂交(FISH)分析以确定至少一种基因的FISH突变谱；
(d)对该样品进行DNA测序以确定至少一种基因的测序突变谱；和
(e)相对于规则数据库比较所述IHC表达谱、微阵列表达谱、FISH突变谱和测序突变谱，其中所述规则数据库包含其对癌细胞的生物活性已知的治疗的图谱，该癌细胞：
i.过表达或欠表达所述IHC表达谱中包括的一种或多种蛋白质；
ii.过表达或欠表达所述微阵列表达谱中包括的一种或多种基因；
iii.在所述FISH突变谱中包括的一种或多种基因中没有突变或具有一个或多个突变；和/或
iv.在所述测序突变谱中包括的一种或多种基因中没有突变或具有一个或多个突变；和
(f)如果满足以下条件，则确定所述候选治疗方法：
i.步骤(e)中的比较表明该治疗应当对该癌症具有生物活性；和
ii.步骤(e)中的比较没有表明该治疗不能用于治疗该癌症。
2.一种为需要的受试者确定候选治疗的方法，包括：
(a)对来自该受试者的样品进行免疫组化(IHC)分析，以确定以下至少5种的IHC表达谱：SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c-kit、AR、CD52、PDGFR、TOP2A、TS、ERCC1、RRM1、BCRP、TOPO1、PTEN、MGMT和MRP1；
(b)对该样品进行微阵列分析以确定以下至少5种的微阵列表达谱：ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGF1、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCC1、ERCC3、ESR1、FLT1、FOLR2、FYN、GART、GNRH1、GSTP1、HCK、HDAC1、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、MGMT、MLH1、MS4A1、MSH2、NFKB1、NFKB2、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA1、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1和ZAP70；
(c)对该样品进行荧光原位杂交(FISH)分析以确定EGFR和/或HER2的FISH突变谱；
(d)对该样品进行DNA测序以确定KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR中至少一个的测序突变谱；和
(e)相对于规则数据库比较所述IHC表达谱、微阵列表达谱、FISH突变谱和测序突变谱，其中该规则数据库包含其对癌细胞的生物活性已知的治疗的图谱，该癌细胞：
i.过表达或欠表达所述IHC表达谱中包括的一种或多种蛋白质；
ii.过表达或欠表达所述微阵列表达谱中包括的一种或多种基因；
iii.在所述FISH突变谱中包括的一种或多种基因中没有突变或具有一个或多个突变；和/或
iv.在所述测序突变谱中包括的一种或多种基因中没有突变或具有一个或多个突变；和
(f)如果满足以下条件，则确定所述候选治疗：
i.步骤(e)中的比较表明该治疗应当对该癌症具有生物活性；和
ii.步骤(e)中的比较没有表明该治疗不能用于治疗该癌症。
3.一种为需要的受试者的癌症确定候选治疗的方法，包括：
(a)对来自该受试者的样品进行免疫组化(IHC)分析以确定至少下组蛋白质的IHC表达谱：SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c-kit、AR、CD52、PDGFR、TOP2A、TS、ERCC1、RRM1、BCRP、TOPO1、PTEN、MGMT和MRP1；
(b)对该样品进行微阵列分析以确定至少下组基因的微阵列表达谱：ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGF1、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCC1、ERCC3、ESR1、FLT1、FOLR2、FYN、GART、GNRH1、GSTP1、HCK、HDAC1、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、MGMT、MLH1、MS4A1、MSH2、NFKB1、NFKB2、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA1、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1和ZAP70；
(c)对该样品进行荧光原位杂交(FISH)分析以确定至少下组基因的FISH突变谱：EGFR和HER2；
(d)对该样品进行DNA测序以确定至少下组基因的测序突变谱：KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR；和
(e)相对于规则数据库比较所述IHC表达谱、微阵列表达谱、FISH突变谱和测序突变谱，其中该规则数据库包含其对癌细胞的生物活性已知的治疗的图谱，该癌细胞：
i.过表达或欠表达所述IHC表达谱中包括的一种或多种蛋白质；
ii.过表达或欠表达所述微阵列表达谱中包括的一种或多种基因；
iii.在所述FISH突变谱中包括的一种或多种基因中具有0个或更多个突变；和/或
iv.在所述测序突变谱中包括的一种或多种基因中具有0个或更多个突变；和
(f)如果满足以下条件，则确定所述候选治疗：
i.步骤(e)中的比较表明该治疗应当对该癌症具有生物活性；和
ii.步骤(e)中的比较没有表明该治疗不能用于治疗该癌症。
4.项目1、2或3的方法，其中所述样品包括福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织、新鲜冷冻(FF)组织，或保存核酸或蛋白质分子的溶液中包含的组织。
5.项目1、2或3的方法，其中不进行所述微阵列分析、FISH突变分析或测序突变分析中的任一种。
6.项目1、2或3的方法，其中所述样品通过质量控制测试。
7.项目6的方法，其中所述质量控制测试包括A260/A280比或RPL13a mRNA的RT-PCR的Ct值。
8.项目7的方法，其中所述质量控制测试包括A260/A280比＜1.5或RPL13a Ct值＞30。
9.项目2的方法，其中对步骤(a)中所列的生物标志物的至少50％、60％、70％、80％或90％进行所述IHC表达谱分析。
10.项目2的方法，其中对步骤(b)中所列的生物标志物的至少50％、60％、70％、80％或90％进行所述微阵列表达谱分析。
11.项目1、2或3的方法，其中使用低密度微阵列、表达微阵列、比较基因组杂交(CGH)微阵列、单核苷酸多态性(SNP)微阵列、蛋白质组阵列或抗体阵列进行所述微阵列表达谱分析。
12.项目1、2或3的方法，其中至少对SPARC、TOP2A和/或PTEN进行所述IHC表达谱分析。
13.项目1、2或3的方法，其中至少对CD52进行所述微阵列表达谱分析。
14.项目2的方法，其中所述IHC表达谱分析进一步包括测定DCK、EGFR、BRCA1、CK 14、CK 17、CK 5/6、E-钙粘着蛋白、p95、PARP-1、SPARC和TLE3中的一种或多种。
15.项目2的方法，其中所述IHC表达谱分析进一步包括测定Cox-2和/或Ki-67。
16.项目2的方法，其中所述微阵列表达谱分析进一步包括测定HSPCA。
17.项目2的方法，其中所述FISH突变谱分析进一步包括测定c-Myc和/或TOP2A。
18.项目2的方法，其中所述测序突变谱分析进一步包括测定PI3K。
19.项目1的方法，其中所述用于IHC表达谱分析、微阵列表达谱分析、FISH突变谱分析和测序突变谱分析的基因独立地包括以下一种或多种：ABCC1、ABCG2、ACE2、ADA、ADH1C、ADH4、AGT、雄激素受体、AR、AREG、ASNS、BCL2、BCRP、BDCA1、BIRC5、B-RAF、BRCA1、BRCA2、CA2、小窝蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDK2、CDW52、CES2、CK 14、CK 17、CK 5/6、c-KIT、c-Myc、COX-2、细胞周期蛋白D1、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、E-钙粘着蛋白、ECGF1、EGFR、EPHA2、表皮调节素、ER、ERBR2、ERCC1、ERCC3、EREG、ESR1、FLT1、叶酸受体、FOLR1、FOLR2、FSHB、FSHPRH1、FSHR、FYN、GART、GNRH1、GNRHR1、GSTP1、HCK、HDAC1、Her2/Neu、HGF、HIF1A、HIG1、HSP90、HSP90AA1、HSPCA、IL13RA1、IL2RA、KDR、KIT、K-RAS、LCK、LTB、淋巴毒素β受体、LYN、MGMT、MLH1、MRP1、MS4A1、MSH2、Myc、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、ODC1、OGFR、p53、p95、PARP-1、PDGFC、PDGFR、PDGFRA、PDGFRB、PGP、PGR、PI3K、POLA、POLA1、PPARG、PPARGC1、PR、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SPARC MC、SPARC PC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活蛋白、TK1、TLE3、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TOPO1、TOPO2B、拓扑异构酶II、TS、TXN、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VEGFA、VEGFC、VHL、YES1和ZAP70。
20.项目1的方法，其中所述IHC表达谱分析包括测定SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c-kit、AR、CD52、PDGFR、TOP2A、TS、ERCC1、RRM1、BCRP、TOPO1、PTEN、MGMT和MRP1中的一种或多种。
21.项目1的方法，其中所述微阵列表达谱分析包括测定ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGF1、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCC1、ERCC3、ESR1、FLT1、FOLR2、FYN、GART、GNRH1、GSTP1、HCK、HDAC1、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、MGMT、MLH1、MS4A1、MSH2、NFKB1、NFKB2、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA1、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1和ZAP70中的一种或多种。
22.项目1的方法，其中所述FISH突变谱分析包括测定EGFR和/或HER2。
23.项目1的方法，其中所述测序突变谱分析包括测定KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR中的一种或多种。
24.项目1、2或3的方法，其中所述微阵列表达分析包括确定一种基因是否相对于参照以统计学显著性上调或下调。
25.项目24的方法，其中所述统计学显著性以小于或等于0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005或0.0001的p值确定。
26.项目25的方法，其中所述p值进行多重比较校正。
27.项目26的方法，其中所述多重比较校正包括Bonferroni校正或其改变形式。
28.项目1、2或3的方法，其中所述IHC分析包括确定是否所述样品的30％或更多的染色强度为+2或更高。
29.项目1、2或3的方法，其中所述规则数据库包括表1和/或表2中列出的规则。
30.项目1、2或3的方法，其中所述规则数据库内包含的规则基于各种治疗的有效性，特别是对于靶基因或基因产物的有效性。
31.项目1、2或3的方法，其中确定候选治疗的优先化列表。
32.项目31的方法，其中所述优先化可包括按照基于微阵列分析和IHC或FISH分析的治疗，基于IHC分析而不基于微阵列分析的治疗，和基于微阵列分析但不基于IHC分析的治疗，将治疗从较高优先级到较低优先级排序。
33.项目1、2或3的方法，其中所述治疗包括施用一种或多种候选治疗剂。
34.项目33的方法，其中所述一种或多种候选治疗剂包括5-氟尿嘧啶、阿巴瑞克、阿仑珠单抗、氨鲁米特、阿那曲唑、芳香酶抑制剂(阿那曲唑、来曲唑)、天冬酰胺酶、阿司匹林、ATRA、阿扎胞苷、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、硼替佐米、骨化三醇、卡培他滨、卡铂、塞来考昔、西妥昔单抗、化学内分泌治疗、胆骨化醇、顺铂、卡铂、环磷酰胺、环磷酰胺/长春新碱、阿糖胞苷、达沙替尼、地西他滨、多柔比星、表柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依西美坦、氟嘧啶、氟他胺、氟维司群、吉非替尼、吉非替尼和曲妥珠单抗、吉西他滨、戈那瑞林、戈舍瑞林、羟基脲、伊马替尼、伊立替康、伊沙匹隆、拉帕替尼、来曲唑、亮丙瑞林、脂质体多柔比星、甲羟孕酮、甲地孕酮、氨甲喋呤、丝裂霉素、nab-紫杉醇、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕尼单抗、培门冬酶、培美曲塞、喷司他丁、索拉非尼、舒尼替尼、他莫昔芬、基于他莫昔芬的治疗、替莫唑胺、托泊替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、VBMCP/环磷酰胺、长春新碱，或其任意组合。
35.项目33的方法，其中所述所述一种或多种候选治疗剂包括5FU、贝伐珠单抗、卡培他滨、西妥昔单抗、西妥昔单抗+吉西他滨、西妥昔单抗+伊立替康、环磷酰胺、己烯雌酚、多柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依西美坦、氟嘧啶、吉西他滨、吉西他滨+依托泊苷、吉西他滨+培美曲塞、伊立替康、伊立替康+索拉非尼、拉帕替尼、拉帕替尼+他莫昔芬、来曲唑、来曲唑+卡培他滨、丝裂霉素、nab-紫杉醇、nab-紫杉醇+吉西他滨、nab-紫杉醇+曲妥珠单抗、奥沙利铂、奥沙利铂+5FU+曲妥珠单抗、帕尼单抗、培美曲塞、索拉非尼、舒尼替尼、舒尼替尼、舒尼替尼+丝裂霉素、他莫昔芬、替莫唑胺、替莫唑胺+贝伐珠单抗、替莫唑胺+索拉非尼、曲妥珠单抗、长春新碱，或其任意组合。
36.项目1或2的方法，其中所述样品包含癌细胞。
37.项目1、2或3的方法，其中所述患者以前已经用一种或多种治疗癌症的治疗剂治疗。
38.项目1、2或3的方法，其中所述患者以前未用一种或多种步骤(f)中确定的候选治疗剂治疗。
39.项目1、2或3的方法，其中所述癌症包括转移癌。
40.项目1、2或3的方法，其中所述癌症用原有治疗难以治疗。
41.项目40的方法，其中所述原有治疗包括癌症的标准治疗。
42.项目1、2或3的方法，其中所述癌症包括前列腺癌、肺癌、黑素瘤、小细胞(食道/腹膜后)癌、胆管上皮癌、间皮瘤、头颈癌(SCC)、胰腺癌、胰腺神经内分泌癌、小细胞、胃癌、腹膜假黏液瘤、肛管癌(SCC)、阴道癌(SCC)、宫颈癌、肾癌、小汗腺腺瘤、唾液腺腺瘤、子宫软组织肉瘤(子宫)、GIST(胃)或甲状腺退行发育性癌。
43.项目1、2或3的方法，其中所述癌症包括以下器官的癌症：附件、鼻窦、中耳和内耳、肾上腺、阑尾、造血系统、骨骼和关节、脊髓、乳腺、小脑、子宫颈、结缔组织和软组织、子宫体、食管、眼、鼻、眼球、输卵管、肝外胆管、口、肝内胆管、肾、阑尾-结肠、喉、唇、肝、肺和支气管、淋巴结、脑、脊柱、鼻软骨、视网膜、眼、口咽部、内分泌腺体、女性生殖器、卵巢、胰腺、阴茎和阴囊、垂体、胸膜、前列腺、直肠肾盂、输尿管、腹膜、唾液腺、皮肤、小肠、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、未知的、膀胱、子宫、阴道、阴唇和阴户的癌症。
44.项目1、2或3的方法，其中所述样品包含选自下组的细胞：脂肪、肾上腺皮质、肾上腺髓质、阑尾、膀胱、血液、血管、骨、软骨、脑、乳房、软骨、子宫颈、结肠、乙状结肠、树突细胞、骨骼肌、子宫内膜、食道、输卵管、成纤维细胞、胆囊、肾、喉、肝、肺、淋巴结、黑色素细胞、间皮衬里、肌上皮细胞、成骨细胞、卵巢、胰腺、腮腺、前列腺、唾液腺、鼻窦组织、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、胃、滑膜、关节内衬组织、肌腱、睾丸、胸腺、甲状腺、子宫和子宫体。
45.项目1、2或3的方法，其中所述癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肺癌、非小细胞肺癌、胆管上皮癌、间皮瘤、汗腺癌、或GIST癌。
46.项目1、2或3的方法，其中所述患者的无进展存活期(PFS)或无病存活期(DFS)延长。
47.项目46的方法，其中与现有治疗相比，PFS或DFS延长至少大约10％、大约15％、大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％或至少大约100％。
48.项目1、2或3的方法，其中通过候选治疗的选择延长所述患者的寿命。
49.项目48的方法，其中所述患者的寿命延长至少1周、2周、3周、4周、1个月、5周、6周、7周、8周、2个月、9周、10周、11周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、2年、21/2年、3年、4年或至少5年。
附图说明
通过以下说明应用本发明原理的示例实施方案的详细描述和附图能够更好地理解本发明的特征和优点，附图中：
图1显示一个系统的示例性实施方案的方块图，该系统用于确定对特定疾病状态的个性化医疗干预，它利用对非疾病特异性的患者生物标本的分子谱分析。
图2是一种方法的示例性实施方案的流程图，该方法用于确定对特定疾病状态的个性化医疗干预，它利用对非疾病特异性的患者生物标本的分子谱分析。
图3A至3D显示按照图2的步骤80的示例性的患者特征报告。
图4是用于确定能够与靶标相互作用的药物治疗/药剂的方法的示例性实施方案的流程图。
图5-14是流程图和图示，说明根据本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的各个部分。
图15-25是计算机屏幕打印输出，与图5-14所示的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的各个部分相关。
图26A-26H为表格，按照肿瘤类型显示基因表达蛋白质的表达的显著性变化频率。
图27A-27H是表格，按照肿瘤类型显示某些基因表达的显著性变化频率。
图28A-28O是表格，按照肿瘤类型显示某些基因表达蛋白质的表达的显著性变化频率。
图29是表格，显示基于图28以频率顺序标记为靶标的生物标志物(基因表达的蛋白质)。
图30A-30O是表格，按照肿瘤类型显示某些基因的表达的显著性变化频率。
图31是表格，显示基于图30按照频率标记为靶标的基因。
图32显示使用根据分子谱分析选择的治疗的无进展存活期(PFS)(阶段B)，以及患者最近接受的治疗的PFS(阶段A)。如果PFS(B)/PFS(A)比≥1.3，则分子谱分析选择的治疗被定义为对患者具有益处。
图33是如果靶标已被确定，通过分子谱分析确定治疗的方法的图示。
图34显示实施例1进行的研究中的患者分布。
图35显示使用PFS比≥1.3的患者的研究结果，为18/66(27％)。
图36是所有患者的目标病变直径总和相对于基线直径的最大％变化的瀑布图。
图37显示医生在知道分子谱分析结果的建议之前用来治疗患者的选择之间的关系。18名PFS比≥1.3的患者没有匹配。
图38是18名PFS比≥1.3的患者相对于全部66名患者的总存活期的图示。
图39显示微阵列谱分析结果的输出和使用截断值进行的调用的实例。
图40A-40J显示基于分子谱分析的示例性的患者报告。
发明详述
本发明提供通过利用分子谱分析确定治疗靶标的方法和系统。分子谱分析方法提供一种为个体选择候选治疗的方法，该治疗可有利地改变患有病症或疾病如癌症的个体的临床过程。当使用分子谱分析方法治疗时，比使用选择治疗方案的常规方法，分子谱分析方法可以为个体提供临床益处，例如提供更长的无进展存活期(PFS)、更长的无病存活期(DFS)、更长的总存活期(OS)或延长的寿命。当疾病用当前的疗法难以治疗时，例如在癌症已发展了对标准治疗的抗性后，分子谱分析能够建议候选治疗。
分子谱分析能够通过任何已知的检测生物样品中的分子的手段进行。可以对任何适用的生物样品进行谱分析。样品一般来自于怀疑患有或已知患有疾病或障碍的个体，例如但不限于来自癌症患者的活检样品。样品的分子谱分析也可以通过任何数量的评估生物因子如DNA序列、mRNA序列或蛋白质的量或状态的技术进行。这样的技术包括但不限于免疫组化(IHC)、原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)、各种类型的微阵列(mRNA表达阵列、蛋白质阵列等)、各种类型的测序(Sanger，焦磷酸测序等)、比较基因组杂交(CGH)、NextGen测序、Northern印迹法、Southern印迹法、免疫测定、和正在开发的任何其他合适的测定感兴趣的生物分子的存在或量的技术。这些方法中的任一种或多种可以同时使用或相继使用。
分子谱分析用来为患者的疾病选择候选治疗。例如，候选治疗可以是通过分子谱分析技术确定的、已知对差异表达基因的细胞具有效果的治疗。差异表达可以包括生物产物例如基因、mRNA或蛋白质相比对照的过表达和欠表达。对照可以包括与样品类似但没有疾病的细胞。对照可以来自于同一患者，例如，与病变细胞相同的器官的正常相邻部分，或者对照可以来自于其他患者的健康组织。对照可以是在同一样品中发现的对照，例如管家基因或其产物(例如，mRNA或蛋白质)。例如，对照核酸可以是已知根据细胞的癌或非癌状态没有不同的核酸。对照核酸的表达水平可以用来标准化测试和参考群体中的信号水平。示例性的对照基因包括但不限于，例如，β-肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。可以使用多个对照或多个类型的对照。差异表达的来源可以变化。例如，细胞中的基因拷贝数可能提高，从而导致基因的表达提高。或者，基因的转录可能被改变，例如，通过染色质重构、差异甲基化、差异表达或转录因子的活性等。转录也可以被改变，例如，通过降解mRNA、翻译mRNA或沉默化翻译的因子(例如，microRNA或siRNA)的差异表达。在一些实施方案中，差异表达包括差异活性。例如，蛋白质可携带提高蛋白质活性的突变，如组成型激活，从而导致患病状态。显示活性变化的分子谱分析可以用来指导治疗选择。
当分子谱分析显示多个药物靶标差异表达时，可以准备决定规则，以优先化(prioritize)特定治疗的选择。可以使用任何这样的帮助优先化治疗的规则，可以用来优先化治疗，例如，分子谱分析的直接结果、预期效果、以前的相同或其它治疗史、预计的副作用、可用性、成本、药物-药物相互作用，和经治医生考虑的其它因素。医生最终可以决定疗程。因此，分子谱分析可以基于病变细胞例如肿瘤细胞的个体特征和需要治疗的个体的其它个性化因素选择候选治疗，而不是依赖于传统的针对特定指征的目标治疗所采用的通用的方法。在一些情况中，推荐的治疗是一般用来治疗影响该患者的疾病或障碍的治疗。在一些情况中，在标准治疗不再提供足够的效果后使用推荐的治疗。
核酸包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，及其互补体。核酸可以含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，它们具有与参照核酸相似的结合性质，并且以类似于参照核苷酸的方式代谢。这样的类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA).核酸序列可包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)和互补序列，以及明确说明的序列。特别是，简并密码子置换可以通过以下方式实现：产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三个位点被置换为混合碱基和/或脱氧肌苷残基的序列(Batzer等人，核酸Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell探针8：91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
特定的核酸序列可以隐含包括编码截短形式的特定序列和"剪接变体"和核酸序列。同样，由核酸编码的特定蛋白质可包括由该核酸的剪接变体或截短形式编码的任何蛋白质。“剪接变体”如同其字面含义那样，是基因的可变剪接的产物。转录后，初始核酸转录物可以被剪接，使得不同的(可变)核酸剪接产物编码不同的多肽。剪接变体的产生机制不同，但是包括外显子的可变剪接。由相同核酸通过通读转录产生的可选多肽也包括在该定义中。剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式，包括在该定义中。核酸可以在5′端或3′端截短。多肽可以在N-末端或C-末端截短。核酸或多肽序列的截短形式可以天然存在或重组产生。
术语“遗传变体”和“核苷酸变体”在本文中可以互换使用，是指在特定基因座处相对于参照人基因或cDNA序列的改变或变化，包括但不限于编码和非编码区的核苷酸碱基缺失、插入、倒置和置换。缺失可以是单核苷酸碱基缺失、基因的核苷酸序列的一部分或一个区域的缺失，或整个基因序列的缺失。插入可以是一个或多个核苷酸碱基的插入。遗传变体或核苷酸变体可发生在转录调节区、mRNA的非翻译区、外显子、内含子、外显子/内含子连接等。遗传变体或核苷酸变体可能潜在地导致终止密码子、移码、氨基酸缺失、改变的基因转录物剪接形式或改变的氨基酸序列。
等位基因或等位基因通常包括天然存在的具有参照序列的基因或含有特定核苷酸变体的基因。
单体型是指个体中发现的染色体上的mRNA或基因组DNA区域的遗传(核苷酸)变体的组合。因此，单体型包括大量一般作为一个单元一起遗传的遗传连接的多态性变体。
本文使用的术语“氨基酸变体”用来指相对于编码参照蛋白质的参照人基因的遗传变体或核苷酸变体导致的相对于参照人蛋白质序列的氨基酸改变。术语“氨基酸变体”旨在不仅包括单氨基酸置换而且包括氨基酸缺失、插入和参照蛋白质中氨基酸序列的其它显著改变。
术语“基因型”在本文中是指基因的一个等位基因或两个等位基因中特定核苷酸变体标志物(或基因座)处的核苷酸特征。关于感兴趣的基因的特定核苷酸位点，该基因座处的核苷酸或其在一个或两个等位基因中的等同物形成该基因在该基因座处的基因型。基因型可以是纯合的或杂合的。因此，“基因型分型”是指确定基因型，即特定基因座处的核苷酸。基因型分型也可以通过确定可用来推断相应核苷酸变体的蛋白质特定位置处的氨基酸变体来进行。
术语“基因座”是指基因序列或蛋白质中的特定位置或位点。因此，在特定基因座中可能存在一个或多个连续核苷酸，或者在多肽中的特定基因座处存在一个或多个氨基酸。而且，基因座可以指基因中的特定位置，在此位置一个或多个核苷酸已经缺失、插入或倒置。
本文使用的术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”可以互换使用，是指氨基酸链，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。氨基酸链可以是至少两个氨基酸的任意长度，包括全长蛋白质。除非另外说明，多肽、蛋白质和肽也包括其各种修改形式，包括但不限于糖基化形式、磷酸化形式等。多肽、蛋白质或肽也可以指基因产物。
本文提供了可以通过分子谱分析技术测定的基因和基因产物的列表。基因列表在检测基因产物(例如，mRNA或蛋白质)的分子谱分析技术的上下文中给出。本领域技术人员理解这意味着所列出的基因的基因产物的检测。类似地，基因产物列表在检测基因序列或拷贝数的分子谱分析技术的上下文中给出。本领域技术人员理解这意味着对应于基因产物的基因的检测，作为一个实例，包括编码基因产物的DNA。本领域技术人员应当理解，“生物标志物”或“标志物”包括取决于该内容的基因和/或基因产物。
术语“标记”和“可检测标记”是指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、化学或类似的方法检测的任何组合物。这样的标记包括用于用标记的链霉亲和素偶联物染色的生物素、磁珠(例如，DYNABEADSTM)、荧光染料(例如，萤光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如，3H，125I，35S，14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)和量热标记如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠。教导了这样的标记的应用的专利包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。检测这些标记的手段则本领域技术人员公知的。因此，例如，放射性标记可以用光学胶片或闪烁计数器检测，荧光标记可以用光学检测器检测发出的光来检测。酶标记一般通过向酶提供底物并检测酶作用于底物产生的反应产物来检测，量热标记通过简单地显示有色标记来检测。标记可以包括，例如，结合标记抗体的配体、荧光团、化学发光剂、酶和可作为标记配体的特异性结合对成员的抗体。关于标记、标记过程和标记检测的介绍可见Polak和Van Noorden Introduction toImmunocytochemistry，2nd ed.，Springer Verlag，NY(1997)；和HauglandHandbook of Fluorescent Probe and Research Chemicals，a combinedhandbook and catalogue Published by Molecular Probe，Inc.(1996)。
可检测的标记包括但不限于核苷酸(标记的或未标记的)、复合体、糖、肽、蛋白质、抗体、化学化合物、传导聚合物、结合部分如生物素、质量标签、量热剂、发光剂、化学发光剂、光散射剂、荧光标记、放射性标记、负荷标记(电或磁荷)、挥发性标记和疏水性标记、生物分子(例如，结合对抗体/抗原、抗体/抗体、抗体/抗体片段、抗体/抗体受体、抗体/蛋白A或蛋白G、半抗原/抗半抗原、生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸盐结合蛋白、维生素B12/内因子、化学反应基/互补化学反应基(例如，巯基/马来酰亚胺、巯基/卤代乙酰基衍生物、胺/异硫氰酸酯、胺/琥伯酰亚胺基酯和胺/磺酰基卤化物的成员)等等。
本文使用的术语“抗体”包括天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括，例如，单链抗体、嵌合、双功能和人源化抗体，及其抗原结合片段(例如，Fab′，F(ab′)2，Fab，Fv和rIgG)。参见Pierce Catalog andHandbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.)。也参见，例如，Kuby，J.，Immunology，3.sup.rd Ed.，W.H.Freeman & Co.，NeW York(1998)。这样的非天然存在的抗体可以使用固相肽合成法构建，可以重组产生，或者可以例如通过筛查由可变重链和可变轻链组成的组合文库获得，如Huse等人，Science 246：1275-1281(1989)所述，其通过引用并入本文。制备例如嵌合、人源化、CDR移植的、单链和双功能抗体的这些和其它方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，Winter和Harris，Immunol.Today 14：243-246(1993)；Ward等人，Nature 341：544-546(1989)；Harlow和Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Harbor Laboratorypublications，New York，1988；Hilyard等人，Protein Engineering：Apractical approach(IRL Press 1992)；Borrebaeck，Antibody Engineering，2ded.(Oxford University Press 1995)；以上文献通过引用并入本文。
除非另外指出，抗体可以包括多克隆和单克隆抗体。抗体也包括遗传工程形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)和异偶联抗体(例如，双特异性抗体)。该术语也指重组单链Fv片段(scFv)。术语抗体也包括二价或双特异性分子、双体、三体和四体。二价和双特异性分子描述于，例如，Kostelny等人(1992)J Immunol 148：1547，Pack和Pluckthun(1992)Biochemistry 31：1579，Holliger等人(1993)Proc NatlAcad Sci USA.90：6444，Gruber等人(1994)J Immunol：5368，Zhu等人(1997)Protein Sci 6：781，Hu等人(1997)Cancer Res.56：3055，Adams等人(1993)Cancer Res.53：4026，和McCartney，等人(1995)Protein Eng.8：301。
一般来说，抗体具有重链和轻链。每个重链和轻链含有恒定区和可变区，(这些区域也被称为“域”)。轻链和重链可变区含有被三个高变区打断的四个框架区，也被称为互补决定区(CDR)。框架区和CDR的程度已经确定。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区，即作为组分的轻链和重链的组合框架区，用来在三维空间定位和排列。CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR一般被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始连续编号，一般也用特定CDR所定位的链来确定。因此，VH CDR3位于它所存在的抗体重链的可变域，而VL CDR1是来自它所存在的抗体轻链可变域的CDR1。提到VH是指抗体的免疫球蛋白重链(包括Fv、scFv或Fab的重链)的可变区。提到VL是指免疫球蛋白轻链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链)的可变区。
短语“单链Fv”或“scFv”是指一种抗体，其中传统双链抗体的重链和轻链的可变域已经连接形成一条链。一般来说，连接肽插入两条链之间，以允许活性结合位点的适当折叠和产生。“嵌合抗体”是一种免疫球蛋白分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接到不同或改变的类别、效应功能和/或牿或完全不同的分子的恒定区，它给嵌合抗体提供了新的性质，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)可变区或其一部分被改变、替换或交换为具有不同或改变的抗原特异性的可变区。
“人源化抗体”是一种免疫球蛋白分子，它含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(接受抗体)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基被替换为来自非人种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基，它们具有希望的特异性、亲和力和能力。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替换。人源化抗体也可以包括在接受抗体或在输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体包括至少一种、一般两种可变域的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的区域，所有或基本上所有框架(FR)区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化抗体最好也包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的(Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))。人源化基本上可以按照Winter和同事(Jones等人，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988))的方法进行，即通过用啮齿动物CDRs或CDR序列替换人抗体的相应的序列。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中大大少于完整的人可变区已经被来自非人物种的相应的序列取代。
术语“表位”和“抗原决定簇”是指抗原上被抗体所结合的位点。表位可以由连续氨基酸构成，或由通过蛋白质三级折叠邻近的不连续氨基酸构成。由连续氨基酸形成的表位一般保持暴露于变性溶剂，而通过三级折叠形成的表位一般在用变性溶剂处理后丢失。表位一般在独特的空间构象中包括至少3个、更通常至少5或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括，例如，x-射线结晶法和二维核磁共振。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66，Glenn E.Morris，Ed(1996)。
术语“引物”、“探针”和“寡核苷酸”在本文中可以互换使用，是指相对较短的核酸片段或序列。它们可以包括DNA、RNA或其杂合体，或化学修饰的类似物或其衍生物。一般来说，它们是单链的。但是，它们也可以是具有两条互补链的双链，这两条链可以通过变性分离。正常情况下，引物、探针和寡核苷酸的长度为大约8个核苷酸至大约200个核苷酸，优选为大约12个核苷酸至大约100个核苷酸，更优选为大约18个至大约50个核苷酸。它们可以用可检测标志物标记，或者使用用于各种分子生物学应用的常规方法修饰。
术语“分离的”当用于核酸(例如，基因组DNA、cDNA、mRNA或其片段)时是指核酸分子以基本上与其它天然存在的核酸分离的形式存在，该其它天然存在的核酸在正常情况下与该分子缔合。因为天然存在的染色体(或其病毒等同物)包括长核酸序列，分离的核酸可以是在染色体中只有该核酸序列的一部分而在同一染色体上不存在一个或多个其它部分的核酸分子。更具体地，分离的核酸可包括天然存在的核酸序列，该核酸序列在天然存在的染色体(或其病毒等同物)中位于该核酸的侧翼。分离的核酸可以基本上与同一生物的不同染色体上的其它天然存在的核酸分离。分离的核酸也可以是其中核酸分子显著富集以构成组合物中总核酸的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％的组合物。
分离的核酸可以是杂合核酸，其中特定核酸分子共价连接至一个或多个在自然中不位于特定核酸侧翼的核酸分子。例如，分离的核酸可以在载体中。另外，特定核酸的核苷酸序列可以与天然存在的核酸或修饰形式或具有一个或多个突变如核苷酸置换、缺失/插入、倒置等的突变蛋白相同。
分离的核酸可以由重组宿主细胞(其中核酸已经重组扩增和/或表达)制备，或者可以是具有天然存在的核苷酸序列或其人工修饰形式的化学合成的核酸。
本文使用的术语“分离的多肽”被定义为以自然中发现的形式以外的形式存在的多肽分子。因此，分离的多肽可以是非天然存在的多肽。例如，分离的多肽可以是“杂合多肽”。分离的多肽也可以是通过氨基酸的添加或缺失或置换由天然存在的多肽衍生的多肽。分离的多肽也可以是“纯化的多肽”，后者在本文中用来指特定多肽分子显著富集从而构成组合物中总蛋白质含量的至少10％的组合物或制品。“纯化的多肽”可以通过标准纯化技术或通过化学合成从天然或重组宿主细胞获得，如本领域技术人员所清楚的。
术语“杂合蛋白质”、“杂合多肽”、“杂合肽”、“融合蛋白”、“融合多肽”和“融合肽”在本文中可以互换使用，是指非天然存在的多肽或分离的多肽，其中特定多肽分子共价连接至一个或多个在自然中不连接至特定多肽的其它多肽分子。因此，“杂合蛋白质”可以是通过共价键连接在一起的两个天然存在的蛋白质或其片段。“杂合蛋白质”也可以是通过将两个人工多肽共价连接在一起形成的蛋白质。一般来说，但不是必然的，两个或多个多肽分子通过肽键连接或“融合”在一起，形成一条不分支的多肽链。
术语“高严格性杂交条件”当用于核酸杂交时包括在含有50％甲酰胺、5×SSC(750 mM NaCl，75 mM柠檬酸钠)、50 mM磷酸钠，pH 7.6，5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切鲑精DNA的溶液中42℃进行杂交过夜，杂交滤器在0.1×SSC中在大约65℃下洗涤。术语“中严格性杂交条件”当用于核酸杂交时包括在含有50％甲酰胺、5×SSC(750 mM NaCl，75 mM柠檬酸钠)、50 mM磷酸钠，pH 7.6，5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切鲑精DNA的溶液中37℃进行杂交过夜，杂交滤器在1×SSC中在大约50℃下洗涤。需要注意本领域技术人员清楚可以使用许多其它杂交方法、溶液和温度来实现相当的严格杂交条件。
为了比较两个不同的核酸或多肽序列，一个序列(测试序列)可以被描述为与另一序列(比较序列)有一定的百分比相同。相同性百分比可以通过并入各种BLAST程序中的Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993)的算法来确定。相同性百分比可以通过"BLAST 2 Sequences"工具确定，该工具可以从国家生物技术信息中心(NCBI)网站上获得。参见Tatusova和Madden，FEMS Microbiol.Lett.，174(2)：247-250(1999)。对于DNA-DNA逐对比较，BLASTN程序以缺省参数使用(例如，匹配：1；错配：-2；开放空位：5个罚分；延伸空位：2个罚分；空位x_dropoff：50；期望值：10；字长：11，使用滤器)。对于蛋白质-蛋白质序列逐对比较，BLASTP程序可以使用缺省参数(例如，矩阵：BLOSUM62；空位开放：11；空位延伸：1；x_dropoff：15；期望值：10.0；字长：3，使用滤器)。两条序列的相同性百分比如下计算：使用BLAST将测试序列与比较序列进行比对，确定对齐的测试序列中与比较序列相同位点的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的数目，和将相同氨基酸或核苷酸的数目除以比较序列中氨基酸或核苷酸的数目。当使用BLAST比较两条序列时，比对该序列，产生定义的对齐区上的相同性百分比。如果两条序列在其全长上比对，通过BLAST产生的相同性百分比是两条序列的相同性百分比。如果BLAST不在其全长上比对两条序列，则测试序列和比较序列的未对齐区中相同的氨基酸或核苷酸的数目被认为是0，并通过将对齐区中相同氨基酸或核苷酸的数目相加并将该数字除以比较序列的长度来确定相同性百分比。可以使用BLAST程序的各种版本来比较序列，例如BLAST 2.1.2或BLAST+2.2.22。
受试者可以是任何可能受益于本发明的方法的动物，包括，例如，人和非人哺乳动物，如灵长类动物、啮齿动物、马、狗和猫。受试者包括但不限于真核生物，最优选哺乳动物如灵长类动物，例如，黑猩猩或人、牛；狗；猫；啮齿动物，例如，豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鸟；爬行动物；或鱼。特别使用本文所述的方法治疗的受试者包括人。受试者可以被称为个体或患者。
根据本发明对疾病或个体的治疗是获得有益的或希望的医疗结果的方法，包括临床结果，但不一定治愈。对于本发明，有益的或希望的临床结果包括但不限于一个或多个症状的缓解或改善、疾病程度的减轻、稳定的(即没有恶化)疾病状态、防止疾病扩散、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻、和缓解(无论是部分的还是整体的)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗也包括与未接受治疗或接受不同的治疗预计的存活期相比延长存活期。治疗可包括施用治疗剂，该治疗剂可以是对病变细胞例如癌细胞或其它可能促进疾病状态的细胞如活化的免疫细胞发挥细胞毒性、细胞抑制或免疫调节作用的药剂。通过本发明的方法选择的治疗剂没有限制。可以选择任何治疗剂，只要在分子谱分析和该治疗剂的潜在效力之间建立联系。治疗剂包括但不限于小分子、蛋白质治疗、抗体治疗、病毒治疗、基因治疗等。癌症治疗或疗法包括细胞凋亡介导的和非细胞凋亡介导的癌症疗法，包括但不限于化学疗法、激素疗法、放射疗法、免疫疗法及其组合。化学治疗剂包括治疗剂和治疗例如杀死癌细胞的治疗剂的组合。不同类型的化疗药物的例子包括但不限于烷化剂(例如，氮芥衍生物、乙烯亚胺、烷基磺酸酯类、肼类和三嗪类、亚硝基脲类和金属盐类)、植物生物碱类(例如，长春花生物碱类、紫杉烷类、鬼臼毒素和喜树碱类似物)、抗肿瘤抗生素类(例如，蒽环类、色霉素类等)，抗代谢物(例如，叶酸拮抗剂，嘧啶拮抗剂，嘌呤拮抗剂，和腺苷脱氨酶抑制剂)，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，和各种抗肿瘤药(例如，核糖核苷酸还原酶抑制剂，肾上腺皮质类固醇抑制剂，酶，抗微管剂和维生素A酸类)。
此处使用的样品包括任何可用于分子谱分析的相关样品，例如，组织如活检或在外科或其它操作过程中切除的组织的切片、尸检样品和为了组织分析目的采集的冷冻切片。这样的样品包括血液和血液部分或产物(例如，血清、棕黄层、血浆、血小板、红细胞等)、痰、颊细胞组织、培养的细胞(例如，原代培养物、外植体和转化的细胞)、粪便、尿、其它生物液体或体液(例如，前列腺液、胃液、肠液、肾液、肺液、脑脊液等)，等等。样品可以按照本领域技术人员所知的技术处理。样品可以是但不限于新鲜的、冷冻的或固定的。在一些实施方案中，样品包括福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织或新鲜冷冻的(FF)组织。样品可以包括培养的细胞，包括来源于受试样品的原代或永生化细胞系。样品也可以指来自受试者样品的提取物。例如，样品可以包括从组织或体液提取的DNA、RNA或蛋白质。可以获得许多用于此目的的技术和商品试剂盒。来自个体的新鲜样品可以用试剂处理以在诸如细胞裂解和提取的进一步加工之前保持RNA。样品可以包括为了其它目的收集的冷冻的样品。样品可以与相关的信息相结合，如受试者的年龄、性别和临床症状；样品的来源；和样品的收集和贮存方法。样品一般从受试者获得。
活检包括为了诊断或预后评价切除组织样品的过程，以及组织标本本身。本领域已知的任何活检技术可用于本发明的分子谱分析方法。应用的活检技术可取决于将要评价的组织类型(例如，结肠、前列腺、肾、膀胱、淋巴结、肝、骨髓、血细胞、肺、乳腺等)、肿瘤的大小和类型(例如，固体的或悬浮的，血液或腹水)，以及其它因素。代表性的活检技术包括但不限于切除活检、切开活检、针刺活检、手术活检和骨髓活检。“切除活检”是指切除整个肿瘤块，围绕着它有少量的正常组织。“切开活检”是指切除楔形组织，包括肿瘤的横截面直径。分子谱分析可以采用肿瘤块的“芯针活检”，或“细针吸活检”，后者通常从肿瘤块内获得细胞悬浮液。活检技术例如在Harrison′s Principles ofInternal Medicine，Kasper，等人，eds.，16th ed.，2005，第70章和整个第V部分讨论。
本领域已知的并且没有具体描述的标准分子生物学技术通常按照Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(1989)和Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Baltimore，Md.(1989)和Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley&Sons，NewYork(1988)和Watson等人，Recombinant DNA，Scientific American Books，New York和Birren等人(eds)Genome Analysis：A Laboratory ManualSeries，Vols.1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)和美国专利4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法，这些文献通过引用并入本文。聚合酶链反应(PCR)通常可以如PCR Protocols：A Guide to Methods和Applications，Academic Press，SanDiego，Calif.(1990)所述进行。
基因表达谱分析
在本发明的某些方面，生物标志物通过基因表达谱分析进行评估。基因表达谱分析方法包括基于多核苷酸的杂交分析的方法，和基于多核苷酸测序的方法。本领域已知用于定量样品中的mRNA表达的常用方法包括northern印迹法和原位杂交(Parker&Barnes(1999)Methods in Molecular Biology 106：247-283)；RNAse保护试验(Hod(1992)Biotechniques 13：852-854)；和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)(Weis等人(1992)Trends in Genetics 8：263-264)。此外，可以使用能够识别特定双链体(包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体)的抗体。代表性的基于测序的基因表达分析方法包括基因表达系列分析(SAGE)和通过大规模平行签名测序(MPSS)的基因表达分析。
逆转录酶PCR(RT-PCR)
RT-PCR可以用来确定本发明生物标志物的RNA水平，例如，mRNA或miRNA水平。RT-PCR可以用来比较不同样品群体中、正常和肿瘤组织中、进行药物治疗或不进行药物治疗的本发明生物标志物的这些RNA水平，以表征基因表达的模式，区别密切相关的RNA，以及分析RNA结构。
第一步是从样品中分离RNA，例如，mRNA。起始材料可以是分别从人肿瘤或肿瘤细胞系以及相应的正常组织或细胞系中分离的总RNA。因此，RNA可以从诸如肿瘤细胞或肿瘤细胞系的样品中分离，并与来自健康供体的合并的DNA进行比较。如果mRNA的来源是原发性肿瘤，则mRNA可以提取自例如冷冻的或保存的石蜡包埋的和固定的(例如福尔马林固定的)组织样品。
提取mRNA的常用方法是本领域公知的，并且在分子生物学标准教科书中公开，包括Ausubel等人(1997)Current Protocols of MolecularBiology，John Wiley and Sons。从石蜡包埋的组织中提取RNA的方法例如在Rupp&Locker(1987)Lab Invest.56：A67和De Andres等人，BioTechniques 18：42044(1995)中公开。特别是，RNA分离可以使用来自如Qiagen等厂商的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶按照使用说明进行(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)。例如，来自培养细胞的总RNA可以使用Qiagen RNeasy微型柱分离。大量RNA分离试剂盒可以购得，并且可以用于本发明的方法。
在替代方案中，第一步是从目标样品中分离miRNA。起始材料一般是分别从人肿瘤或肿瘤细胞系和相应的正常组织或细胞系中分离的总RNA。因此RNA可以从多种原发性肿瘤或肿瘤细胞系中分离，具有来自健康供体的合并的DNA。如果miRNA的来源是原发性肿瘤，则miRNA可以提取自例如冷冻的或保存的石蜡包埋的和固定的(例如福尔马林固定的)组织样品。
提取miRNA的常用方法是本领域公知的，并且在分子生物学标准教科书中公开，包括Ausubel等人(1997)Current Protocols ofMolecular Biology，John Wiley and Sons。从石蜡包埋的组织中提取RNA的方法例如在Rupp&Locker(1987)Lab Invest.56：A67和De Andres等人，Bio Techniques 18：42044(1995)中公开。特别是，RNA分离可以使用来自如Qiagen等厂商的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶按照使用说明进行。例如，来自培养细胞的总RNA可以使用Qiagen RNeasy微型柱分离。大量RNA分离试剂盒可以购得，并且可以用于本发明的方法。
无论RNA包括mRNA、miRNA还是其它类型的RNA，通过RT-PCR的基因表达谱分析可以包括RNA模板逆转录为cDNA，然后在PCR反应中扩增。常用的逆转录酶包括但不限于禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。逆转录步骤根据表达谱分析的情况和目的一般用特异性引物、随机六聚体或寡聚-dT引物引发。例如，提取的RNA可以使用GeneAmp RNAPCR试剂盒(Perkin Elmer，Calif.，USA)按照使用说明进行逆转录。衍生的cDNA然后可以用作后续PCR反应中的模板。
尽管PCR步骤可以使用多种热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶，但是一般使用Taq DNA聚合酶，该酶具有5′-3′活性但是缺乏3′-5′校正内切核酸酶活性。TaqMan PCR一般使用Taq或Tth聚合酶的5′-核酸酶活性水解与目标扩增子结合的杂交探针，但是也可以使用任何具有等同的5′核酸酶活性的酶。使用两种寡核苷酸产生PCR反应典型的扩增子。第三寡核苷酸或探针设计为检测位于两个PCR引物之间的核苷酸序列。探针不能用Taq DNA聚合酶延伸，并且用报道荧光染料和猝灭荧光染料标记。当两种染料在探针上靠近在一起时，来自报道染料的任何激光诱导的发射被猝灭染料猝灭。在扩增反应过程中，Taq DNA聚合酶以模板依赖的方式切割探针。得到的探针片段在溶液中解离，来自释放的报道染料的信号没有第二荧光团的猝灭效果。对于合成的每个新分子释放一个报道染料分子，对未猝灭的报道染料的检测为数据的定量解释提供了基础。
TaqManTM RT-PCR可以使用商业上可以获得的设备进行，例如，使用ABI PRISM 7700TM Sequence Detection SystemTM(Perkin-Elmer-Applied Biosystems，Foster City，Calif.，USA)或Lightcycler(RocheMolecular Biochemicals，Mannheim，Germany)。在一个特定实施方案中，5′核酸酶过程在实时定量PCR装置如ABI PRISM 7700TM SequenceDetection SystemTM上运行。该系统由热循环仪、激光器、电荷耦合器件(CCD)、照相机和计算机组成。该系统在热循环仪上以96孔形式扩增样品。在扩增过程中，通过光纤维缆对全部96个孔实时采集激光诱导的荧光信号，并用CCD检测。该系统包括用于运行该仪器和用于分析数据的软件。
TaqMan数据最初表示为Ct或阈值循环。如上所述，在每个循环过程中记录荧光值，代表扩增反应中到该点扩增的产物量。荧光信号第一次被记录为统计学显著性的点是阈值循环(Ct)。
为了使样品间差异的错误和影响最小化，通常使用内部标准进行RT-PCR。理想的内部标准在不同组织之间以恒定水平表示，并且不受实验治疗的影响。最常用来标准化基因表达模式的RNA是管家基因甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAPDH)和β-肌动蛋白的mRNA。
实时定量PCR(也称为定量实时聚合酶链反应，QRT-PCR或Q-PCR)是RT-PCR技术的一种较新的变化形式。Q-PCR可以通过双标记的荧光生成探针(即TaqManTM探针)测定PCR产物积累。实时PCR与其中使用每个目标序列的内部竞争剂进行标准化的定量竞争PCR匹配，并且与使用样品中所含标准化基因或管家基因进行RT-PCR的定量比较PCR匹配。参见，例如Held等人(1996)Genome Research 6：986-994。
免疫组化(IHC)
IHC是用特异性结合组织中抗原的结合抗体定位组织细胞中的抗原(例如，蛋白质)的过程。抗原结合抗体可以偶联或融合到允许其检测(例如通过显示)的标记上。在一些实施方案中，该标记是能够催化产色反应的酶，如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。酶可以融合到抗体上或使用非共价结合，例如使用生物素-亲和素系统。或者，抗体可以用诸如荧光素、罗丹明、DyLight Fluor或Alexa Fluor的荧光团标记。抗原结合抗体可以直接标记，或者它本身可以被携带标记的检测抗体识别。使用IHC，可以检测一种或多种蛋白质。基因产物的表达可能与其与对照水平相比的染色强度有关。在一些实施方案中，如果基因产物的染色在样品中相对于对照至少变化1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.2、2.5、2.7、3.0、4、5、6、7、8、9或10倍，则它被认为差异表达。
微阵列
本发明的生物标志物也可以利用微阵列技术鉴定、证实和/或测量。因此，表达谱生物标志物可以利用微阵列技术在新鲜的或石蜡包埋的肿瘤组织中测量。在该方法中，将目标多核苷酸序列置于或排列于微芯片基底上。排列的序列然后与来自目标细胞或组织的特异性DNA探针杂交。mRNA的来源可以是从样品(例如，人肿瘤或肿瘤细胞系和相应的正常组织或细胞系)分离的总RNA。因此RNA可以从多种原发性肿瘤或肿瘤细胞系中分离。如果mRNA的来源是原发性肿瘤，则可以从例如冷冻的或保存的石蜡包埋的并固定的(例如福尔马林固定的)组织样品中提取mRNA，这些样品是在每日临床实践中常规制备和保存的。
生物标志物的表达谱可以利用微阵列技术在新鲜的或石蜡包埋的肿瘤组织或体液中测量。在该方法中，将目标多核苷酸序列置于或排列于微芯片基底上。排列的序列然后与来自目标细胞或组织的特异性DNA探针杂交。与RT-PCR方法一样，miRNA的来源一般是从人肿瘤或肿瘤细胞系(包括体液)如血清、尿、泪和外来体和相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。因此RNA可以从多种来源分离。如果miRNA的来源是原发性肿瘤，则可以从例如冷冻的组织样品中提取miRNA，这些样品是在每日临床实践中常规制备和保存的。
在微阵列技术的特定实施方案中，将PCR扩增的cDNA克隆插入片段加到密集阵列中的基底上。在一个方面，将至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000或至少50,000个核苷酸序列加到基底上。每个序列可以对应于不同的基因，或者每个基因可以阵列排列多个序列。固定在微芯片上的微阵列排列的基因适合在严格条件下杂交。荧光标记的cDNA探针可以通过经逆转录从目标组织提取的RNA掺入荧光核苷酸来产生。加到芯片上的标记的cDNA探针与阵列上的每个DNA点特异性杂交。严格洗涤以除去非特异性结合的探针后，通过共聚焦激光显微术或通过另一种检测方法如CCD照相机扫描芯片。每个阵列排列的成分的杂交的定量允许评估相应的mRNA丰度。使用双色荧光，从两个RNA来源产生的分别标记的cDNA探针与阵列逐对杂交。同时测定来自对应于每个指定基因的两个来源的转录物的相对丰度。杂交的小型化允许方便和快速地评价大量基因的表达模式。已经证明这些方法具有检测每个细胞以较少拷贝数表达的罕见转录物以及可重复地检测表达水平的至少大约两倍差异所需的灵敏度(Schena等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(2)：106-149)。微阵列分析可以使用商购的设备按照使用手册进行，包括但不限于Affymetrix GeneChiptechnology(Affymetrix，Santa Clara，CA)、Agilent(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA)或Illumina(Illumina，Inc.，San Diego，CA)微阵列技术。
用于基因表达大规模分析的微阵列方法的发展使得能够系统地探索癌症分类的分子标志物和多种肿瘤类型中的结果预测。
在一些实施方案中，使用Agilent全人类基因组微阵列试剂盒(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA)。该系统可以分析超过41,000种独特的人类基因和代表的转录物，全部具有公共的注释。该系统按照使用说明使用。
在一些实施方案中，使用Illumina全基因组DASL试验(IlluminaInc.，San Diego，CA)。该系统提供以高通量方式同时对来自最小RNA输入量的超过24,000个转录物进行谱分析的方法，它们来自新鲜冷冻的(FF)和福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织来源。
微阵列表达分析包括确定基因或基因产物相对于参照是上调还是下调。这种确定可以使用统计学检验来进行，以确定观察到的任何差异表达的统计学显著性。在一些实施方案中，使用参数统计检验确定统计学显著性。参数统计检验可以包括，例如，部分析因设计、方差分析(ANOVA)、t-检验、部分析因设计、Pearson相关、简单线性回归、非线性回归、多元线性回归、或多元非线性回归。此外，参数统计检验也可以包括单因素方差分析、两因素方差分析或方差的重复测量分析。在其它实施方案中，使用非参数统计检验确定统计学显著性。例子包括但不限于Wilcoxon符号秩检验、Mann-Whitney检验、Kruskal-Wallis检验、Friedman检验、Spearman秩次序相关系数、Kendall Tau分析和非参数回归检验。在一些实施方案中，以小于大约0.05，0.01，0.005，0.001，0.0005或0.0001的p-值确定统计学显著性。尽管本发明的方法中使用的微阵列系统可以测定上千种转录物，但是数据分析只需要对感兴趣的转录物进行，从而减少了进行多种统计检验中固有的多重比较的问题。p-值也可以对多重比较进行校正，例如，使用Bonferroni校正、其改良方法或其它本领域技术人员已知的技术，例如，Hochberg校正、Holm-Bonferroni校正、校正或Dunnett′s校正。也可以考虑差异表达的程度。例如，当与对照相比的表达变化总数为样品相对于对照相差至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.2、2.5、2.7、3.0、4、5、6、7、8、9或10倍时，可以认为基因差异表达。差异表达考虑过表达和欠表达。如果差异表达满足统计阈值、倍数变化阈值或两者，可以认为基因或基因产物上调或下调。例如，确定差异表达的标准可以包括p-值为0.001和倍数变化至少为1.5倍(上或下)。本领域技术人员应当理解，这些统计和阈值测量可以适合通过本文公开的任何分子谱分析技术确定差异表达。
本发明的各种方法利用多种微阵列，检测样品中生物实体的存在和可能的量。阵列一般含有可定位的部分，该部分可检测样品中实体的存在，例如，通过结合事件。微阵列包括但不限于DNA微阵列，如cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列和SNP微阵列、microRNA阵列、蛋白质微阵列、抗体微阵列、组织微阵列、细胞微阵列(也称为转染微阵列)、化学化合物微阵列和碳水化合物阵列(糖阵列)。DNA阵列一般包括可定位的能够结合样品中存在的序列的核苷酸序列。MicroRNA阵列，例如，来自University of Louisville的MMChips阵列，或来自Agilent的商业系统，可用来检测microRNA。蛋白质微阵列可以用来确定蛋白质-蛋白质相互作用，包括但不限于确定蛋白质激酶的底物、转录因子蛋白质-激活，或确定生物活性小分子的靶标。蛋白质阵列可包括不同蛋白质分子(通常为抗体)或结合目标蛋白质的核苷酸序列的阵列。抗体微阵列包括点样至蛋白质芯片上的抗体，该抗体用作捕获分子，检测来自诸如细胞或组织裂解溶液的样品的蛋白质或其它生物材料。例如，抗体阵列可用来检测来自例如血清或尿的体液的生物标志物，用于诊断应用。组织微阵列包括以阵列形式装配的单独的组织核心，以允许多重组织学分析。细胞微阵列也被称为转染微阵列，包括各种捕获剂，如抗体、蛋白质或脂质，它们可以与细胞相互作用，以利于它们被捕获在可寻址的位置上。化学化合物微阵列包括化学化合物的阵列，并可用来检测蛋白质或其它结合化合物的生物材料。碳水化合物阵列(糖阵列)包括碳水化合物的阵列，可以检测，例如，结合糖部分的蛋白质。本领域技术人员应当理解，根据本发明的方法可以使用类似的方法或改进。
通过大规模平行签名测序(MPSS)的基因表达分析
该方法由Brenner等人(2000)Nature Biotechnology 18：630-634描述，是一种组合了非基于凝胶的签名测序以及在单独的微珠上体外克隆上百万个模板的测序方法。首先，DNA模板的微珠文库通过体外克隆构建。然后以高密度在流动池中装配含模板微珠的平面阵列。每个微珠上克隆的模板的自由端使用基于荧光的签名测序方法同时分析，该方法不需要DNA片段分离。已经证明该方法在一次操作中同时和精确地提供成百上千个来自cDNA文库的基因签名序列。
MPSS数据具有许多用途。几乎全部转录物的表达水平都可以测定；签名的丰度代表分析的组织中的基因的表达水平。用于分析标签频率和检测文库间差异的定量方法已经发表，并且并入SAGETM数据的公共数据库中，适用于MPSS数据。全基因组序列的可用性允许直接比较签名与基因组序列，并进一步扩展了MPSS数据的应用。因为MPSS分析的目标没有预先选择(如在微阵列上)，MPSS数据可以表征转录组的完全复杂性。这类似于一次对上百万个EST测序，可以使用基因组序列数据，使得可以通过计算手段容易地鉴别MPSS签名的来源。
基因表达系列分析(SAGE)
基因表达系列分析(SAGE)是一种允许同时定量分析大量基因转录物的方法，不需要为每个转录物提供单独的杂交探针。首先，产生短序列标签(例如，大约10-14bp)，其含有足够的唯一确定转录物的信息，条件是该标签从每种转录物内的独特位置获得。然后，将许多转录物连接在一起，形成长系列分子，该分子可以测序，同时揭示多个标签的身份。可以通过确定各个标签的丰度，并确定对应于每个标签的基因，来定量评估任何转录物群体的表达模式。参见，例如Velculescu等人(1995)Science 270：484-487；和Velculescu等人(1997)Cell 88：243-51。
DNA拷贝数谱分析
任何能够确定特定样品的DNA拷贝数谱的方法可以用于本发明的分子谱分析，只要分辨率足以确定本发明的生物标志物。本领域技术人员知道并且能够利用大量不同的平台以足以确定一种或多种本发明生物标志物的拷贝数的分辨率评估全基因组拷贝数变化。一些平台和技术在下面的实施方案中描述。
在一些实施方案中，拷贝数谱分析包括通过全基因组扩增方法扩增全基因组DNA。全基因组扩增方法可以使用标准置换聚合酶和随机引物。
在这些实施方案的某些方面，拷贝数谱分析包括全基因组扩增的DNA与高密度阵列杂交。在更具体的方面，高密度阵列具有5,000个或更多的不同的探针。在另一个具体方面，高密度阵列具有5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000个或更多的探针。在另一个具体方面，阵列上的每个不同的探针是长度为大约15-200个碱基的寡核苷酸。在另一个具体方面，阵列上的每个不同的探针是长度为大约15-200、15-150、15-100、15-75、15-60或20-55个碱基的寡核苷酸。
在一些实施方案中，微阵列用来帮助确定样品(例如来自肿瘤的细胞)的拷贝数谱型。微阵列一般包括多种寡聚体(例如，DNA或RNA多核苷酸或寡核苷酸，或其它聚合物)，它们是合成的或以阵列模式沉积在基底(例如，玻璃支持体)上。与支持体结合的寡聚体是“探针”，它们用来在杂交实验中杂交或结合样品材料(例如，从肿瘤样品制备或获得的核酸)。相反的情况也可适用：样品可以结合到微阵列基底上，寡聚体探针在溶液中用于杂交。在使用中，阵列表面与一个或多个目标在有利于靶标与一个或多个探针特异性、高亲和力结合的条件下接触。在一些设置中，样品核酸用可检测标记物标记，例如荧光标记，使得用扫描设备可以检测杂交的样品和探针。DNA阵列技术具有使用多种(例如，成百上千)不同寡核苷酸分析DNA拷贝数谱型的潜力。在一些实施方案中，用于阵列的基底是表面衍生化的玻璃或硅石，或聚合物膜表面(参见，例如，Z.Guo，等人，Nucleic Acids Res，22，5456-65(1994)；U.Maskos，E.M.Southern，Nucleic Acids Res，20，1679-84(1992)，和E.M.Southern，等人，Nucleic Acids Res，22，1368-73(1994)，均通过引用并入本文)。阵列基底表面的改性可以通过多种技术实现。例如，含硅或金属氧化物表面可以用双官能硅烷衍生化，即具有能够与表面共价结合的第一官能团(例如，Si-卤素或Si-烷氧基，如分别在--SiCl3或--Si(OCH3)3中)和能够使表面具有希望的化学和/或物理修饰的第二官能团的硅烷，以共价或非共价连接配体和/或聚合物或单体用于生物探针阵列。甲硅烷基化衍生和本领域已知的其它表面衍生(参见例如Sundberg的美国专利5,624,711，Willis的美国专利5,266,222，和Farnsworth的美国专利5,137,765，均通过引用并入本文)。其它制备阵列的方法在转让给Agilent Corp.的Bass等人的美国专利6,649,348中描述，其中公开了通过原位合成方法产生的DNA阵列。
聚合物阵列合成也在包括以下的文献中广泛描述：WO 00/58516，美国专利5,143,854，5,242,974，5,252,743，5,324,633，5,384,261，5,405,783，5,424,186，5,451,683，5,482,867，5,491,074，5,527,681，5,550,215，5,571,639，5,578,832，5,593,839，5,599,695，5,624,711，5,631,734，5,795,716，5,831,070，5,837,832，5,856,101，5,858,659，5,936,324，5,968,740，5,974,164，5,981,185，5,981,956，6,025,601，6,033,860，6,040,193，6,090,555，6,136,269，6,269,846和6,428,752，5,412,087，6,147,205，6,262,216，6,310,189，5,889,165，和5,959,098，PCT申请Nos.PCT/US99/00730(国际公布No.WO 99/36760)和PCT/US01/04285(国际公布No.WO 01/58593)，均为了所有目的通过引用全部并入本文。
可用于本发明的核酸阵列包括但不限于可从Affymetrix(SantaClara，Calif.)以商品名GeneChipTM购买到的阵列。阵列实例在affymetrix.com网站显示。另一个微阵列供应商是Illumina，Inc.，SanDiego，Calif.，其阵列实例在其网站illumina.com上显示。
在一些实施方案中，本发明的方法提供样品制备。根据微阵列和将要进行的实验，样品核酸可以通过本领域技术人员已知的方法以大量方式制备。在本发明的某些方面，在基因分型(拷贝数谱分析)之前或同时，可以通过任何数目的机制扩增样品。最常用的扩增方法包括PCR。参见，例如，PCR Technology：Principles and Applications forDNA Amplification(Ed.H.A.Erlich，Freeman Press，NY，N.Y.，1992)；PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(Eds.Innis，等人，AcademicPress，San Diego，Calif.，1990)；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19，4967(1991)；Eckert等人，PCR Methods and Applications 1，17(1991)；PCR(Eds.McPherson等人，IRL Press，Oxford)；和美国专利4,683,202，4,683,195，4,800,1594,965,188和5,333,675，均为了所有目的全文并入本文作为参考。在一些实施方案中，可以在阵列上扩增样品(例如，美国专利6,300,070，通过引用并入本文)。
其它合适的扩增方法包括连接酶链反应(LCR)(例如，Wu和Wallace，Genomics 4，560(1989)，Landegren等人，Science 241，1077(1988)和Barringer等人Gene 89：117(1990))、转录扩增(Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989)和WO88/10315)、自我持续序列复制(Guatelli等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990)和WO90/06995)、靶多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利6,410,276)、共有序列引发的聚合酶链反应(CP-PCR)(美国专利4,437,975)、任意引发的聚合酶链反应(AP-PCR)(美国专利5,413,909，5,861,245)和基于核酸的序列扩增(NABSA)。(参见，美国专利5,409,818，5,554,517，和6,063,603，均通过引用并入本文)。其它可以使用的扩增方法在美国专利5,242,794、5,494,810、4,988,617和U.S.Ser.No.09/854,317中描述，均通过引用并入本文。
其它样品制备方法和减少核酸样品复杂性的技术在Dong等人，Genome Research 11，1418(2001)、美国专利6,361,947，6,391,592和U.S.Ser.Nos.09/916,135，09/920,491(美国专利申请公布20030096235)、09/910,292(美国专利申请公布20030082543)和10/013,598中描述。
进行多核苷酸杂交试验的方法在本领域中已经开发。本发明的方法中使用的杂交试验程序和条件将根据应用而不同，并且按照已知的普通结合方法进行选择，包括以下提到的：Maniatis等人MolecularCloning：A Laboratory Manual(2.sup.nd Ed.Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)；Berger和Kimmel Methods in Enzymology，Vol.152，Guide toMolecular Cloning Techniques(Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.，1987)；Young和Davism，P.N.A.S，80：1194(1983)。用于进行重复和受控杂交反应的方法和装置已经在美国专利5,871,928、5,874,219、6,045,996和6,386,749、6,391,623中描述，均通过引用并入本文。
本发明的方法也可以包括杂交之后(和/或期间)配体之间杂交的信号检测。参见美国专利5,143,854，5,578,832；5,631,734；5,834,758；5,936,324；5,981,956；6,025,601；6,141,096；6,185,030；6,201,639；6,218,803；和6,225,625，U.S.Ser.No.10/389,194和PCT申请PCT/US99/06097(公布为WO99/47964)，均为了所有目的全文并入本文作为参考。
用于信号检测和强度数据加工的方法和装置例如在美国专利5,143,854，5,547,839，5,578,832，5,631,734，5,800,992，5,834,758；5,856,092，5,902,723，5,936,324，5,981,956，6,025,601，6,090,555，6,141,096，6,185,030，6,201,639；6,218,803；和6,225,625，in U.S.Ser.Nos.10/389,194，60/493,495和PCT申请PCT/US99/06097(公布为WO99/47964)中公开，均为了所有目的全文并入本文作为参考。
序列分析
本发明的分子谱分析包括通过确定个体在一种或多种基因或基因产物中是否具有一个或多个核苷酸变体(或氨基酸变体)而对一种或多种生物标志物进行基因分型的方法。在一些实施方案中，根据本发明的方法对一种或多种基因基因分型可以为选择治疗提供更多证据。
本发明的生物标志物可以通过通过任何可用于确定核酸或其编码的蛋白质中的变化的方法分析。根据一个实施方案，本领域普通技术人员能够分析一种或多种基因的突变，包括缺失突变、插入突变、移码突变、无义突变、错义突变和剪接突变。
用于分析一种或多种基因的核酸可以利用标准方法从样品中的细胞分离(Sambrook等人，1989)。例如，核酸可以是基因组DNA或分级分离的或全细胞RNA，或从外来体或细胞表面获得的miRNA。使用RNA时，可以希望将RNA转化为互补DNA。在一个实施方案中，RNA是全细胞RNA；在另一个实施方案中，是聚-A RNA；在另一个实施方案中，是外来体RNA。通常，扩增核酸。根据分析一个或多个基因的试验的形式，具体的目标核酸直接使用扩增在样品中检测，或者在扩增后使用第二已知的核酸。然后，检测确定的产物。在某些应用中，检测可以通过可视手段进行(例如，凝胶的溴化乙锭染色)。此外，检测可涉及产物的间接鉴定，通过化学发光、放射标记或荧光标记的放射闪烁显像，或者甚至通过采用电或热脉冲信号的系统(AffymaxTechnology；Bellus，1994)。
已知本发明的生物标志物存在各种类型的缺陷。变异包括但不限于缺失、插入、点突变和复制。点突变可以是沉默的，或者可以导致终止密码子、移码突变或氨基酸置换。一个或多个基因的编码区之内和之外的突变可以发生，并且可以根据本发明的方法分析。目标核酸的靶位点可以包括其中序列变化的区域。例子包括但不限于以多种形式存在的多态性，如单核苷酸变异、核苷酸重复、多碱基缺失(共有序列缺失超过一个核苷酸)、多碱基插入(从共有序列插入超过一个核苷酸)、微卫星重复(少量核苷酸重复，具有典型的5-1000个重复单元)、二核苷酸重复、三核苷酸重复、序列重排(包括易位和复制)、嵌合序列(来自不同基因来源的两个序列融合在一起)，等等。在序列多态性中，人基因组中最频繁的多态性是单碱基变异，也称为单核苷酸多态性(SNP)。SNP富含、稳定并广泛分布在基因组中。
分子谱分析包括对一个或多个基因进行单体型分析的方法。单体型是位于一个染色体上的一组遗传决定簇，它一般在染色体区域中含有特定组合的等位基因(基因的所有备选序列)。换句话说，单体型是个体染色体上的位相序列信息。通常，染色体上的位相SNP定义了单体型。染色体上的单体型组合可以确定细胞的遗传谱。单体型确定特定遗传标志物和疾病突变之间的连锁。单体型分析可以通过本领域已知的任何方法进行。常用的SNP评分方法包括杂交微阵列或直接凝胶测序，在Landgren等人，Genome Research，8：769-776，1998中概述。例如，可以只从个体中分离一个或多个基因的一个拷贝，并确定每个变异位点处的核苷酸。或者，可以利用等位基因特异性PCR或类似的方法扩增个体中的一个或多个基因的仅一个拷贝，并且确定本发明的变异位点处的SNP。本领域已知的Clark方法也可以用于单体型分析。高通量分子单体型分析方法也在Tost等人，Nucleic Acids Res.，30(19)：e96(2002)中公开，其通过引用并入本文。
因此，与本发明的变体和/或单体型连锁不平衡的其它变体可以通过本领域已知的单体型分析方法确定，这是遗传学和单体型分析领域的技术人员清楚的。与本发明的变体和/或单体型连锁不平衡的其它变体也可用于如下所述的各种应用中。
为了基因分型和单体型分析，基因组DNA和mRNA/cDNA都可使用，在本文中通称为“基因”。
大量检测核苷酸变体的技术是本领域已知的，并且均可用于本发明的方法。该技术可以是基于蛋白质的或基于核酸的。在任一种情况中，使用的技术必须足够灵敏，以精确地检测小核苷酸或氨基酸变异。通常，使用以可检测标记物标记的探针。除非在以下所述的特定技术中另外说明，可以使用本领域已知的任何合适的标记物，包括但不限于放射性同位素、荧光化合物、可使用链霉亲和素检测的生物素、酶(例如，碱性磷酸酶)、酶底物、配体和抗体等。参见Jablonski等人，Nucleic Acids Res.，14：6115-6128(1986)；Nguyen等人，Biotechniques，13：116-123(1992)；Rigby等人，J.Mol.Biol.，113：237-251(1977)。
在基于核酸的检测方法中，目标DNA样品，即含有对应于一个或多个基因的基因组DNA、cDNA、mRNA和/或miRNA的样品，必须从待测个体中获得。可以使用含有对应于一个或多个基因的基因组DNA、miRNA、mRNA和/或cDNA(或其部分)的任何组织或细胞样品。为此目的，可以从个体获得含有细胞核因此含有基因组DNA的组织样品。血样也是有用的，除了仅白细胞和其它淋巴细胞具有细胞核，而红细胞不含细胞核，只含有mRNA或miRNA。然而，miRNA和mRNA也是有用的，可以分析其序列中是否存在核苷酸变体，或用作cDNA合成的模板。组织或细胞样品可以不经进一步加工直接分析。或者，包括靶序列的核酸在进行下述各种检测方法之前可以提取、纯化和/或扩增的。除了组织或细胞样品，cDNA或来自cDNA的基因组DNA或使用从待测个体获得的组织或细胞构建的基因组DNA文库也是有用的。
序列分析
为了确定特定核苷酸变体的存在或不存在，靶基因组DNA或cDNA的测序，特别是包含待测核苷酸变体基因座的区域。各种测序技术通常是本领域中公知的和广泛，包括Sanger法和Gilbert化学法。焦磷酸测序法使用发光计量检测系统实时监测DNA合成。已经证明焦磷酸测序可有效分析遗传多态性，如单核苷酸多态性，并且也可以用于本发明中。参见Nordstrom等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，31(2)：107-112(2000)；Ahmadian等人，Anal.Biochem.，280：103-110(2000)。
核酸变体可以通过合适的检测方法检测。检测、定量等方法的非限制性实例包括：质量改变的扩增子的质量检测(例如，基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱法和电喷射(ES)质谱法)、引物延伸法(例如，iPLEXTM；Sequenom，Inc.)、微量测序法(例如，引物延伸法的变型)、连接酶测序确定法(例如，美国专利5,679,524和5,952,174和WO01/27326)、错配序列确定法(例如，美国专利5,851,770；5,958,692；6,110,684；和6,183,958)、直接DNA测序、限制片段长度多态性(RFLP分析)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)分析、甲基化特异性PCR(MSPCR)、焦磷酸测序分析、acycloprime分析、反向斑点印迹法、GeneChip微阵列、动态等位基因特异性杂交(DASH)、肽核酸(PNA)和锁定核酸(LNA)探针、TaqMan、分子信标、嵌入染料、FRET引物、AlphaScreen、SNPstream、遗传位分析(GBA)、多重微测序、SNaPshot、GOOD分析、微阵列miniseq、阵列引物延伸(APEX)、微阵列引物延伸(例如，微阵列序列确定方法)、标签阵列、编码微球体、模板指导的掺入(TDI)、荧光偏振、比色寡核苷酸连接试验(OLA)、序列编码OLA、微阵列连接、连接酶链反应、加锁探针、侵入试验、杂交方法(例如，使用至少一种探针的杂交，使用至少一种荧光标记的探针的杂交，等等)、常规斑点印迹分析、单链构象多态性分析(SSCP，例如，美国专利5,891,625和6,013,499；Orita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：27776-2770(1989))、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、异常源双链体分析、错配切割检测，和Sheffield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA49：699-706(1991)，White等人，Genomics 12：301-306(1992)，Grompe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5855-5892(1989)，和Grompe，NatureGenetics 5：111-117(1993)所述的技术，克隆和测序，电泳，使用杂交探针和定量实时聚合酶链反应(QRT-PCR)，数字PCR，纳米孔测序，芯片，以及它们的组合。等位基因或横向同源物的检测和定量可以使用2007年12月4日申请的美国专利申请Ser.No.11/950,395所述的“闭管”法进行。在一些实施方案中，核酸物质的量通过质谱法、引物延伸、测序(例如，任何合适的方法，例如纳米孔或焦磷酸测序)、定量PCR(Q-PCR或QRT-PCR)、数字PCR、它们的组合等等来确定。
本文使用的术语“序列分析”是指确定核苷酸序列，例如，扩增产物的核苷酸序列。可以确定多核苷酸例如DNA或mRNA的完整序列或部分序列，确定的核苷酸序列可以被称为“读数”或“序列读数”。例如，在一些实施方案中，线性扩增产物可以直接分析而无需进一步扩增(例如，通过使用单分子测序方法)。在某些实施方案中，线性扩增产物可以进一步扩增，然后分析(例如，使用通过连接或焦磷酸测序方法测序)。读数可以进行不同类型的序列分析。任何合适的测序方法可以用来检测和确定核苷酸物质、扩增的核酸物质或由上述产生的可检测产物的量。某些测序方法的例子在下面描述。
序列分析装置或序列分析部件包括装置，和与该装置结合使用的一个或多个部件，它们可由本领域普通技术人员用来确定此处所述方法产生的核苷酸序列(例如，线性和/或指数扩增产物)。测序平台的例子包括但不限于454平台(Roche)(Margulies，M.等人2005 Nature 437，376-380)、Illumina基因组分析仪(或Solexa platform)或SOLID系统(AppliedBiosystems)或Helicos True单分子DNA测序技术(Harris TD等人2008Science，320，106-109)、Pacific Biosciences的单分子实时(SMRTTM)技术，和纳米孔测序(Soni G V和Meller A.2007Clin Chem 53：1996-2001)。这些平台允许以平行方式以高级多路技术对从标本分离的许多核酸分子进行测序(Dear Brief Funct Genomic Proteomic 2003；1：397-416)。这些平台中的每一个允许对核酸片段的克隆扩增的或非扩增的单分子进行测序。某些平台涉及，例如，通过染料修饰的探针的连接(包括周期连接和切割)进行测序、焦磷酸测序和单分子测序。核苷酸序列物质、扩增核酸物质和由其产生的可检测产物可以通过这些序列分析平台进行分析。
通过连接的测序是依赖于DNA连接酶对碱基配对错配的灵敏度的核酸测序方法。DNA连接酶将正确碱基配对的DNA的末端连接在一起。DNA连接酶只将正确碱基配对的DNA末端连接在一起的能力与荧光标记的寡核苷酸或引物的混合池结合起来，能够通过荧光检测进行序列测定。通过包括包含可切割连接的引物可以获得更长的序列读数，该可切割连接可以在标志物鉴定后切割。连接体处的切割切除标志物，并且在连接的引物的末端再生5′磷酸，准备引物用于另一轮连接。在一些实施方案中，引物可以用一种以上的荧光标志物(例如，至少1、2、3、4或5种荧光标记物)标记。
通过连接的测序一般包括以下步骤。克隆珠群体可以在乳液微反应器中制备，其中含有靶核酸模板序列、扩增反应成分、珠和引物。扩增后，使模板变性，进行珠富集，以使具有延伸模板的珠与不希望的珠(例如，不含延伸的模板的珠)分离。选择的珠上的模板经历3′修饰，以允许与载玻片共价键合，修饰的珠可以沉积到载玻片上。沉积室提供在珠加载过程中将载玻片分隔为一个、四个或八个区室的能力。为了序列分析，引物与衔接子序列杂交。一组四色染料标记的探针竞争与测序引物的连接。探针连接的特异性通过在连接系列过程中每第4个和第5个碱基进行查询来实现。5至7轮连接、检测和切割在每5个位置记录颜色，轮数取决于使用的文库的类型。每轮连接后，在5′方向补偿一个碱基的新的互补引物用于另一系列连接。引物重设和连接轮(每轮5-7个连接循环)连续重复5次，以对于单个标签产生25-35个碱基对的序列。对于配对测序，对第二标签重复该过程。
焦磷酸测序是基于合成测序的核酸测序方法，它依赖于核苷酸掺入时释放的焦磷酸的检测。通常，合成测序包括一次一个核苷酸地合成与正试图测序的链互补的DNA链。靶核酸可以固定在固体支持体上，与测序杂交杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5′磷酸硫酸和萤光素孵育。连续添加和除去核苷酸溶液。核苷酸的正确掺入释放焦磷酸盐，焦磷酸盐与ATP硫酸化酶相互作用，在腺苷5′磷酸硫酸的存在下产生ATP，供给萤光素反应，产生允许确定序列的化学发光信号。产生的光的量与添加的碱基数成比例。因此，可以确定测序引物下游的序列。一个示例性的焦磷酸测序系统包括以下步骤：将衔接子核酸连接到所研究的核酸，将得到的核酸与珠杂交；扩增乳液中的核苷酸序列；使用皮升多孔固体支持体分选珠；和通过焦磷酸测序法对扩增的核苷酸序列进行测序(例如，Nakano等人，″单分子PCR using water-in-oil emulsion；″Journal ofBiotechnology 102：117-124(2003))。
某些单分子测序实施方案基于合成测序原理，并且利用单分子对荧光共振通量转移(单分子对FRET)作为由于成功核苷酸掺入而发射光子的机制。发射的光子通常使用强化的或高灵敏度冷却的电荷耦合装置结合全内反射显微镜检查(TIRM)来检测。光子只在引入的反应溶液含有将掺入由测序过程合成的正在延长的核酸链内的正确核苷酸时才发射。在基于FRET的单分子测序中，通过长程偶极相互作用，能量在两个荧光染料(有时为聚甲炔花青染料Cy3和Cy5)之间转移。供体在其特定激发波长激发，激发态能量非辐射地转移到接受染料，接受染料随后变为激发。接受染料最后通过光子的辐射发射返回基态。能量转移过程中使用的两种染料代表单分子对FRET中的“单分子对”。Cy3通常用作供体荧光团，并且通常作为第一标记核苷酸掺入。Cy5通常用作接受荧光团，并且作为核苷酸标记用于掺入第一Cy3标记核苷酸后的连续核苷酸添加。为了成功发生能量转移，荧光团通常在彼此10纳米内。
可以基于单分子测序使用的系统的一个例子通常包括使引物与靶核酸序列杂交以产生复合物；使复合物与固相缔合；反复使引物延伸用荧光分子标记的核苷酸；和在每个反复后捕获荧光共振能量转移信号图像(例如，美国专利7,169,314；Braslavsky等人，PNAS 100(7)：3960-3964(2003))。这种系统可以用来直接对通过此处所述的方法产生的扩增产物(线性或指数扩增的产物)进行测序。在一些实施方案中，扩增产物可以与含有与固体支持体(例如珠或载玻片)上存在的固定捕获序列互补的序列的引物杂交。引物-扩增产物复合物与固定捕获序列的杂交将扩增产物固定在用于基于单分子对FRET的合成测序的固体支持体上。引物通常是荧光引物，因此可以产生具有固定核酸的载玻片表面的初始参考图像。初始参考图像可用于确定发生真正核苷酸掺入的位置。在开始时在“仅有引物”参考图像中没有识别到的阵列位置检测到的荧光信号作为非特异性荧光排除。固定引物-扩增产物复合物后，结合的核酸通常通过以下重复步骤平行测序：a)在一种荧光标记的核苷酸的存在下聚合酶延伸，b)使用合适的显微镜检查例如TIRM检测荧光，c)除去荧光核苷酸，和d)返回步骤a，使用不同荧光标记的核苷酸。
在一些实施方案中，核苷酸测序可以通过固相单核苷酸测序法和过程。固相单核苷酸测序法包括在单分子样品核酸与单分子固体支持体杂交的条件下接触靶核酸和固体支持体。这样的条件可以包括在“微反应器”中提供固体支持体分子和单分子靶核酸。这样的条件也可以包括提供混合物，在该混合物中靶核酸分子可以与固体支持体上的固相核酸杂交。在此处所述的实施方案中有用的单核苷酸测序法在2008年1月17日提交的美国临时专利申请No.61/021,871中描述。
在某些实施方案中，纳米孔测序检测方法包括：(a)在检测剂与基础核酸的基本互补亚序列特异性杂交的条件下，将用于测序的靶核酸(“基础核酸”，例如，连接的探针分子)与序列特异性检测剂接触；(b)检测来自检测剂的信号；和(c)根据检测到的信号确定基础核酸的序列。在某些实施方案中，当检测剂在基础核酸通过孔时干扰纳米孔结构时，与基础核酸杂交的检测剂与基础核酸分离(例如，连续分离)，并检测从基础序列分离的检测剂。在一些实施方案中，从基础核酸分离的检测剂发出可检测的信号，与基础核酸杂交的检测剂发出不同的可检测信号或没有可检测信号。在某些实施方案中，核酸(例如，连接的探针分子)中的核苷酸被对应于特定核苷酸(″核苷酸代表″)的特定核苷酸序列取代，从而产生扩展的核酸(例如，美国专利6,723,513)，并且检测剂与用作基础核酸的扩展的核酸中的核苷酸代表杂交。在这些实施方案中，核苷酸代表可以排列为二元或更高级排列(例如，Soni和Meller，Clinical Chemistry 53(11)：1996-2001(2007))。在一些实施方案中，核酸不扩展，不产生扩展的核酸，并且直接用作基础核酸(例如，连接的探针分子用作非扩展的基础核酸)，并且检测剂直接接触基础核酸。例如，第一检测剂可以与第一亚序列杂交，第二检测剂可以与第二亚序列杂交，其中第一检测剂和第二检测剂各自具有能够将其彼此区别的可检测标记；并且其中当检测剂与基础核酸解离时，来自第一检测剂和第二检测剂的信号可以彼此区分。在某些实施方案中，检测剂包括与基础核酸杂交的区域(例如，两个区域)，它们的长度可以是大约3个至大约100个核苷酸(例如大约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95个核苷酸的长度)。检测剂也可以包括不与基础核酸杂交的核苷酸的一个或多个区域。在一些实施方案中，检测剂是分子信标。检测剂通常包含一个或多个独立地选自本文所述的可检测标记。每个可检测标记可以用任何方便的能够检测每种标记产生的信号(例如，磁、电、化学、光学等)的检测方法检测。例如，CD照相机可以用来检测来自一个或多个与检测剂连接的可区别的量子点的信号。
在某些序列分析实施方案中，读数可以用来构建较大的核苷酸序列，通过确定不同读数中的重叠序列以及通过使用读数中的鉴别序列有利于这种构建。这样的用于从读数构建较大序列的序列分析方法和软件是本领域普通技术人员已知的(例如，Venter等人，Science 291：1304-1351(2001))。特定的读数、部分核苷酸序列构建体和完整核苷酸序列构建体可以在样品核酸内的核苷酸序列之间比较(即内部比较)，或者在某些序列分析实施方案中可以与参照序列比较(即参照比较)。在从多种样品或从含有序列变异的一个样品来源制备样品核酸的情况下可以进行内部比较。当参照核苷酸序列已知并且目的在于确定样品核酸是否含有与参照核苷酸序列基本类似或相同或不同的核苷酸序列时，有时进行参照比较。利用上述的序列分析装置和部件可促进序列分析。
引物延伸多态性检测方法在本文中也被称为“微测序”法，一般通过将互补寡核苷酸与携带多态性位点的核酸杂交而进行。在这些方法中，寡核苷酸一般邻近多态性位点杂交。在“微测序”法中使用的术语“邻近”是指当延伸寡核苷酸与该核酸杂交时，延伸寡核苷酸的3′末端有时与核酸中多态性位点的5′末端相距1个核苷酸，与多态性位点的5′末端相距通常2或3个，有时4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。延伸寡核苷酸于是扩展一个或多个核苷酸，通常1、2或3个核苷酸，添加到延伸寡核苷酸的核苷酸的数目和/或类型确定了存在哪种或哪些多态性变异。寡核苷酸延伸方法例如公开在美国专利4,656,127；4,851,331；5,679,524；5,834,189；5,876,934；5,908,755；5,912,118；5,976,802；5,981,186；6,004,744；6,013,431；6,017,702；6,046,005；6,087,095；6,210,891；和WO 01/20039中。延伸产物可以通过多种方式检测，如通过荧光法(参见，例如，Chen&Kwok，Nucleic Acids Research 25：347-353(1997)和Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94/20：10756-10761(1997))或通过质谱法(例如，MALDI-TOF质谱法)和本文所述的其它方法。利用质谱法的寡核苷酸延伸方法例如在美国专利5,547,835；5,605,798；5,691,141；5,849,542；5,869,242；5,928,906；6,043,031；6,194,144；和6,258,538中描述。微测序检测方法通常在延伸步骤前加入了扩增过程。扩增过程一般从核酸样品扩增含有多态性位点的区域。扩增可以利用上述方法进行，或者例如在聚合酶链反应(PCR)中使用一对寡核苷酸引物进行，其中一个寡核苷酸引物一般互补于位于多态性3′的区域，另一个一般互补于位于多态性5′的区域。PCR引物对可以用于例如美国专利4,683,195；4,683,202，4,965,188；5,656,493；5,998,143；6,140,054；WO 01/27327；和WO 01/27329公开的方法中。PCR引物对也可以用于任何商购的进行PCR的机器，例如可从Applied Biosystems获得的任一种GeneAmpTM系统。
其它合适的测序方法包括多路聚合酶克隆测序(如Shendure等人，Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome，Sciencexpress，Aug.4，2005，pg 1所述，可见www.sciencexpress.org/4Aug.2005/Page1/10.1126/science.1117389，通过引用并入本文)，它使用固定的微珠，并且在微制造的皮升反应器中测序(如Margulies等人，Genome Sequencing in Microfabricated High-Density Picolitre Reactors，Nature，August 2005所述，可见www.nature.com/nature(在线发表于2005年7月31日，doi：10.1038/nature03959，通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，全基因组测序也可以用于区别RNA转录物的等位基因。全基因组测序方法的例子包括但不限于基于纳米孔的测序方法、合成测序和连接测序，如上所述。
原位杂交
原位杂交试验是众所周知的，概括性地描述于Angerer等人，Methods Enzymol.152：649-660(1987)。在原位杂交试验中，细胞，例如来自活检的细胞，固定在固体支持物上，一般固定在载玻片上。如果探查DNA，则细胞用热或碱变性。细胞然后在适中的温度下与杂交溶液接触，以允许标记的特异性探针退火。探针优选地用放射性同位素和荧光报道分子标记。FISH(荧光原位杂交)使用只结合显示高度序列相似性的序列部分的荧光探针。
FISH是一种细胞生成技术，用来检测和定位细胞中的特异性多核苷酸序列。例如，FISH可以用来检测染色体上的DNA序列。FISH也可以用来检测和定位组织样品内的特异性RNA，例如，mRNA。FISH使用结合显示高度序列相似性的特异性核苷酸序列的荧光探针。荧光显微镜检查可以用来发现荧光探针是否结合以及在何处结合。除了检测特异性核苷酸序列例如易位、融合、断裂、重复和其它染色体异常外，FISH可以帮助定义细胞和组织内的特异性基因拷贝数和/或基因表达的空间-时间模式。
比较基因组杂交(CGH)使用原位杂交动力学来比较来自样品的不同DNA或RNA序列的拷贝数，或将一个样品中的不同DNA或RNA的拷贝数与另一样品中基本相同的序列的拷贝数进行比较。在CGH的许多有用的应用中，从受试细胞或细胞群中分离DNA或RNA。比较可以是定性的或定量的。描述了允许确定细胞或细胞群整个基因组中的DNA序列绝对拷贝数的方法，如果对于一个或几个序列的绝对拷贝数已知或者是确定的。不同序列彼此的区别在于当与参照基因组杂交时它们的结合位点的不同位置，通常是中期染色体，但是在有时情况下是间期核。拷贝数信息来自于参照基因组上不同位置之间杂交信号强度的比较。CGH的方法、技术和应用是已知的，例如在美国专利6,335,167和美国申请No.60/804,818中描述，其中的有关部分通过引用并入本文。
其它序列分析方法
核酸变体也可以用标准电泳技术检测。尽管有时在检测步骤之前可以进行扩增步骤，但是在本文所述的实施方案中不需要扩增。使用电泳技术检测和定量核酸的方法的例子在本领域中可见。一个非限制性的例子包括在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中运行样品(例如，从母亲血清分离的混合的核酸样品，或例如扩增核酸物质)。凝胶可以用溴化乙锭标记(例如，染色)(参见，Sambrook和Russell，Molecular Cloning：ALaboratory Manual 3d ed.，2001)。存在与标准对照相同大小的条带表明存在目标核酸序列，然后可以基于条带的强度将其含量与对照进行比较，从而检测和定量目标序列。在一些实施方案中，能够区别母亲与父亲等位基因的限制酶可以用来检测和定量目标核酸物质。在某些实施方案中，目标序列特异性寡核苷酸探针用来检测目标序列的存在。寡核苷酸也可以用来基于探针导致的信号的强度，与标准对照相比，表明靶核酸分子的量。
序列特异性探针杂交可以用来检测含有其它核酸种类的混合物或混合群体中的特定核酸。在充分严格的杂交条件下，探针只与基本互补的序列特异性杂交。杂交条件的严格性可以放松，以耐受不同程度的序列匹配。许多杂交形式是本领域已知的，包括但不限于溶液相、固相或混合相杂交试验。下列文章提供了对各种杂交试验形式的概述：Singer等人，Biotechniques 4：230，1986；Haase等人，Methods inVirology，pp.189-226，1984；Wilkinson，In situ Hybridization，Wilkinson ed.，IRL Press，Oxford University Press，Oxford；和Hames和Higgins eds.，Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach，IRL Press，1987。
杂交复合物可以用本领域已知的技术检测。能够与靶核酸(例如，mRNA或DNA)特异性杂交的核酸探针可以通过任何合适的方法进行标记，标记的探针用来检测杂交的核酸的存在。一种常用的检测方法是放射自显影，它使用用3H、125I、35S、14C、32p、33p等标记的探针。放射性同位素的选择取决于选择的同位素的合成容易程度、稳定性和半衰期导致的研究选择。其它标志物包括化合物(例如，生物素和地高辛配基)，它结合抗配体或用荧光团、化学发光剂或酶标记的抗体。标志物的选择取决于需要的灵敏性、与探针偶联的容易程度、稳定性要求和可以利用的仪器。
此外，限制性片段长度多态性(RFLP)和AFLP方法可以用于分子谱分析。如果对应于一个或多个基因的靶DNA中的核苷酸变体导致限制酶识别位点的消除或产生，则用该特定限制酶消化靶DNA将产生改变的限制性片段长度图案。因此，检测的RFLP或AFLP将表明特定核苷酸变体的存在。
另外一种有用的方法是单链构象多态性试验(SSCA)，它基于跨越目标核苷酸变体的单链靶DNA的改变的迁移性。靶序列中的单核苷酸改变可导致不同的分子内碱基配对模式，因此导致单链DNA的不同的二级结构，它可以在非变性凝胶中检测。参见Orita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：2776-2770(1989)。基于变性凝胶的技术如夹变性凝胶电泳(CDGE)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测突变序列与野生型序列相比在变性凝胶中的迁移率的不同。参见Miller等人，Biotechniques，5：1016-24(1999)；Sheffield等人，Am.J.Hum，Genet.，49：699-706(1991)；Wartell等人，Nucleic Acids Res.，18：2699-2705(1990)；和Sheffield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：232-236(1989)。另外，双链构象分析(DSCA)也可以用于本发明。参见Arguello等人，Nat.Genet.，18：192-194(1998)。
个体的一个或多个基因中的特定基因座处存在或不存在核苷酸变体也可以用难以扩增的突变系统(ARMS)技术进行检测。参见例如，欧洲专利No.0,332,435；Newton等人，Nucleic Acids Res.，17：2503-2515(1989)；Fox等人，Br.J.Cancer，77：1267-1274(1998)；Robertson等人，Eur.Respir.J.，12：477-482(1998)。在ARMS方法中，合成引物，除了对应于该基因座处的核苷酸的3′-末端核苷酸是预先确定的核苷酸外，该引物匹配待测基因座直接5′上游的核苷酸序列。例如，3′-末端核苷酸可以与突变基因座处的核苷酸相同。引物可以是任何合适的长度，只要仅当其3′-末端核苷酸匹配待测基因座处的核苷酸时，它在严格条件下与靶DNA杂交。优选地，引物具有至少12个核苷酸，更优选大约18-50个核苷酸。如果待测个体在该基因座处具有突变，并且其中的核苷酸匹配引物的3′-末端核苷酸，则引物在与靶DNA模板杂交时可以进一步延伸，并且引物可以与另一合适的PCR引物一起启动PCR扩增反应。相反，如果该基因座处的核苷酸是野生型的，则引物延伸不能实现。可以使用过去几年发展的各种形式的ARMS技术。参见，例如，Gibson等人，Clin.Chem.43：1336-1341(1997)。
类似于ARMS技术的有微量测序或单核苷酸引物延伸方法，它基于单核苷酸的引入。匹配待测基因座直接5′的核苷酸序列的寡核苷酸引物在标记的双脱氧核糖核苷酸的存在下与靶DNA、mRNA或miRNA杂交。仅当双脱氧核糖核苷酸匹配待检变异基因座处的核苷酸时，标记的核苷酸被引入或连接到引物。因此，可以根据连接到掺入的双脱氧核糖核苷酸的检测标记揭示变异基因座处的核苷酸的身份。参见Syvanen等人，Genomics，8：684-692(1990)；Shumaker等人，Hum.Mutat.，7：346-354(1996)；Chen等人，Genome Res.，10：549-547(2000)。
可用于本发明的另一套技术是所谓的“寡核苷酸连接试验”(OLA)，其中野生型基因座和突变之间的区别基于两个寡核苷酸在靶DNA分子上彼此相邻地退火的能力，从而允许两个寡核苷酸通过DNA连接酶连接在一起。参见Landergren等人，Science，241：1077-1080(1988)；Chen等人，Genome Res.，8：549-556(1998)；Iannone等人，Cytometry，39：131-140(2000)。因此，例如，为了检测一个或多个基因中特定基因座处的单核苷酸突变，可以合成两个寡核苷酸，一个具有恰在基因座5′上游的序列，其3′末端核苷酸与特定基因的变异基因座的核苷酸相同，另一个具有匹配基因中该基因座直接3’下游的序列的核苷酸序列。寡核苷酸可以为了检测目的标记。在严格条件下与靶基因杂交时，两个寡核苷酸在合适的连接酶的存在下经历连接。两个寡核苷酸的连接将表明靶DNA在被检测的基因座处具有核苷酸突变。
小遗传变异的检测也可以通过多种基于杂交的方法实现。等位基因特异性寡核苷酸是最有用的。参见Conner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：278-282(1983)；Saiki等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：6230-6234(1989)。特异性杂交在特定基因座处具有特定基因变异的等位基因、但是不特异性杂交其它等位基因的寡核苷酸探针(等位基因特异性)可以通过本领域已知的方法设计。探针可以具有例如10个到大约50个核苷酸碱基的长度。靶DNA和寡核苷酸探针可以在足够严格的条件下彼此接触，使得核苷酸变体可以根据杂交的存在或不存在与野生型基因区分开来。可以标记探针以提供检测信号。此外，等位基因特异性寡核苷酸探针可以在“等位基因特异性PCR”中用作PCR扩增引物，预期长度的PCR产物的存在或不存在将指示特定核苷酸变体的存在或不存在。
其它有用的基于杂交的技术允许两个单链核酸一起退火，甚至在由于核苷酸取代、插入或缺失而存在错配时。然后可以使用各种技术检测错配。例如，退火的双链体可以进行电泳。错配的双链体可以根据它与完全匹配的双链体不同的电泳迁移率进行检测。参见Cariello，Human Genetics，42：726(1988)。此外，在RNase保护试验中，可以制备跨越待测的核苷酸变异位点并且具有检测标记的RNA探针。参见Giunta等人，Diagn.Mol.Path.，5：265-270(1996)；Finkelstein等人，Genomics，7：167-172(1990)；Kinszler等人，Science 251：1366-1370(1991)。RNA探针可以与靶DNA或mRNA杂交，形成异源双链体，该异源双链体然后进行核糖核酸酶RNase A消化。RNase A只在错配位点消化异源双链体中的RNA探针。该消化可以在变性电泳凝胶上根据大小变化来确定。另外，错配也可以通过本领域已知的化学切割方法来检测。参见，例如，Robefts等人，Nucleic Acids Res.，25：3377-3378(1997)。
在mutS试验中，可以制备探针，该探针匹配将检测存在或不存在突变的基因座周围的基因序列，除了在变异基因座处使用预先确定的核苷酸外。在探针与靶DNA退火形成双链体时，大肠杆菌mutS蛋白质与双链体接触。由于mutS蛋白质仅结合含有核苷酸错配的异源双链体序列，mutS蛋白质的结合将表示存在突变。参见Modrich等人，Ann.Rev.Genet.，25：229-253(1991)。
本领域中已经根据上述基本技术开发了多种改进和变化，它们可以用于在本发明中检测突变或核苷酸变体。例如，“日出探针”或“分子信标”使用荧光共振能量转移(FRET)性质并产生高灵敏度。参见Wolf等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：8790-8794(1988)。一般来说，跨越待测核苷酸基因座的探针被设计为发夹形结构，并且在一端用猝灭荧光团标记，在另一端用报道荧光团标记。在其天然状态，来自报道荧光团的荧光被猝灭荧光团猝灭，因为一个荧光团与另一个靠近。在探针与靶DNA杂交时，5′末端与3′-末端离开，因此荧光信号再生。参见Nazarenko等人，Nucleic Acids Res.，25：2516-2521(1997)；Rychlik等人，Nucleic Acids Res.，17：8543-8551(1989)；Sharkey等人，Bio/Technology12：506-509(1994)；Tyagi等人，Nat.Biotechnol.，14：303-308(1996)；Tyagi等人，Nat.Biotechnol.，16：49-53(1998)。同源尾辅助的非二聚体系统(HANDS)可以与分子信标法结合使用，以抑制引物-二聚体积累。参见Brownie等人，Nucleic Acids Res.，25：3235-3241(1997)。
染料标记的寡核苷酸连接试验是基于FRET的方法，它结合了OLA试验和PCR。参见Chen等人，Genome Res.8：549-556(1998)。TaqMan是另一种基于FRET的检测核苷酸变体的方法。TaqMan探针可以是设计为具有跨越感兴趣的变异基因座的基因核苷酸序列并且与不同等位基因差异杂交的寡核苷酸。探针的两端分别用猝灭荧光团和报道荧光团标记。TaqMan探针引入PCR反应中，该PCR反应用于使用Taq聚合酶扩增含有感兴趣的基因座的靶基因区。由于Taq聚合酶显示5′-3′核酸外切酶活性而没有3′-5′核酸外切酶活性，如果TaqMan探针与靶DNA模板退火，则在PCR反应过程中TaqMan探针的5′-末端将被Taq聚合酶降解，从而分离报道荧光团与猝灭荧光团，并释放荧光信号。参见Holland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7276-7280(1991)；Kalinina等人，Nucleic Acids Res.，25：1999-2004(1997)；Whitcombe等人，Clin.Chem.，44：918-923(1998)。
另外，本发明的检测也可以利用基于化学发光的技术。例如，寡核苷酸探针可以设计为与野生型或变异基因座杂交但不与两者同时杂交。探针用高度化学发光吖啶酯标记。吖啶酯的水解破坏了化学发光。探针与靶DNA的杂交防止了吖啶酯的水解。因此，通过检测化学发光的变化确定了靶DNA中特定突变的存在或不存在。参见Nelson等人，Nucleic Acids Res.，24：4998-5003(1996)。
本发明的基因中遗传变异的检测也可以基于“碱基切割序列扫描”(BESS)技术。BESS方法是一种基于PCR的突变扫描方法。产生BESS T-扫描和BESS G-追踪，它们类似于双脱氧测序的T和G梯级。通过比较正常和突变DNA的序列检测突变。参见，例如，Hawkins等人，Electrophoresis，20：1171-1176(1999)。
质谱法可以用于根据本发明的分子谱分析。参见Graber等人，Curr.Opin.Biotechnol.，9：14-18(1998)。例如，在引物寡核苷酸碱基延伸(PROBETM)方法中，靶核酸被固定在固相支持物上。引物与靶标在待分析的基因座的紧邻5′上游处退火。在选择的脱氧核糖核苷酸和双脱氧核糖核苷酸混合物的存在下进行引物延伸。然后通过MALDI-TOF分析得到的新延伸引物的混合物。参见，例如，Monforte等人，Nat.Med.，3：360-362(1997)。
另外，微芯片或微阵列技术也适用于本发明的检测方法。基本上，在微芯片中，大量不同的寡核苷酸探针被固定在诸如硅芯片或载玻片的基底或载体上的阵列中。待分析的靶核酸序列可以接触微芯片上固定的寡核苷酸探针。参见，Lipshutz等人，Biotechniques，19：442-447(1995)；Chee等人，Science，274：610-614(1996)；Kozal等人，Nat.Med.2：753-759(1996)；Hacia等人，Nat.Genet.，14：441-447(1996)；Saiki等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：6230-6234(1989)；Gingeras等人，GenomeRes.，8：435-448(1998)。或者，多个待研究的靶核酸序列被固定在基底上，探针阵列接触固定的靶序列。参见Drmanac等人，Nat.Biotechnol.，16：54-58(1998)。已经开发了大量微芯片技术，其中引入了一种或多种上述技术用于检测突变。微芯片技术与计算机化的分析工具组合允许大规模快速筛选。微芯片技术适用于本发明对于本发明所属领域的技术人员来说是显然的。参见，例如，Fodor等人的美国专利5,925,525；Wilgenbus等人，J.Mol.Med.，77：761-786(1999)；Graber等人，Curr.Opin.Biotechnol.，9：14-18(1998)；Hacia等人，Nat.Genet.，14：441-447(1996)；Shoemaker等人，Nat.Genet.，14：450-456(1996)；DeRisi等人，Nat.Genet.，14：457-460(1996)；Chee等人，Nat.Genet.，14：610-614(1996)；Lockhart等人，Nat.Genet.，14：675-680(1996)；Drobyshev等人，Gene，188：45-52(1997)。
由以上对合适的检测技术的描述可以明白，根据使用的检测技术，可能必须或者可能不必扩增靶DNA，即基因、cDNA、mRNA、miRNA或其部分，以提高靶DNA分子的数目。例如，大多数基于PCR的技术结合了一部分靶标的扩增和突变的检测。PCR扩增是本领域公知的，在美国专利4,683,195和4,800,159(通过引用并入本文)中公开。对于非基于PCR的检测技术，必要时，扩增可以通过例如体内质粒扩增或通过从大量组织或细胞样品纯化靶DNA来实现。概括地参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989。但是，甚至对于极少的样品，也已经开发了许多灵敏的技术，其中可以检测小遗传变异如单核苷酸取代，而无需扩增样品中的靶DNA。例如，已经开发了扩增与靶DNA相反的信号的技术，例如，通过使用能够杂交靶DNA的分支DNA或树状聚合物。分支的或树状聚合DNA提供多个供杂交探针连接的杂交位点，从而扩增检测信号。参见Detmer等人，J.Clin.Microbiol.，34：901-907(1996)；Collins等人，Nucleic Acids Res.，25：2979-2984(1997)；Horn等人，Nucleic Acids Res.，25：4835-4841(1997)；Horn等人，Nucleic Acids Res.，25：4842-4849(1997)；Nilsen等人，J.Theor.Biol.，187：273-284(1997)。
InvaderTM试验是另一种检测单核苷酸变异的技术，可用于本发明的分子谱分析。InvaderTM试验使用新型线性信号扩增技术，它改进了典型的PCR DNA测序基分析所需的长运行时间。参见Cooksey等人，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 44：1296-1301(2000)。该试验基于在两个重叠寡核苷酸之间形成的独特二级结构的切割，该重叠寡核苷酸与感兴趣的靶序列杂交形成“瓣”。每个“瓣”然后每小时产生上千个信号。因此，该技术的结果可以容易地读取，并且该方法不需要指数扩增DNA靶标。InvaderTM系统使用两个短DNA探针，它们与DNA靶标杂交。杂交事件形成的结构被特殊的切割酶识别，该酶切割一个探针，释放短DNA“瓣”。每个释放的“瓣”然后结合荧光标记的探针，形成另一切割结构。当切割酶切割标记的探针时，该探针发出可检测的荧光信号。参见例如Lyamichev等人，Nat.Biotechnol.，17：292-296(1999)。
滚环法是避免指数扩增的另一方法。Lizardi等人，Nature Genetics，19：225-232(1998)(通过引用并入本文)。例如，SniperTM，该方法的一个商业实施方案，是灵敏的高通量SNP评分系统，设计用于特定变体的精确的荧光检测。对于每个核苷酸变体，设计两个等位基因特异性线性探针。除了3′-碱基变化以互补于变异位点以外，两个等位基因特异性探针相同。在该试验的第一阶段，使靶DNA变性，然后与一对单一的、等位基因特异性开环寡核苷酸探针杂交。当3′-碱基完全互补于靶DNA时，将优先发生探针的连接。后续的环化寡核苷酸探针的检测是通过滚环扩增，此时扩增的探针产物通过荧光进行检测。参见Clark和Pickering，Life Science News 6，2000，Amersham Pharmacia Biotech(2000)。
大量其它避免扩增的技术包括，例如，表面增强的共振拉曼散射(SERRS)、荧光相关光谱法和单分子电泳。在SERRS中，生色团-核酸偶联物被吸附到胶体银上，并且用生色团共振频率的激光照射。参见Graham等人，Anal.Chem.，69：4703-4707(1997)。荧光相关光谱法基于电场中波动光信号和捕获单分子之间的空间-时间相关。参见Eigen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：5740-5747(1994)。在单分子电泳中，荧光标记的核酸的电泳速度通过测量分子通过两个激光束之间的预定距离所需的时间来确定。参见Castro等人，Anal.Chem.，67：3181-3186(1995)。
另外，等位基因特异性寡核苷酸(ASO)也可用于使用组织或细胞作为样品的原位杂交。可以与野生型基因序列或携带突变的基因序列差异杂交的寡核苷酸探针可以用放射性同位素、荧光或其它可检测标记物标记。原位杂交技术是本领域公知的，并且它们为了检测特定个体的一个或多个基因中核苷酸突变的存在或不存在而对本发明的改变应当是本领域技术人员通过本公开内容而能够明白的。
基于蛋白质的检测技术也可用于分子谱分析，特别是在核苷酸变体导致影响蛋白质一级、二级或三级结构的氨基酸置换或缺失或插入或移码时。为了检测氨基酸变异，可以采用蛋白质测序技术。例如，可以使用从待测个体分离的DNA片段，通过重组表达合成对应于一个基因的蛋白质或其片段。优选地，使用包含待测多态性基因座的不超过100-150个碱基对的cDNA片段。肽的氨基酸序列然后可以通过常规蛋白质测序方法确定。或者，HPLC-显微镜检查串联质谱技术可以用于确定氨基酸序列变异。在该技术中，对蛋白质进行蛋白水解消化，得到的肽混合物通过反相色谱法分离。然后进行串联质谱法，分析从中采集的数据。参见Gatlin等人，Anal.Chem.，72：757-763(2000)。
其它基于蛋白质的检测分子谱分析技术包括基于对本发明的突变基因编码的蛋白质具有选择性免疫反应性的抗体的免疫亲和试验。生产这些抗体的方法是本领域已知的。抗体可以用来从溶液样品中免疫沉淀特定蛋白质或者免疫印迹通过例如聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质。免疫细胞化学方法也可以用于检测组织或细胞中的特定蛋白质多态性。也可以使用其它公知的基于抗体的技术，包括，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射分析(IRMA)和免疫酶测定(IEMA)，包括使用单克隆抗体或多克隆抗体的夹心法测定。参见，例如，美国专利4,376,110和4,486,530，均通过引用并入本文。
因此，可以使用上述任何检测方法确定个体中存在或不存在一个或多个基因核苷酸变体或氨基酸变体。
一般来说，一旦确定了一个或多个基因核苷酸变体或氨基酸变体的存在或不存在，可以将结果通知给医生或遗传顾问或患者或其它研究人员。特别是，结果可以形成为可传送形式，该形式可以通信或传送给其他研究者或医生或遗传学顾问或患者。这种形式可能变化，并且可能是有形的或无形的。关于在检测个体中存在或不存在本发明的核苷酸突变的结果可以体现在描述性声明、图形、照片、图表、图像或任何其它可视形式。例如，PCR产物的凝胶电泳图像可以用于解释结果。显示在个体基因中何处发生变异的图形也可用于说明检测结果。声明和可视形式可以记录在有形介质如纸、计算机可读介质如软磁盘、光盘等或无形介质如电子邮件或互联网或内联网网址形式的电子介质上。另外，关于在检测个体中存在或不存在核苷酸变异或氨基酸变异的结果也可以以声音形式记录，并且通过任何合适的介质传送，例如，通过模拟或数字电缆、光纤维缆等，通过电话、传真、无线移动电话、互联网电话等。
因此，可以在世界上任何地方产生检测结果的信息和数据，并传送到不同的地点。例如，当在海外进行基因分型试验时，可以产生关于检测结果的信息和数据，并且形成如上所述的可传送形式。可传送形式的检测结果因此可以输入到美国。因此，本发明也包括产生关于来自个体的两个或多个疑似癌样品的基因型的可传送形式的信息的方法。该方法包括以下步骤：(1)根据本发明的方法确定来自样品的DNA的基因型；和(2)将该确定步骤的结果体现为可传送形式。可传送形式是生产方法的产物。
数据和分析
本发明的实施也可以使用常规生物学方法、软件和系统。本发明的计算机软件产品一般包括计算机可读介质，其中具有计算机可执行的指令，用于执行本发明方法的逻辑步骤。合适的计算机可读介质包括软盘、CD-ROM/DVD/DVD-ROM、硬盘驱动器、闪速存储器、ROM/RAM、磁带等。计算机可执行的指令可以以合适的计算机语言或几种语言的组合书写。基本计算生物学方法描述在例如Setubal和Meidanis等人，Introduction to Computational Biology Methods(PWSPublishing Company，Boston，1997)；Salzberg，Searles，Kasif，(Ed.)，Computational Methods in Molecular Biology，(Elsevier，Amsterdam，1998)；Rashidi和Buehler，Bioinformatics Basics：Application in Biological Scienceand Medicine(CRC Press，London，2000)以及Ouelette and BzevanisBioinformatics：A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins(Wiley&Sons，Inc.，2.sup.nd ed.，2001)。参见美国专利6,420,108。
本发明也可以利用各种计算机程序产品和用于多种目的的软件，例如探针设计、数据管理、分析和仪器操作。参见，美国专利5,593,839、5,795,716、5,733,729、5,974,164、6,066,454、6,090,555、6,185,561、6,188,783、6,223,127、6,229,911和6,308,170。
另外，本发明涉及包括在网络如因特网上提供遗传信息的方法的实施方案，如U.S.Ser.Nos.10/197,621、10/063,559(美国公布号20020183936)、10/065,856、10/065,868、10/328,818、10/328,872、10/423,403和60/482,389所示。例如，一种或多种分子谱分析技术可以在一个地点(例如，城市、州、国家或大陆)进行，并且结果可以传送到不同的城市、州、国家或大陆。然后可以在第二地点整体或部分进行治疗选择。本发明的方法包括不同地点之间的信息传送。
用于治疗选择的分子谱分析
本发明的方法为需要的受试者提供候选治疗选择。分子谱分析可以用来为患有疾病的个体确定一种或多种候选治疗剂，其中本文公开的生物标志物的一个或多个是治疗靶标。例如，该方法可以确定一种或多种用于癌症的化学治疗。在一方面，本发明提供一种方法，包括：对来自该受试者的样品进行免疫组化(IHC)分析以确定至少五种蛋白质的IHC表达谱；对该样品进行微阵列分析以确定至少十种基因的微阵列表达谱；对该样品进行荧光原位杂交(FISH)分析以确定至少一种基因的FISH突变谱；对该样品进行DNA测序以确定至少一种基因的测序突变谱；和相对于规则数据库比较IHC表达谱、微阵列表达谱、FISH突变谱和测序突变谱，其中该规则数据库包括其对病变细胞的生物活性已知的治疗的图谱，该细胞：i)过表达或欠表达IHC表达谱中包括的一个或多个蛋白质；ii)过表达或欠表达微阵列表达谱中包括的一个或多个基因；iii)在FISH突变谱中包括的一个或多个基因中没有突变或具有多个突变；和/或iv)在测序突变谱中包括的一个或多个基因中没有突变或具有多个突变；和如果相对于规则数据库的比较表明该治疗应当对病变细胞具有生物活性，和相对于规则数据库的比较没有表明该治疗不能用于治疗病变细胞，则确定该治疗。该疾病可以是癌症。分子谱分析步骤可以按照任何顺序进行。在一些实施方案中，不是所有分子谱分析步骤都进行。作为一个非限制性的例子，如果样品质量不满足如本文所述的阈值，则不进行微阵列分析。在另一实例中，只在FISH分析满足阈值时进行测序。任何相关生物标志物可以使用此处所述的或本领域已知的分子谱分析技术中的一个或多个进行评估。标志物只需要与有用的治疗具有一定的直接或间接相关。
分子谱分析包括用于进行的每种测试技术的至少一个基因(或基因产物)的谱分析。不同数目的基因可以用不同的技术测定。此处公开的与靶治疗剂直接或间接相关的任何标志物可以根据基因例如DNA序列和/或基因产物例如mRNA或蛋白质进行评估。这种核酸和/或多肽可以对存在或不存在、水平或量、突变、序列、单体型、重排、拷贝数等进行适用的谱分析。在一些实施方案中，单基因和/或一个或多个相应的基因产物通过一种以上的分子谱分析技术进行测定。基因或基因产物(在本文中也称为“标志物”或“生物标志物”)，例如，mRNA或蛋白质，利用适用的技术进行评估(例如，评价DNA、RNA、蛋白质)，包括但不限于FISH、微阵列、IHC、测序或免疫测定。因此，此处公开的任何标志物可以通过一种分子谱分析技术或通过多种此处公开的方法进行测定(例如，一种标志物通过IHC、FISH、测序、微阵列等中的一个或多个进行谱分析)。在一些实施方案中，至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少大约100种基因或基因产物通过FISH、微阵列、IHC和测序中的至少一种技术、多种技术或每一种进行谱分析。在一些实施方案中，至少大约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000、30,000、31,000、32,000、33,000、34,000、35,000、36,000、37,000、38,000、39,000、40,000、41,000、42,000、43,000、44,000、45,000、46,000、47,000、48,000、49,000或至少大约50,000种基因或基因产物通过每种技术进行谱分析。测定的标志物的数目取决于使用的技术。例如，微阵列和大规模平行测序适合于高通量分析。
在一些实施方案中，来自需要的受试者的样品使用包括但不限于以下这些的方法进行谱分析：IHC表达谱分析、微阵列表达谱分析、FISH突变谱分析，和/或测序突变谱分析(如PCR、RT-PCR、焦磷酸测序)，该分析是针对以下的一个或多个：ABCC1、ABCG2、ACE2、ADA、ADH1C、ADH4、AGT、雄激素受体、AR、AREG、ASNS、BCL2、BCRP、BDCA1、BIRC5、B-RAF、BRCA1、BRCA2、CA2、小窝蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDK2、CDW52、CES2、CK 14、CK 17、CK 5/6、c-KIT、c-Myc、COX-2、细胞周期蛋白D1、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、E-钙粘着蛋白、ECGF1、EGFR、EPHA2、表皮调节素、ER、ERBR2、ERCC1、ERCC3、EREG、ESR1、FLT1、叶酸受体、FOLR1、FOLR2、FSHB、FSHPRH1、FSHR、FYN、GART、GNRH1、GNRHR1、GSTP1、HCK、HDAC1、Her2/Neu、HGF、HIF1A、HIG1、HSP90、HSP90AA1、HSPCA、IL13RA1、IL2RA、KDR、KIT、K-RAS、LCK、LTB、淋巴毒素Beta受体、LYN、MGMT、MLH1、MRP1、MS4A1、MSH2、Myc、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、ODC1、OGFR、p53、p95、PARP-1、PDGFC、PDGFR、PDGFRA、PDGFRB、PGP、PGR、PI3K、POLA、POLA1、PPARG、PPARGC1、PR、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SPARC MC、SPARC PC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活蛋白、TK1、TLE3、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TOPO1、TOPO2B、拓扑异构酶II、TS、TXN、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VEGFA、VEGFC、VHL、YES1、ZAP70。
在一些实施方案中，进行额外的分子谱分析方法。这可包括但不限于PCR、RT-PCR、Q-PCR、SAGE、MPSS、免疫测定和其它技术，以评估本文所述的或本领域技术人员已知的生物系统。待测定的基因和基因产物的选择可以随时间更新为新的治疗，并确定新的药物靶标。一旦生物标志物的表达或突变与治疗选项相关，则它可以通过分子谱分析评估。技术人员明白这些分子谱分析不限于本文公开的技术，而包括任何用于评估核酸或蛋白质水平、序列信息或两者的常规方法。本发明的方法也可以利用当前方法的任何改良或未来开发的新的分子谱分析技术。在一些实施方案中，通过单一分子谱分析技术评估基因或基因产物。在其它实施方案中，通过多种分子谱分析技术评估基因和/或基因产物。在非限制性实例中，可以通过FISH和焦磷酸测序分析中的一种或多种测定基因序列，可以通过RT-PCR和微阵列中的一种或多种测定mRNA基因产物，并且可以通过IHC和免疫测定中的一种或多种测定蛋白质基因产物。技术人员明白本发明涉及生物标志物和有益于疾病治疗的分子谱分析技术的任何组合。
已知在癌症中起作用并且可以通过本发明的任何分子谱分析技术测定的基因和基因产物包括但不限于2AR、A DISINTEGRIN、ACTIVATOR OF THYROID和RETINOIC ACID受体(ACTR)、ADAM11、ADIPOGENESIS抑制剂Y FACTOR(ADIF)、ALPHA 6INTEGRINSUBUNIT、ALPHA V INTEGRIN SUBUNIT、ALPHA-CATENIN、扩增的IN乳腺癌1(AIB1)、扩增的IN乳腺癌3(AIB3)、扩增的IN乳腺癌4(AIB4)、AMYLOID PRECURSOR蛋白质SECRETASE(APPS)、AP-2 GAMMA、APPS、ATP-BINDING CASSETTE TRANSPORTER(ABCT)、PLACENTA-SPECIFIC(ABCP)、ATP-BINDING CASSETTESUBFAMILY C MEMBER(ABCC1)、BAG-1、BASIGIN(BSG)、BCEI、B-CELL DIFFERENTIATION FACTOR(BCDF)、B-CELLLEUKEMIA 2(BCL-2)、B-CELL STIMULATORY FACTOR-2(BSF-2)、BCL-1、BCL-2-ASSOCIATED X蛋白质(BAX)、BCRP、BETA 1INTEGRIN SUBUNIT、BETA 3 INTEGRIN SUBUNIT、BETA 5INTEGRIN SUBUNIT、BETA-2 INTERFERON、BETA-CATENIN、BETA-CATENIN、BONE SIALO蛋白质(BSP)、乳腺癌ESTROGEN-INDUCIBLE SEQUENCE(BCEI)、乳腺癌RESISTANCE蛋白质(BCRP)、乳腺癌TYPE 1(BRCA1)、乳腺癌TYPE 2(BRCA2)、BREAST CARCINOMA扩增的SEQUENCE 2(BCAS2)、钙粘着蛋白、EPITHELIAL钙粘着蛋白-11、钙粘着蛋白-ASSOCIATED蛋白质、CALCITONIN受体(CTR)、CALCIUM PLACENTAL蛋白质(CAPL)、CALCYCLIN、CALLA、CAM5、CAPL、CARCINOEMBRYONICANTIGEN(CEA)、CATENIN、ALPHA 1、CATHEP SIN B、CATHEPSIN D、CATHEPSIN K、CATHEPSIN L2、CATHEPSIN O、CATHEPSIN O1、CATHEPSIN V、CD10、CD146、CD147、CD24、CD29、CD44、CD51、CD54、CD61、CD66e、CD82、CD87、CD9、CEA、CELLULAR RETINOL-BINDING蛋白质1(CRBP1)、c-ERBB-2、CK7、CK8、CK18、CK19、CK20、CLAUDIN-7、c-MET、COLLAGENASE、FIBROBLAST、COLLAGENASE、INTERSTITIAL、COLLAGENASE-3、COMMON ACUTELYMPHOCYTIC LEUKEMIA ANTIGEN(CALLA)、CONNEXIN 26(Cx26)、CONNEXIN 43(Cx43)、CORTACTIN、COX-2、CTLA-8、CTR、CTSD、细胞周期蛋白D1、CYCLOOXYGENASE-2、CYTOKERATIN 18、CYTOKERATIN 19、CYTOKERATIN 8、CYTOTOXIC T-LYMPHOCYTE-ASSOCIATED SERINE ESTERASE 8(CTLA-8)、DIFFERENTIATION-INHIBITING ACTIVITY(DIA)、DNA扩增的IN MAMMARY CARCINOMA 1(DAM1)、DNA拓扑异构酶IIALPHA、DR-NM23、E-钙粘着蛋白、EMMPRIN、EMS1、ENDOTHELLAL CELL GROWTH EACTOR(ECGR)、PLATELET-DERIVED(PD-ECGF)、ENKEPHALINASE、EPIDERMAL GROWTHFACTOR受体(EGFR)、EPISIALIN、EPITHELIAL MEMBRANEANTIGEN(EMA)、ER-ALPHA、ERBB2、ERBB4、ER-BETA、ERF-1、ERYTHROID-POTENTIATING ACTIVITY(EPA)、ESR1、ESTROGEN受体-ALPHA、ESTROGEN受体-BETA、ETS-1、EXTRACELLULAR MATRIX METALLO蛋白质ASE INDUCER(EMMPRIN)、FIBRONECTIN受体、BETA多肽(FNRB)、FIBRONECTIN受体BETA SUBUNIT(FNRB)、FLK-1、GA15.3、GA733.2、GALECTIN-3、GAMMA-CATENIN、GAP JUNCTION蛋白质(26kDa)、GAP JUNCTION蛋白质(43kDa)、GAP JUNCTION蛋白质ALPHA-1(GJA1)、GAP JUNCTION蛋白质BETA-2(GJB2)、GCP1、明胶酶A、明胶酶B、明胶酶(72kDa)、明胶酶(92kDa)、GLIOSTATIN、糖皮质激素受体相互作用蛋白质1(GRIP1)、谷胱甘肽S-转移酶p、GM-CSF、GRANULOCYTE CHEMOTACTIC蛋白质1(GCP1)、GRANULOCYTE-MACROPHAGE-COLONY STIMULATINGFACTOR、GROWTH FACTOR受体BOUND-7(GRB-7)、GSTp、HAP、HEAT-SHOCK COGNATE蛋白质70(HSC70)、耐热抗原、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞生长因子受体(HGFR)、肝细胞刺激因子III(HSF III)、HER-2、HER2/NEU、HERMES ANTIGEN、HET、HHM、HUMORAL HYPERCALCEMIA OF MALIGNANCY(HHM)、ICERE-1、INT-1、INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE-1(ICAM-1)、INTERFERON-GAMMA-INDUCING FACTOR(IGIF)、INTERLEUKIN-1 ALPHA(IL-1A)、INTERLEUKIN-1 BETA(IL-1B)、INTERLEUKIN-11(IL-11)、INTERLEUKIN-17(IL-17)、INTERLEUKIN-18(IL-18)、INTERLEUKIN-6(IL-6)、INTERLEUKIN-8(IL-8)、INVERSELYCORRELATED WITH ESTROGEN受体表达-1(ICERE-1)、KAI1、KDR、KERATIN 8、KERATIN 18、KERATIN 19、KISS-1、LEUKEMIA抑制剂Y FACTOR(LIF)、LIF、LOST ININFLAMMATORY乳腺癌(LIBC)、LOT(″LOST ONTRANSFORMATION″)、LYMPHOCYTE HOMING受体、MACROPHAGE-COLONY STIMULATING FACTOR、MAGE-3、MAMMAGLOBIN、MASPIN、MC56、M-CSF、MDC、MDNCF、MDR、MELANOMA CELL ADHESION MOLECULE(MCAM)、MEMBRANE METALLOENDOPEPTIDASE(MME)、MEMBRANE-ASSOCIATED NEUTRAL ENDOPEPTIDASE(NEP)、CYSTEINE-RICH蛋白质(MDC)、METASTASIN(MTS-1)、MLN64、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP11、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MOESIN、MONOCYTE ARGININE-SERPIN、MONOCYTE-DERIVED NEUTROPHIL CHEMOTACTIC FACTOR、MONOCYTE-DERIVED PLASMINOGEN ACTIVATOR抑制剂、MTS-1、MUC-1、MUC18、MUCIN LIKE癌症ASSOCIATED ANTIGEN(MCA)、MUCIN、MUC-1、MULTIDRUG RESISTANCE蛋白质1(MDR、MDR1)、MULTIDRUG RESISTANCE RELATED蛋白质-1(MRP、MRP-1)、N-钙粘着蛋白、NEP、NEU、NEUTRALENDOPEPTIDASE、NEUTROPHIL-ACTIVATING PEPTIDE 1(NAP1)、NM23-H1、NM23-H2、NME1、NME2、NUCLEAR受体COACTIVATOR-1(NCoA-1)、NUCLEAR受体COACTIVATOR-2(NCoA-2)、NUCLEAR受体COACTIVATOR-3(NCoA-3)、NUCLEOSIDE DIPHOSPHATE KINASE A(NDPKA)、NUCLEOSIDEDIPHOSPHATE KINASE B(NDPKB)、ONCOSTATIN M(OSM)、ORNITHINE DECARBOXYLASE(ODC)、OSTEOCLASTDIFFERENTIATION FACTOR(ODF)、OSTEOCLASTDIFFERENTIATION FACTOR受体(ODFR)、OSTEONECTIN(OSN、ON)、OSTEOPONTIN(OPN)、OXYTOCIN受体(OXTR)、p27/kip1、p300/CBP COINTEGRATOR ASSOCIATE蛋白质(p/CIP)、p53、p9Ka、PAI-1、PAI-2、PARATHYROID ADENOMATOSIS 1(PRAD1)、PARATHYROID HORMONE-LIKE HORMONE(PTHLH)、PARATHYROID HORMONE-RELATED PEPTIDE(PTHrP)、P-钙粘着蛋白、PD-ECGF、PDGF、PEANUT-REACTIVE URINARY MUCIN(PUM)、P-糖蛋白(P-GP)、PGP-1、PHGS-2、PHS-2、PIP、PLAKOGLOBIN、PLASMINOGEN ACTIVATOR抑制剂(TYPE 1)、PLASMINOGEN ACTIVATOR抑制剂(TYPE 2)、PLASMINOGENACTIVATOR(TISSUE-TYPE)、PLASMINOGEN ACTIVATOR(UROKINASE-TYPE)、PLATELET糖蛋白IIIa(GP3A)、PLAU、PLEOMORPHIC ADENOMA GENE-LIKE 1(PLAGL1)、POLYMORPHIC EPITHELIALMUCIN(PEM)、PRAD1、PROGESTERONE受体(PgR)、PROGESTERONE RESISTANCE、PROSTAGLANDIN ENDOPEROXIDE SYNTHASE-2、PROSTAGLANDIN G/H SYNTHASE-2、PROSTAGLANDIN HSYNTHASE-2、pS2、PS6K、PSORIASIN、PTHLH、PTHrP、RAD51、RAD52、RAD54、RAP46，受体-ASSOCIATEDCOACTIVATOR 3(RAC3)、REPRESSOR OF ESTROGEN受体ACTIVITY(REA)、S100A4、S100A6、S100A7、S6K、SART-1、SCAFFOLD ATTACHMENT FACTOR B(SAF-B)、SCATTER FACTOR(SF)、SECRETED PHOSPHO蛋白质-1(SPP-1)、SECRETED蛋白质、ACIDIC和RICH IN CYSTEINE(SPARC)、STANNICALCIN、STEROID受体COACTIVATOR-1(SRC-1)、STEROID受体COACTIVATOR-2(SRC-2)、STEROID受体COACTIVATOR-3(SRC-3)、STEROID受体RNA ACTIVATOR(SRA)、STROMELYSIN-1、STROMELYSIN-3、TENASCIN-C(TN-C)、TESTES-SPECIFICPROTEASE 50、THROMBOSPONDIN I、THROMBOSPONDIN II、THYMIDINE PHOSPHORYLASE(TP)、THYROID HORMONE受体ACTIVATOR MOLECULE 1(TRAM-1)、TIGHT JUNCTION蛋白质1(TJP1)、TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4，组织-TYPE PLASMINOGENACTIVATOR、TN-C、TP53、tPA、TRANSCRIPTIONALINTERMEDIARY FACTOR 2(TIF2)、TREFOIL FACTOR 1(TFF1)、TSG101、TSP-1、TSP1、TSP-2、TSP2、TSP50、TUMOR CELLCOLLAGENASE STIMULATING FACTOR(TCSF)、TUMOR-ASSOCIATED EPITHELIAL MUCIN、uPA、uPAR、UROKINASE、UROKINASE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR、UROKINASE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR受体(uPAR)、UVOMORULIN、VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR、VASCULARENDOTHELIAL GROWTH FACTOR受体-2(VEGFR2)、VASCULARENDOTHELIAL GROWTH FACTOR-A、VASCULAR PERMEABILITYFACTOR、VEGFR2、VERY LATE T-CELL ANTIGEN BETA(VLA-BETA)、VIMENTIN、VITRONECTIN受体ALPHA多肽(VNRA)、VITRONECTIN受体、VON WILLEBRAND FACTOR、VPF、VWF、WNT-1、ZAC、ZO-1，和ZONULA OCCLUDENS-1。
用于IHC表达谱分析的基因产物包括但不限于SPARC、PGP、Her2/heu、ER、PR、c-kit、AR、CD52、PDGFR、TOP2A、TS、ERCC1、RRM1、BCRP、TOPO1、PTEN、MGMT和MRP1中的一种或多种。也可以进行EGFR的IHC谱分析。IHC也用来检测或测试各种基因产物，包括但不限于以下一种或多种：EGFR、SPARC、C-kit、ER、PR、雄激素受体、PGP、RRM1、TOPO1、BRCP1、MRP1、MGMT、PDGFR、DCK、ERCC1、胸苷酸合酶、Her2/neu或TOPO2A。在一些实施方案中，IHC用来检测以下蛋白质中的一种或多种，包括但不限于：ADA、AR、ASNA、BCL2、BRCA2、CD33、CDW52、CES2、DNMT1、EGFR、ERBB2、ERCC3、ESR1、FOLR2、GART、GSTP1、HDAC1、HIF1A、HSPCA、IL2RA、KIT、MLH1、MS4A1、MASH2、NFKB2、NFKBIA、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RXRB、SPARC、SSTR1、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VHL或ZAP70。
微阵列表达谱分析可以用来同时测定一个或多个基因或基因产物的表达，包括但不限于ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGF1、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCC1、ERCC3、ESR1、FLT1、FOLR2、FYN、GART、GNRH1、GSTP1、HCK、HDAC1、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、MGMT、MLH1、MS4A1、MSH2、NFKB1、NFKB2、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA1、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1和ZAP70。在一些实施方案中，用于微阵列表达谱分析的基因包括以下一种或多种：EGFR、SPARC、C-kit、ER、PR、雄激素受体、PGP、RRM1、TOPO1、BRCP1、MRP1、MGMT、PDGFR、DCK、ERCC1、胸苷酸合酶、Her2/neu、TOPO2A、ADA、AR、ASNA、BCL2、BRCA2、CD33、CDW52、CES2、DNMT1、EGFR、ERBB2、ERCC3、ESR1、FOLR2、GART、GSTP1、HDAC1、HIF1A、HSPCA、IL2RA、KIT、MLH1、MS4A1、MASH2、NFKB2、NFKBIA、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RXRB、SPARC、SSTR1、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VHL或ZAP70。可以使用低密度微阵列、表达微阵列、比较基因组杂交(CGH)微阵列、单核苷酸多态性(SNP)微阵列、蛋白质组阵列、抗体阵列或本文所述的或本领域技术人员已知的其它阵列进行微阵列表达谱分析。在一些实施方案中，使用高通量表达阵列。这样的系统包括但不限于可以从Agilent或Illumina购到的系统，如本文更详细所述。
FISH突变谱分析可以用来对EGFR和HER2中的一种或多种进行谱分析。在一些实施方案中，FISH用来检测或测试以下基因中的一种或多种，包括但不限于：EGFR、SPARC、C-kit、ER、PR、雄激素受体、PGP、RRM1、TOPO1、BRCP1、MRP1、MGMT、PDGFR、DCK、ERCC1、胸苷酸合酶、HER2或TOPO2A。在一些实施方案中，FISH用来检测或测试各种生物标志物，包括但不限于以下一种或多种：ADA、AR、ASNA、BCL2、BRCA2、CD33、CDW52、CES2、DNMT1、EGFR、ERBB2、ERCC3、ESR1、FOLR2、GART、GSTP1、HDAC1、HIF1A、HSPCA、IL2RA、KIT、MLH1、MS4A1、MASH2、NFKB2、NFKBIA、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RXRB、SPARC、SSTR1、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VHL或ZAP70。
在一些实施方案中，用于测序突变谱分析的基因包括KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR中的一种或多种。测序分析也可以包括评估以下一种或多种中的突变：ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGF1、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCC1、ERCC3、ESR1、FLT1、FOLR2、FYN、GART、GNRH1、GSTP1、HCK、HDAC1、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、MGMT、MLH1、MS4A1、MSH2、NFKB1、NFKB2、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA1、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1和ZAP70。
在相关方面，本发明提供一种通过使用几组已知生物标志物的分子谱分析为需要的受试者确定候选治疗的方法。例如，该方法可以为癌症患者确定化疗剂。该方法包括：从该受试者获得样品；对该样品进行免疫组化(IHC)分析以确定以下至少五种的IHC表达谱：SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c-kit、AR、CD52、PDGFR、TOP2A、TS、ERCC1、RRM1、BCRP、TOPO1、PTEN、MGMT和MRP1；对该样品进行微阵列分析以确定以下至少五种的微阵列表达谱：ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGF1、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCC1、ERCC3、ESR1、FLT1、FOLR2、FYN、GART、GNRH1、GSTP1、HCK、HDAC1、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、MGMT、MLH1、MS4A1、MSH2、NFKB1、NFKB2、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA1、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1和ZAP70；对该样品进行荧光原位杂交(FISH)分析以确定EGFR和HER2中的至少一种的FISH突变谱；对该样品进行DNA测序以确定KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR中的至少一种的测序突变谱；和相对于规则数据库比较IHC表达谱、微阵列表达谱、FISH突变谱和测序突变谱，其中所述规则数据库包括其对病变细胞的生物活性已知的治疗的图谱，该细胞：i)过表达或欠表达IHC表达谱中包括的一个或多个蛋白质；ii)过表达或欠表达微阵列表达谱中包括的一个或多个基因；iii)在FISH突变谱中包括的一个或多个基因中没有突变或具有多个突变；和/或iv)在测序突变谱中包括的一个或多个基因中没有突变或具有多个突变；和如果相对于规则数据库的比较表明该治疗应当对病变细胞具有生物活性，和相对于规则数据库的比较没有表明该治疗不能用于治疗病变细胞，则确定该治疗。该疾病可以是癌症。分子谱分析步骤可以按照任何顺序进行。在一些实施方案中，不是所有分子谱分析步骤都进行。作为一个非限制性的例子，如果样品质量不满足如本文所述的阈值，则不进行微阵列分析。在一些实施方案中，对上述基因产物的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或95％进行IHC表达谱分析。在一些实施方案中，对以上所列基因的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％进行微阵列表达谱分析。
在一个相关方面，本发明提供一种通过利用对定义的几组已知生物标志物的分子谱分析为需要的受试者确定候选治疗的方法。例如，该方法可以为癌症个体确定化疗剂。该方法包括：从该受试者获得样品，其中该样品包含福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织或新鲜冷冻的组织，并且其中该样品包含癌细胞；对该样品进行免疫组化(IHC)分析以确定至少以下的IHC表达谱：SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c-kit、AR、CD52、PDGFR、TOP2A、TS、ERCC1、RRM1、BCRP、TOPO1、PTEN、MGMT和MRP1；对样品进行微阵列分析以确定至少以下的微阵列表达谱：ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGF1、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCC1、ERCC3、ESR1、FLT1、FOLR2、FYN、GART、GNRH1、GSTP1、HCK、HDAC1、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、MGMT、MLH1、MS4A1、MSH2、NFKB1、NFKB2、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLA1、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TK1、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1和ZAP70；对样品进行荧光原位杂交(FISH)分析以确定至少EGFR和HER2的FISH突变谱；对样品进行DNA测序以确定至少KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR的测序突变谱。IHC表达谱、微阵列表达谱、FISH突变谱和测序突变谱相对于规则数据库进行比较，其中规则数据库包括其对病变细胞的生物活性已知的治疗的图谱，该细胞：i)过表达或欠表达IHC表达谱中包括的一个或多个蛋白质；ii)过表达或欠表达微阵列表达谱中包括的一个或多个基因；iii)在FISH突变谱中包括的一个或多个基因中没有突变或具有多个突变；和/或iv)在测序突变谱中包括的一个或多个基因中没有突变或具有多个突变；和如果相对于规则数据库的比较表明该治疗应当对该疾病具有生物活性，和相对于规则数据库的比较没有表明该治疗不能用于治疗该疾病，则确定该治疗。疾病可以是癌症。分子谱分析步骤可以按任何顺序进行。在一些实施方案中，不是所有分子谱分析步骤都进行。作为一个非限制性的例子，如本文所述，如果样品的质量不满足阈值，则不进行微阵列分析。在一些实施方案中，生物材料是mRNA，质量对照测试包括使用管家基因例如RPL13a的RT-PCR的A260/A280比和/或Ct值。在实施方案中，如果A260/A280比＜1.5或RPL13a Ct值＞30，则mRNA通不过质量控制测试。在该情况中，可以不进行微阵列分析。或者，可以减弱微阵列结果，例如，与其它分子谱分析技术的结果相比给予较低的优先级。
在一些实施方案中，分子谱分析总是对特定基因或基因产物进行，而其它基因或基因产物的谱分析是任选的，例如，IHC表达谱分析可以至少对SPARC、TOP2A和/或PTEN进行。类似地，微阵列表达谱分析可以至少对CD52进行。在其它实施方案中，除上述以外的基因用来确定治疗。例如，用于IHC表达谱分析的一组基因可以进一步包括DCK、EGFR、BRCA1、CK 14、CK 17、CK 5/6、E-钙粘着蛋白、p95、PARP-1、SPARC和TLE3。在一些实施方案中，用于IHC表达谱分析的一组基因进一步包括Cox-2和/或Ki-67。在一些实施方案中，HSPCA通过微阵列分析检测。在一些实施方案中，对c-Myc和TOP2A进行FISH突变。在一些实施方案中，对PI3K进行测序。
本发明的方法可以在任何设置中使用，其中差异表达或突变分析已经与各种治疗的效果关联。在一些实施方案中，利用该方法确定用于癌症患者的候选治疗。在这些条件下，用于分子谱分析的样品优选地含有癌细胞。样品中癌细胞的百分比可以通过本领域技术人员已知的方法确定，例如使用病理学技术。也可以从样品富集癌细胞，例如显微解剖技术等。样品在用于分子谱分析之前可能需要具有特定阈值的癌细胞。阈值可能是至少大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或95％的癌细胞。阈值取决于分析方法。例如，揭示各细胞中表达的技术可能比使用从不同细胞的混合物提取的样品的技术需要较低的阈值。在一些实施方案中，疾病样品与取自同一患者的正常样品例如相邻的非癌组织进行比较。
治疗选择
本发明的系统和方法可以用来选择其突出的效力可能与分子谱分析结果联系的任何治疗。本发明包括使用分子谱分析结果提示与治疗反应的相关性。在一个实施方案中，根据患者的肿瘤类型选择用于分子谱分析的适当的生物标志物。这些提出的生物标志物可用来改变生物标志物的默认列表。在其它实施方案中，分子谱分析独立于来源材料。在一些实施方案中，利用规则根据分子谱分析测试结果提供提示的化学治疗。在一个实施方案中，从同行评议的临床肿瘤学文献的摘要产生规则。专家观点规则可以使用，但是是任选的。在一个实施方案中，使用来自United States Preventive Services Taskforce采用的证据分级系统衍生的层级结构估计临床引证与本发明的方法的相关性。“最佳证据”可以用作规则的基础。最简单的规则构建为“如果生物标志物为阳性则治疗选项一，否则治疗选项二”的形式。治疗选项包括没有特定药物的治疗、使用特定药物的治疗或使用联合药物的治疗。在一些实施方案中，构建更复杂的规则，其涉及两个或多个生物标志物的相互作用。在这些情况中，更复杂的相互作用一般得到临床研究的支持，该临床研究分析规则中包括的生物标志物之间的相互作用。最后，可以生成报告，该报告描述化疗反应和生物标志物的相关性和支持选择的治疗的最佳证据的大概说明。最终，经治医生将确定最佳疗程。
作为一个非限制性实例，分子谱分析可以揭示EGFR基因是扩增的或过表达的，因而表明可以阻断EGFR活性的治疗的选择，如单克隆抗体抑制剂西妥昔单抗和帕尼单抗，或对EGFR具有活化突变的患者有效的小分子激酶抑制剂，如吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼。临床开发的其它抗EGFR单克隆抗体包括扎芦木单抗、尼妥珠单抗和马妥珠单抗。选择的候选治疗可以取决于通过分子谱分析显示的设置。例如，激酶抑制剂通常与发现具有活化突变的EGFR一起开出。继续示例性的实施方案，分子谱分析也可能显示一些或全部这些治疗可能有效性较低。例如，施用吉非替尼或厄洛替尼的患者最终在EGFR中发展抗药性突变。因此，存在抗药性突变将表明不能选择小分子激酶抑制剂。技术人员将明白可以扩展这个例子以指导作用于分子谱分析显示其差异表达的基因或基因产物的其它候选治疗的选择。类似地，如果分子谱分析显示这些变体，则可以选择已知对携带某些核酸变体的病变细胞有效的候选药物。
可以通过本发明方法确定为候选治疗的癌症治疗包括但不限于：13-顺-视黄酸、2-CdA、2-氯脱氧腺苷、5-阿扎胞苷、5-氟尿嘧啶、5-FU、6-巯基嘌呤，6-MP，6-TG，6-硫鸟嘌呤，Abraxane、放线菌素-D，阿地白介素，阿仑珠单抗，ALIMTA，阿利维a酸、 全反式视黄酸、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤、氨磷汀、氨鲁米特、阿那格雷、阿那曲唑、阿糖胞嘧啶、Ara-C、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、阿扎胞苷、BCG、BCNU、苯达莫司汀、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、BiCNU、博来霉素、硼替佐米、白消安、C225、甲酰四氢叶酸钙、喜树碱-11、卡培他滨、CaracTM、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀片、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、噬橙菌因子、克拉屈滨、可的松、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、 达卡巴嗪、Dacogen、放线菌素D、达依泊汀Alfa、达沙替尼、道诺霉素柔红霉素、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、Decadron、地西他滨、Denileukin、Diftitox、DepoCytTM、Dexamethasone、DexamethasoneAcetate Dexamethasone Sodium Phosphate、Dexasone、Dexrazoxane、DHAD、DIC、Diodex多西他赛、多柔比星、多柔比星脂质体、DroxiaTM、DTIC、EligardTM、EllenceTM、EloxatinTM、表柔比星、Epoetin Alfa、Erbitux、厄洛替尼、Erwinia L-天冬酰胺酶、Estramustine、Ethyol 依托泊苷、依托泊苷Phosphate、Everolimus、依西美坦、 Filgrastim、Floxuridine、Fludarabine、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(cream)、Fluoxymesterone、氟他胺、Folinic Acid、氟维司群、G-CSF、吉非替尼、吉西他滨、Gemtuzumab ozogamicin、Gemzar、GleevecTM、 Wafer、GM-CSF、戈舍瑞林、Granulocyte-Colony Stimulating Factor、Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor、 Hexadrol、Hexamethylmelamine、HMM、Hydrocort Hydrocortisone、Hydrocortisone Sodium Phosphate、氢化可的松琥珀酸钠、氢化可的松磷酸盐、羟基脲、Ibritumomab、Ibritumomab、Tiuxetan、伊达比星、IFN-α、异环磷酰胺、IL-11、IL-2、伊马替尼mesylate、Imidazole Carboxamide、Interferon alfa、Interferon Alfa-2b(PEGConjugate)、白介素-2、白介素-11、Intron (interferon alfa-2b)、伊立替康、异维甲酸、伊沙匹隆、IxempraTM、Kidrolase(t)、拉帕替尼、L-天冬酰胺酶、LCR、Lenalidomide、来曲唑、Leucovorin、Leukeran、LeukineTM、亮丙瑞林、Leurocristine、LeustatinTM、脂质体Ara-C Liquid Lomustine、L-PAM、L-Sarcolysin、Lupron Maxidex、Mechlorethamine、Mechlorethamine Hydrochloride、 甲地孕酮、乙酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、MesnexTM、氨甲喋呤、氨甲喋呤钠、甲泼尼龙、丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌、MTC、MTX、MylocelTM、NeulastaTM、尼鲁米特、氮芥、奥曲肽、乙酸奥曲肽、OnxalTM、Oprevelkin、 奥沙利铂、紫杉醇、蛋白质结合的紫杉醇、帕米膦酸盐、帕尼单抗、PEG Interferon、培门冬酶、Pegfilgrastim、PEG-INTRONTM、PEG-L-天冬酰胺酶、培美曲塞、喷司他丁、苯丙氨酸氮芥、Prednisolone、Prednisone、Procarbazine、 Prolifeprospan 20 with Carmustine Implant、Raloxifene、利妥昔单抗、(Interferon Alfa-2a)、柔红霉素盐酸盐、Sandostatin 沙格司亭、Solu-索拉非尼、SPRYCELTM、STI-571、Streptozocin、SU11248、舒尼替尼、他莫昔芬、 替莫唑胺、Temsirolimus、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤Thiophosphoamide、塞替派、 托泊替康、托瑞米芬、酒石酸、曲妥珠单抗、维甲酸、TrexallTM、TSPA、VCR、VectibixTM、ViadurTM、长春碱、硫酸长春碱、Vincasar 长春新碱、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、VLB、VM-26、Vorinostat、VP-16、ZevalinTM、唑来膦酸、Zolinza、和其任意组合。
在一些实施方案中，产生将治疗和分子谱分析结果作图的数据库。治疗信息可以包括治疗剂对具有某些属性的细胞的突出的效果，该属性可以通过分子谱分析检测。分子谱分析可包括感兴趣的某些基因、蛋白质或其它生物分子的差异表达或突变。通过作图，分子谱分析结果可以与数据库进行比较以选择治疗。数据库可包括治疗和分子谱分析结果之间的阳性和阴性作图。在一些实施方案中，通过阅读关于生物剂和治疗剂之间的关联的文献进行作图。例如，为了可能的作图可以阅读杂志文章、专利出版物或专利申请出版物、科学报告等。作图可以包括体内结果，例如动物研究或临床试验的结果，或体外实验结果，例如细胞培养结果。发现的任何作图可以输入数据库，例如，治疗剂对表达基因或蛋白质的细胞的细胞毒性作用。以这种方式，数据库可以持续更新。应当理解，本发明的方法也更新。
作图的规则可以包括多种补充信息。在一些实施方案中，数据库含有优先化标准。例如，在给定设置具有突出效果的治疗可能优于具有较低效果的治疗。从某些设置例如临床实验衍生的作图可能优于由另一设置例如细胞培养实验衍生的作图。具有强文献支持的治疗可能比更多初步结果支持的治疗优先化。通常应用于所述疾病类型的治疗，例如某些组织来源的癌症，可能比用于特定疾病的治疗优先化。作图可包括治疗和分子谱分析结果之间的阳性和阴性相关。在一个非限制性的例子中，一种作图可以提示使用激酶抑制剂如厄洛替尼对抗在EGFR中具有活化突变的肿瘤，而另一作图可能提示如果EGFR也具有抗药性突变，针对该治疗。类似地，治疗可能显示在某些基因或蛋白质过表达的细胞中有效，但是如果基因或蛋白质欠表达则无效。
为个体选择候选治疗可基于来自所述方法的任一个或多个的分子谱分析结果。或者，为个体选择候选治疗可基于来自所述方法中的一种以上的分子谱分析结果。例如，为个体选择治疗可基于来自单独的FISH、单独的IHC、或单独的微阵列分析的分子谱分析结果。在其它实施方案中，为个体选择治疗可基于来自IHC、FISH和微阵列分析、IHC和FISH、IHC和微阵列分析、或FISH和微阵列分析的分子谱分析结果。为个体选择治疗也可基于来自测序或其它突变检测方法的分子谱分析结果。分子谱分析结果可包括突变分析连同一个或多个方法，如IHC、免疫测定和/或微阵列分析。可以使用不同的组合或连续结果。例如，治疗可以根据通过分子谱分析获得的结果进行优先化。在一个实施方案中，优先化基于以下算法：1)IHC/FISH和微阵列指示与第一优先级相同的靶标；2)单独的IHC阳性结果为下一优先级；或3)单独的微阵列阳性结果为最后优先级。测序可以用来指导选择。在一些实施方案中，测序揭示抗药性突变，因此不选择所述药物，即使包括IHC、微阵列和/或FISH在内的技术显示靶分子的差异表达。任何这样的禁忌，例如，另一基因或基因产物的差异表达或突变可能放弃治疗的选择。
微阵列表达结果相对于预测的治疗的一个示例性列表显示在表1中。进行分子谱分析以确定与对照相比样品中的基因或基因产物是否差异表达。对照可以是该设置的任何合适的对照，包括但不限于对照基因如管家基因的表达水平，相同基因在来自同一或其它个体的健康组织中的表达、统计学手段、检测水平等。本领域技术人员应当理解，任何适用的分子谱分析技术(例如，微阵列分析PCR、Q-PCR、RT-PCR、免疫测定、SAGE、IHC、FISH或测序)的结果可以用来确定表达状态。基因或基因产物的表达状态用来选择预计有效或无效的药物。例如，表1显示ADA基因或蛋白质的过表达意味着喷司他丁为可能的治疗。另一方面，ADA基因或蛋白质的欠表达涉及对阿糖胞苷的抗性，提示阿糖胞苷不是最佳治疗。
表1：分子谱分析结果和预测的治疗
表2显示对于治疗选择的更广泛的规则概述。对于表中的每个生物标志物，显示了测定类型和测定结果。给出测定结果的各种治疗剂的效力的概述可以来自于医学文献或其它医学知识库。结果可用来指导特定治疗剂的选择为推荐的或不推荐的。在一些实施方案中，该表连续更新为新的文献报告，并且治疗变得可以获得。以这种方式，本发明的分子谱分析将随时间进步和改进。表2中的规则可以储存在数据库中。当获得分子谱分析结果例如基因或基因产物的差异表达或突变时，结果可以相对于数据库进行比较以指导治疗选择。数据库中的规则组可以更新为新的治疗，并且新的治疗数据可以获得。在一些实施方案中，规则数据库持续更新。在一些实施方案中，规则数据库定期更新。规则数据库可以至少第天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每10天、每2周、每3周、每4周、每个月、每6周、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月、每12个月、每年、每18个月、每2年或至少每3年更新一次。任何相关的关联或比较方法可以用来比较分子谱分析结果与规则数据库。在一个实施方案中，通过分子谱分析确定基因或基因产物是差异表达的。查询规则数据库以选择该基因或基因产物的条目。提取从规则数据库选择的治疗选择信息并用来选择治疗。例如推荐或不推荐特定治疗的信息可以取决于基因或基因产物是过表达还是欠表达。在一些情况中，可以根据分子谱分析结果从数据库中抽取多种规则和治疗。在一些实施方案中，治疗选项在列表中优先化以呈现给最终用户。在一些实施方案中，呈现治疗选项而没有优先化信息。在任一种情况中，个体，例如经治医生或类似的护理者，可以从可用的选项中选择。
本文所述的方法可以用来通过提供个性化的治疗选项延长患者的存活期。在一些实施方案中，所述患者以前用一种或多种治疗剂治疗，以治疗疾病例如癌症。所述癌症可以是这些药物之一难治的，例如通过获得抗药性突变。在一些实施方案中，所述癌症是转移的。在一些实施方案中，所述患者以前没有用一种或多种用该方法确定的治疗剂治疗。使用分子谱分析，可以不考虑癌细胞的阶段、解剖学位置或解剖学来源选择候选治疗。
无进展存活率(PFS)表示患有疾病例如癌症的个体或一组个体在开始疗程后保持无疾病进展的几率。它可以指在规定持续时间后疾病可能保持稳定(例如，不显示进展指征)的个体在组中的百分比。无进展存活率是特定治疗的有效性的指标。类似地，无病存活率(DFS)表示患有癌症的个体或一组个体在开始特定治疗后保持无疾病的几率。它可以指在规定持续时间后可能无疾病的个体在组中的百分比。无病存活率是特定治疗的有效性的指标。治疗策略可以以类似患者组中达到的PFS或DFS为基础进行比较。当描述癌症存活率时，无病存活率通常与术语总存活率一起使用。
通过本发明的分子谱分析选择的候选治疗可以与非分子谱分析选择的治疗进行比较，这是通过比较使用通过分子谱分析选择的治疗的无进展存活期(PFS)(阶段B)与患者刚刚进行的最新治疗的PFS(阶段A)。参见图32。在一个设置中，PFS(B)/PFS(A)比≥1.3用来表示分子谱分析选择的治疗为患者提供益处(Robert Temple，Clinical measurementin drug evaluation.Edited by Wu Ningano and G.T.Thicker John Wiley andSons Ltd.1995；Von Hoff，D.D.Clin Can Res.4：1079，1999：Dhani等人Clin Cancer Res.15：118-123，2009)。比较通过分子谱分析选择的治疗与非分子谱分析选择的治疗的其它方法包括确定反应率(RECIST)和4个月时的无进展患者百分比或死亡。PFS数值中使用的术语“大约”是指相对于该数值变化+/-百分之十(10％)。与非分子谱分析选择的治疗相比，通过分子谱分析选择的治疗的PFS可以延长至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。在一些实施方案中，与非分子谱分析选择的治疗相比，通过分子谱分析选择的治疗的PFS可以延长至少100％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％，或至少大约1000％。在另外其它实施方案中，PFS比(分子谱分析选择的治疗或新治疗的PFS/原有疗法或治疗的PFS)至少为大约1.3。在另外其它实施方案中，PFS比至少为大约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。在另外其它实施方案中，PFS比至少为大约3、4、5、6、7、8、9或10。
类似地，可以在使用或不使用分子谱分析选择其治疗的患者中比较DFS。在实施方案中，与非分子谱分析选择的治疗相比，通过分子谱分析选择的治疗的DFS至少延长10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，或至少90％。在一些实施方案中，与非分子谱分析选择的治疗相比，通过分子谱分析选择的治疗可以使DFS延长至少100％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或至少大约1000％。在另外其它的实施方案中，DFS比(分子谱分析选择的治疗或新的治疗的DFS/原有疗法或治疗的DFS)为至少大约1.3。在另外其它的实施方案中，DFS比至少为大约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。在另外其它的实施方案中，DFS比至少为大约3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，本发明的候选治疗不会提高患者的PFS比或DFS比，但是分子谱分析提供有价值的患者益处。例如，在一些情况下没有为患者确定优选的治疗。在这些情况下，分子谱分析提供一种确定候选治疗的方法，其中没有一种候选治疗现在已被确定。分子谱分析可以使PFS、DFS或寿命延长至少1周、2周、3周、4周、1个月、5周、6周、7周、8周、2个月、9周、10周、11周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月或2年。分子谱分析可以使PFS、DFS或寿命延长至少21/2年、3年、4年、5年或更长。在一些实施方案中，本发明的方法改善结果使得患者得到缓解。
治疗的有效性可以通过其它手段监测。完全反应(CR)包括疾病完全消失：在检查、扫描或其它检验时没有明显疾病。部分反应(PR)是指某些疾病保留在体内，但是病变的大小或数量减少30％或更多。疾病稳定(SD)是指疾病的病变大小和数目保持相对不变。通常，尺寸的小于50％的减少或轻微的增加将被描述为稳定的疾病。进行性疾病(PD)的意思是该疾病在治疗后大小或数量增加。在一些实施方案中，本发明的分子谱分析导致完全反应或部分反应。在一些实施方案中，本发明的方法导致疾病稳定。在一些实施方案中，本发明能够实现疾病稳定，其中非分子谱分析导致进行性疾病。
计算机系统
传统的数据网络、应用发展和该系统的其它功能方面(和该系统的各操作组件的组件)可能未在本文中详细描述，但是为本发明的部分。此外，本文包含的各图中显示的连接线意在代表各个元件之间的示例性功能关系和/或物理耦合。应当注意，许多替代的或另外的功能关系和/或物理耦合可以存在于实际的系统中。
本文所述的各个系统部件可包括以下一个或多个：主机服务器或其它计算系统，包括用于处理数字数据的处理器；偶接至处理器的用于存储数字数据的存储器；偶接至处理器的用于输入数字数据的输入数字转换器；存储在存储器中并可被处理器访问用于指导处理器处理数字数据的应用程序；偶接至处理器和存储器的、用于显示处理器处理的数字数据产生的信息的显示装置；和多个数据库。本文使用的各种数据库可包括：患者数据如家族史、人口统计学和环境数据、生物样品数据、现有治疗和方案数据、患者临床数据、生物样品的分子谱分析数据、关于治疗药物和/或研究药物的数据、基因文库、疾病库、药物库、患者追踪数据、文件管理数据、财务管理数据、账单数据和/或可用于系统操作的类似数据。本领域技术人员应当理解，用户计算机可包括操作系统(例如，Windows NT，95/98/2000，OS2，UNIX，Linux，Solaris，MacOS等.)以及各种常规支持软件和与计算机结合的驱动器。计算机可包括任何合适的个人计算机、网络计算机、工作站、小型计算机、主机等。用户计算机可以位于接入网络的房间或医疗/商业环境中。在一个示例性的实施方案中，使用可以购到的网络浏览器软件包通过网络或互联网接入。
本文使用的术语“网络”包括并入其硬件和软件成分的任何电子通信手段。各方之间的通信可以通过任何合适的通信渠道来实现，例如电话网络、外联网、内联网、互联网、交互装置的点、个人数字助理(例如，Palm)、移动电话、公用电话等)、在线通信、卫星通信、离线通信、无线通信、应答器通信、局域网(LAN)、广域网(WAN)、联网或连接装置、键盘、鼠标和/或任何合适的通信或数据输入方式。而且，尽管系统在本文中常常被描述为使用TCP/IP通信协议执行，但是该系统也可以使用IPX、Appletalk、IP-6、NetBIOS、OSI或任何数量的现有或未来协议实现。如果网络是公共网络的性质，如互联网，假定网络不安全并且对偷窥者是开放的可能是有利的。与结合互联网使用的协议、标准和应用软件相关的具体信息通常是本领域技术人员已知的，因此在本文中不需要详述。参见，例如，DILIPNAIK，INTERNET STANDARDS和PROTOCOLS(1998)；JAVA 2 COMPLETE，各作者，(Sybex 1999)；DEBORAH RAY和ERIC RAY，MASTERING HTML 4.0(1997)；和LOSHIN，TCP/IP CLEARLY EXPLAINED(1997)and DAVID GOURLEYAND BRIAN TOTTY，HTTP，THE DEFINITIVE GUIDE(2002)，其内容通过引用并入本文。
各个系统部件可以独立地、分别地或总体适当地通过数据链接连接至网络，该数据链接包括，例如，在本地网路上与互联网服务提供商(ISP)的连接，一般与标准调制解调器通信、线缆调制解调器、Dish网络、ISDN、数字用户专线(DSL)或各种无线通信方法结合使用，参见，例如，GILBERT HELD，UNDERSTANDING DATA COMMUNICATIONS(1996)，其通过引用并入本文。应当注意，网络可应用为其它类型的网络，如交互式电视(ITV)网络。而且，该系统涉及任何商品、服务或信息在任何具有本文所述的类似功能的网络上的使用、销售或分配。
本文使用的“传送”可包括将电子数据经网络连接从一个部件传送给另一个部件。另外，本文使用的“数据”可包括数字或任何其它形式的信息如指令、查询、文件、用于存储的数据等。
该系统涉及与网络服务器、应用计算、普遍的和个性化的计算、安全性和一致性方案、自动计算、商品计算、移动和无线方案、开放源、生物测定学、栅格计算和/或筛目计算。
本文所述的任何数据库可包括有关的、分级的、图形的或面向对象的结构和/或任何其它数据库结构。可用来实现数据库的常用的数据库产品包括IBM的DB2(White Plains，NY)、可从Oracle Corporation(Redwood Shores，CA)获得的各种数据库产品、Microsoft Corporation(Redmond，Washington)的Microsoft Access或Microsoft SQL Server、或任何其它合适的数据库产品。而且，数据库可以以任何合适的方式组织为，例如，数据表或查找表。每个记录单文件、一系列文件、连接的一系列数据区或任何其它数据结构。某些数据的关联可以通过任何希望的数据关联技术如本领域已知或实施的技术来实现。例如，该关联可以手工或自动实现。自动关联技术可包括，例如，数据库搜索、数据库合并、GREP、AGREP、SQL、使用表格中的关键区来加速检索、通过所有表格和文件顺序检索、按照已知顺序分类文件中的记录以简化查找，和/或类似的技术。关联步骤可以通过数据库合并功能实现，例如使用预选择的数据库或数据扇区中的“关键区”。
更特别的是，“关键区”按照关键区定义的对象的高水平类别将数据库分区。例如，某些类型的数据可以被指定为多个相关数据表格中的关键区，数据表然后可以在关键区中数据类型的基础上关联。对应于每个连接数据表中的关键区的数据优选地是相同的或是相同的类型。然而，在关键区具有相似但不相同的数据的数据表也可以使用例如AGREP关联。根据一个实施方案，任何合适的数据存储技术可以用来存储数据，不需标准格式。数据集可以使用任何合适的技术存储，包括，例如，使用ISO/IEC 7816-4文件结构存储各个文件；实现一个区域，由此选择暴露一个或多个含有一个或多个数据集的基本文件的专用文件；使用以层次式文件系统存储在单个文件中的数据集；作为单文件记录存储的数据集(包括压缩、SQL可访问、由第一元组通过一个或多个关键字、数字、字母杂乱干扰等)；二进制大对象(BLOB)；存储为使用ISO/IEC 7816-6数据元编码的未分组的数据元；存储为使用如ISO/IEC 8824和8825中的ISO/IEC Abstract Syntax Notation(ASN.1)编码的未分组的数据元；和/或其它专有技术，可包括分形压缩方法、图像压缩方法等。
在一个示例性的实施方案中，将信息分类为BLOB有利于以不同格式存储多种信息的能力。因此，任何二进制信息可以存储在与数据集结合的存储空间。BLOB方法可以将数据集存储为未分组的数据元，其使用固定存储分配、环状伫列技术或关于存储管理的最佳实践(例如，页式存储器，最近最少使用等)通过固定存储补偿格式化为二进制块。通过使用BLOB方法，存储各种具有不同格式的数据集的能力有利于多个和无关的数据集所有者存储数据。例如，可存储的第一数据集可由第一方提供，可存储的第二数据集可由无关的第二方提供，可存储的第三数据集可由与第一方和第二方无关的第三方提供。这三个示例性数据集中的每一个可含有不同信息，使用不同的数据存储形式和/或技术将其存储。此外，每个数据集可包含也可能不同于其它亚集的数据亚集。
如上所述，在各种实施方案中，数据可以不用常用格式存储。然而，央一个示例性实施方案中，当为了操作数据而提供时，数据集(例如，BLOB)可以以标准方式注释。注释可以包含短标题、结尾或其它合适的与用来传送在管理各种数据集中有用的信息的每个数据集有关的指示符。例如，注释在本文中可以被称为“条件标题”、“标题”、“结尾”或“状态”，可包含数据集状态的说明，或者可以包括与数据的具体发出者或所有者相关的标识符。后续的数据字节可以用来说明例如数据的发出者或所有者、用户的身份、交易/会员帐户标识符等。这些条件注释中的每一个在本文中进一步讨论。
数据集注释也可以用于其它类型的状态信息以及各种其它目的。例如，数据集注释可以包括建立访问级别的安全性信息。例如，访问级别可以设置为只允许某些个体、等级雇员、公司或其它实体访问数据集，或允许根据交易、数据的发出者或所有者、用户等访问特定数据集。此外，安全性信息可以限制/只允许某些动作如访问、改变和/或删除数据集。在一个实例中，数据集注释表明只有数据集所有者或用户被允许删除数据集，可以允许经确认的各用户读取访问数据集，其他人均不允许访问该数据集。但是，也可以使用其它访问限制参数，它们允许各实体适当地以各种许可水平访问数据集。数据，包括标题或结尾，可以由独立交互装置接收，该装置配置为按照标题或结尾添加、删除、个性或增加数据。
本领域技术人员也理解，出于安全原因，任何数据库、系统、装置、服务器或系统的其它部件可以在一个地点或多个地点由其任何组合组成，其中每个数据库或系统包括各种合适的安全特征的任何一种，如防火墙、存取码、加密、解密、压缩、解压缩和/或类似物。
网络客户端的计算单元可以进一步装备互联网浏览器，该浏览器使用标准拨号、电缆、DSL或本领域已知的任何其它互联网协议连接到互联网或内联网。从网络客户端开始的交易可以通过防火墙，以防止其它网络的用户未经授权的访问。此外，额外的防火墙可以在CMS的各个成分之间展开，以进一步提高安全性。
防火墙可以包括适当构建为保护CMS部件和/或企业计算资源防止其它网络的用户的任何硬件和/或软件。进而，防火墙可以配置为限制通过网络服务器连接的网络客户对防火墙后多种系统和部件的访问。防火墙可以是不同的构造，包括Stateful Inspection、基于Proxy的和Packet Filtering。防火墙可以集成到网络服务器或任何其它CMS部件内，或者可以进一步作为单独的实体存在。
本文所述的计算机可提供用于可及的合适的网址或其它基于互联网的图形用户界面。在一个实施方案中，Microsoft Internet InformationServer(IIS)、Microsoft Transaction Server(MTS)和Microsoft SQL Server与Microsoft操作系统、Microsoft NT网络服务器软件、Microsoft SQLServer数据库系统和Microsoft Commerce Server一起使用。另外，诸如Access或Microsoft SQL Server、Oracle、Sybase、Informix MySQL、Interbase等部件可以用来提供Active Data Object(ADO)规定数据库管理系统。
具有网页的网站可以促进此处所述的通信、输入、存储、数据库或显示中的任何一个。本文使用的术语“网页”是指限制可与用户交互的文件和应用类型。例如，典型的网站除了标准HTML文件外还可以包括各种形式、Java小应用程序、JavaScript、活动服务器页面(ASP)、公共网关接口脚本(CGI)、可扩展标识语言(XML)、动态HTML、层叠样式表(CSS)、辅助应用程序、插件等。服务器可包括网络服务，从网络服务器接收请求，该请求包括URL(http://yahoo.com/stockquotes/ge)和IP地址(123.56.789.234)。网络服务器检索相应的网页，并将该网页的数据或应用程序发送至IP地址。网络服务是能够与其他应用程序通过通信手段如互联网交互的应用。网络服务通常是基于标准或协议如XML、XSLT、SOAP、WSDL和UDDI。网络服务方法是本领域公知的，并且覆盖在许多标准文本中。参见，例如，ALEX NGHIEM，IT WEB SERVICES：A ROADMAP FOR THEENTERPRISE(2003)，通过引用并入本文。
用于本发明系统和方法的基于网络的临床数据库优选地具有以原始格式上载和存储临床数据文件的能力，并且可用任何临床参数搜索。该数据库也可以改变规模，并且可以使用EAV数据模型(元数据)以输入来自任何研究的临床注释以便容易地与其它研究整合。另外，基于网络的临床数据库是灵活的，可以是能够动态添加用户定制的问题的XML和XSLT。此外，数据库包括可输出至CDISC ODM。
医务人员也应当理解，存在大量的在基于浏览器的文件内显示资料的方法。资料可以显示为标准文本或在固定列表、可滚动列表、下拉式清单、可编辑文本框、固定文本框、弹出式窗口等内。同样，存在大量方法可用于使用键盘、选择菜单项、复选框、选项框等改变网页中的数据，例如，自由文本项。
系统和方法可在本文描述功能块组件、屏幕截图、可选的选择和不同的处理步骤。应该明白，这些功能块可以由配置为执行指定的功能的任何硬件和/或软件部件来实现。例如，系统可采用各种集成电路元件，例如，记忆体元件、处理单元、逻辑单元、查找表等，它们可能开展的一个或多个微处理器控制下的多种功能或其他控制装置。同样，系统的软件元素可能用编程的任何或脚本语言执行，如C、C++、Macromedia Cold Fusion、Microsoft活动服务器页面、Java、COBOL、汇编、PERL、Visual Basic、SQL存储过程、可扩展标记语言(编程XML)，与使用数据结构、对象、过程、例程或其他编程元素的任意组合执行的各种算法。此外，应该注意到，该系统可使用任何数目的信号，数据传输，数据处理，网络控制等传统技术。进一步，该系统可用于检测或防止与客户端脚本语言如JavaScript、VBScript等的安全问题。对于加密和网络安全的基本介绍，请参阅下列文献：(1)“Applied Cryptography：Protocols，Algorithms，和Source Code In C，”byBruce Schneier，published by John Wiley&Sons(second edition，1995)；(2)“Java Cryptography”by Jonathan Knudson，published by O’Reilly&Associates(1998)；(3)“Cryptography&Network Security：Principles&Practice”by William Stallings，published by Prentice Hall；all of which arehereby incorporated by reference.
本文使用的术语“最终用户”、“消费者”、“顾客”、“客户”、“经治医生”、“医院”或“业务”可相互交替使用，每个系指任何个人、实体、机器、硬件、软件或业务。均配备计算设备，以便与系统交互并方便在线数据访问和数据输入。客户具有个人电脑形式的计算单元，虽然可使用其他类型的计算单位，包括笔记本电脑、便携电脑、手持计算机、机顶盒、移动电话、按键式电话等。本发明的系统和方法的所有者/操作者具有计算机-服务器形式的计算单元，尽管该系统涉及其它工具，包括显示为主框架计算机的计算中心、微型计算机、PC服务器、位于相同或不同的地理位置的计算机网络，等等。此外，该系统考虑通过任何具有类似功能的网络使用、销售或分发任何物品、服务或信息。在任何网络上的信息，本文所述。
在一个示例性的实施方案中，每个客户端的客户可能会发出一个“账户”或“帐户号码”。本文中所使用的帐户或帐户号码可包括任何设备，代码，数字，字母，符号，数字证书，智能芯片，数字信号，模拟信号，生物识别或其他标识符/征象适当配置，让消费者访问，与系统(例如，一个或多个授权/访问代码，个人识别号码(PIN)，互联网代码，其他的识别码，和/或类似)交互或通信。账号可以任选地位于收费卡，信用卡，借记卡，预付费卡，浮雕卡，智能卡，磁条卡，条码卡，转发器，射频卡或关联的帐户。该系统可能包括与上述任何卡或接口或设备，或fob转发器和RFID阅读器与fob射频通信。虽然系统可能包括fob实施方案，发明并非限于此。事实上，系统可能会包括有配置RFID读写器通过射频通信通信转发器的任何设备。典型的设备可能包括，例如，钥匙圈，标签，卡片，手机，腕表或能够提出查询的任何形式。此外，本文讨论的该系统、计算单位或设备可能包括“普适计算设备”，其中可能包括传统的非计算机化的设备，嵌入式计算单位。帐户号码可分发和存储，塑胶，电子，磁，无线电频率的任何形式，无线，音频和/或光学设备能够传输或下载数据本身到第二个设备。
本领域技术人员应当理解，该系统可体现为现有系统的定制，附加产品，软件升级，独立的系统，分布系统，方法，数据处理系统，数据处理设备，和/或计算机程序产品。因此，该系统可能采用完整的的软件实施方案，完整的硬件实施方案，或包括软件和硬件方面的实施方案的形式。此外，该系统可采用计算机可读存储介质上的计算机程序产品的形式，具有嵌入存储介质的计算机可读的程序代码工具。可利用任何合适的计算机可读存储介质，包括硬盘，CD-ROM光存储设备，磁存储设备和/或类似设备。
系统和方法的描述参考方法的屏幕截图、框图和流程图，仪器(例如，系统)，和根据不同的实施方案的计算机程序产品。应当理解，块图和流程图的每个功能块图和以及块图的功能块图和流程图的组合，分别可以通过计算机程序指令实现。
现在参见图2-25，描绘的流程和截图仅仅是实施方案，不是为了限制本发明的范围。例如，任何方法或程序说明中描述的步骤可能以任何顺序执行，不仅限于所示的顺序。应当理解，下面的说明不仅适当参考了图2-25所示的步骤和用户界面元素，而且参考了上面参考图1所述的不同的系统组件。
这些计算机程序指令可加载到通用计算机，专用计算机，或其他可编程数据处理设备的生产机器，这样在计算机上执行的指令或其他处理设备创建可编程的数据是指为实施流程图块或块中指定的功能。这些计算机程序指令，也可以存储在计算机可读的内存，可指导计算机或其他可编程数据处理设备以特定方式作用，这样在计算机可读存储器中存储的指令产生制造的物品，包括实施流程图块或块中指定的功能的指令工具。计算机程序指令也可以装上计算机或其他可编程数据处理设备，使一系列操作步骤在计算机上或其他可编程仪器执行，以生产计算机实施过程等，在计算机上执行指令或其他可编程仪器提供实施流程图块或块中指定的功能的步骤。
因此，功能块框图和流程图支持执行指定的函数执行指定的功能，步骤的组合方式的组合，和程序指令是指执行指定的函数。也可以理解，每个功能块框图和流程图、功能框图和流程图，可以通过基于硬件或者特殊用途的计算机系统执行指定的函数或步骤实施的块和组合，或适合特殊目的的硬件组合和计算机指令。此外，处理流程的图示和描述可参考用户窗口，网页，网站，网页形式，提示等。从业者明白，说明本文所述的步骤可以包括任意数量的配置，包括使用窗口，网页，网页形式，弹出窗口，提示等。所示的多个步骤和描述可能会合并成单一的网页和/或窗口，但为简单已扩大。在其他情况下，说明和描述为单个进程步骤的步骤可分为多个网页和/或窗户，但为简单起见被合并。
益处、其他优势和问题的解决方案已被关于具体实施方案描述。但是，可能导致发生任何好处、优势或解决方案或使其更突出的好处、优势、问题的解决方案和任何元素不被解释为任何或所有权利要求或发明的关键、需要或必需的特征或元素。本发明的范围因此仅限于权利要求书，其中提到的单数不是意味着“一个和仅有一个”，除非明确说明，而是“一个或更多个”。本领域技术人员已知的上述实施方案的元素的所有结构、化学和功能等同物通过参考引入，包含在本发明的的权利要求中。此外，设备或方法不必要解决每一个本发明寻求解决的问题，它包含在权利要求中。此外，本发明披露的任何元素、组件或方法步骤并非是要公开，不论是否该元素、组件或方法步骤在权利要求中提到。此处请求保护的元件不应根据35 USC112第六款的规定解释，除非该元素使用短语“意思是”明确引用。本文使用的术语“包括”、“包含”或任何其他的变化旨在涵盖非排他性的包容，如包括一系列元素的过程、方法、物品或设备并不只包括这些元素，而是可包括未明确列出的或这些过程、方法、物品或设备固有的其他元素。此外，此处所描述的任何元素都不是实施发明所必需的，除非明确地描述为“必要”或“关键的”。
图1显示系统10示例性实施方案的框图，用于利用患者生物标本的分子谱分析确定对特定疾病状态的个性化的医疗干预。系统10包括用户界面12、主机服务器14，包括用于处理数据的处理器16、偶接至处理器的存储器18、存储在存储器18中并可由处理器16访问的应用程序20(用于指导处理器16的数据处理)、多个内部数据库22和外部数据库24，和与有线或无线通信网络(如互联网)的界面26。系统10还可包括偶接至处理器16的输入数字转换器28，用于从用户界面12接收的数据输入数字数据。
用户界面12包括输入设备30和显示器32，用于将数据输入到系统10中和显示来自处理器16所处理的数据的信息。用户界面12还可包括打印机34，用于打印从处理器16处理的数据所得出的信息，如患者报告，其中可能包括目标的测试结果和根据该测试结果建议的药物疗法。
内部数据库22可包括但不限于患者生物样品/标本信息和追踪、临床数据、患者数据、患者追踪、文件管理、研究方案、来自分子谱分析的患者检测结果、和帐务信息和追踪。外部数据库24可包括但不限于药物库、基因库、疾病库和公共和私人数据库如UniGene，OMIM，GO，TIGR，GenBank，KEGG和Biocarta。
分子谱分析方法
可以根据系统10使用各种方法。图2显示方法50的示例性实施方案的流程图，用于确定对特定疾病状态的个性化医疗干预，它利用患者生物标本的分子谱分析，是非疾病特异性的。为了使用独立于疾病谱系诊断(即不限于一种疾病)的分子谱分析确定对特定疾病状态的医疗干预，在步骤52中对来自患者的生物样品的至少一个目标至少进行一种检验。目标被定义为可从分子检测中获得的任何分子发现。例如，目标可以包括一个或多个基因、一个或多个基因表达的蛋白质、一个或多个分子机制和/或其组合。例如，目标的表达水平可以通过分析mRNA水平或目标或基因或基因的蛋白质水平来确定。用于发现这些目标的检测可包括但不限于荧光原位杂交(FISH)、原位杂交(ISH)和本领域技术人员已知的其它分子检验。可以使用基于PCR的方法如实时PCR或定量PCR。此外，微阵列分析如比较基因组杂交(CGH)微阵列、单核苷酸多态性(SNP)微阵列、蛋白质组阵列或抗体阵列分析也可以用于此处公开的方法中。在一些实施方案中，微阵列分析包括确定在p＜0.001的显著性，基因相对于参照是上调还是下调。目标的检测或分析也可以包括免疫组化(IHC)分析。在一些实施方案中，IHC分析包括确定30％或更多的样品是否染色，染色强度是否+2或更强，或两者。
此外，此处公开的方法也包括对一种以上的靶标进行谱分析。例如，可以确定多种基因的表达。此外，确定样品中的多种靶标可以通过一种方法或者通过各种手段进行。例如，第一基因的表达可以通过第一方法确定，第二基因的表达水平用不同的方法确定。或者，可以利用同一方法来检测第一和第二基因的表达水平。例如，第一方法可以是IHC，第二是微阵列分析，如检测基因的基因表达。
在一些实施方案中，分子谱分析也可以包括鉴别靶标的遗传变异，如突变、多态性(如SNP)、缺失或插入。例如，鉴别基因中的SNP可以通过微阵列分析、实时PCR或测序确定。本文公开的其它方法也可以用来鉴别一个或多个靶标的变体。
因此，可以进行以下的一个或多个：步骤54中的IHC分析，步骤56中的微量分析，和步骤58中的本领域技术人员已知的其它分子检测。
从患病患者获得生物样品可以通过进行肿瘤活检、进行微创手术(如果无法获得最近的肿瘤)、获得患者血液样品或任何其它生物液体样品，包括但不限于细胞提取物、核提取物、细胞裂解物或生物产物或生物来源物质如排泄物、血液、血清、尿、痰、泪、粪便、唾液、膜提取物等。
在步骤60中，决定步骤52中检测的一个或多个靶标与该特定靶标的正常参照相比是否显示表达变化。在本发明的一个示例性方法中，在步骤54中可以进行IHC分析，并在步骤64中通过确定是否30％或更多的生物样品细胞对于特定目标为+2或更高染色来确定来自IHC分析的目标是否显示表达变化。本领域技术人员应当理解，有一些情况中+1或更强的染色将表示表达变化，因为染色结果可能根据进行检测的技术人员和测试的目标类型而变化。在本发明的另一示例性实施方案中，可以在步骤56中进行微阵列分析，并在步骤66中确定来自微阵列分析的任何目标是否显示表达变化，这是通过确定特定目标相对于来源参照正常组织的表达变化倍数在p＜0.001是否显著，从而确定哪些目标上调或下调来进行的。表达变化也可以通过不存在一个或多个基因、基因表达的蛋白质、分子机制或其它分子发现来证明。
在步骤60中确定哪些目标显示表达变化后，确定至少一种非疾病特异性药物，它与在步骤70中具有表达变化的每种目标相互作用。药物可以是任何具有疗效的药物或化合物。非疾病特异性药物是以前未治疗患者的诊断疾病的治疗药物或化合物，它能够与来自患者生物样品的显示表达变化的目标相互作用。一些已经发现与癌症患者中的特异性目标相互作用的不同特定非疾病特异性药物在下表3中显示。
表3
最后，在步骤80中，可以提供患者特征报告，包括患者的多种靶标的检测结果和根据这些结果建议的治疗。图3A-3D显示示例性的患者特征报告。图3A显示的患者特征报告100确定检测目标102，这些检测目标显示显著的表达变化104，并提出与目标106相互作用的非疾病特异性药物的。图3B中显示的患者特征报告确定了对于某些基因表达的蛋白质110的免疫组化分析的结果108，以及通过确定是否30％或更多的肿瘤细胞为+2或更高染色来确定基因表达的蛋白质是否是分子目标112。报告100也显示了未进行的免疫组化检验114。图3C中所示的患者特征报告100确定用于微阵列分析的分析基因116以及是否基因与参照相比欠表达或过表达118。最后，图3D所示的患者特征报告100确定了患者的临床史120，和提交的患者标本122。分子谱分析技术可以在任何地方进行，例如，外国，结果通过网络传送到合适的一方，例如，患者、医生、实验室或远处的其它各方。
图4显示用于确定能够与目标相互作用的药物治疗/药物的方法200的示例性实施方案的流程图。在步骤202中，确定在大量患病个体中显示表达变化的分子目标。接下来，在步骤204中，给患病个体施用药物治疗/药物。施用药物治疗/药物后，在步骤202中确定的分子目标的任何变化在在206步中鉴别，以确定在步骤204中施用的药物治疗/药物是否与在步骤202中确定的分子目标相互作用。如果确定在步骤204中施用的药物治疗/药物与在步骤202中确定的分子目标相互作用，则该药物治疗/药物可被批准用于治疗表现出鉴别的分子目标表达变化的患者，而不是批准用于特定疾病的药物治疗/药物。
图5-14是说明本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的各部分的流程图和图示。图5显示本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的示例性的临床决定支持系统。通过临床研究和临床护理获得的数据如临床试验数据、生物医学/分子成像数据、基因组学/蛋白质组学/化学文库/文献/专家监管、生物标本/LIMS、家族史/环境记录和临床数据被采集并存储为数据库和数据仓库内的数据中心。图6显示信息使用网络服务通过本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的示例性的临床决定支持系统的流动。用户与系统交互，这是通过经基于表格的项/上载数据集、制定查询和执行数据分析工作，和获得和评估输出数据的展示将数据输入系统。在基于网络的系统的数据仓库中，从各种数据库系统提取数据、转换、加载和。数据库也是发生常见的格式、作图和转化的地方。基于网络的系统还包括基于感兴趣的数据视图创建的数据中心。
图7显示了本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的示例性的临床决定支持系统的流程图。临床信息管理系统包括实验室信息管理系统和数据库中所含的医疗信息，数据库除了文献文本挖掘以外，还包括医疗信息库，如药物库，基因库和疾病库。与特定患者有关的信息管理系统和医疗信息数据库和数据仓库在数据集成中心汇合，在此处可以获得诊断信息和治疗选项。财务管理系统也可以被纳入本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的示例性的临床决定支持系统
图8是生物标本追踪和管理系统的一个例子的图示，该系统可以用作本发明的基于信息的个性化医学药物发现系统和方法的一部分。
图8显示两个向组织/血液库运送标本的医疗中心。标本可以在运送前进行实验室分析。也可以通过微阵列、基因分型和蛋白质组学分析对样品进行研究。该信息可以重新分配给组织/血液库。
图9显示生物标本追踪和管理系统的一个例子的流程图，该系统可以应用本发明的基于信息的个性化医学药物发现系统和方法。医疗中心获得患者的样品，然后将患者样品运送到分子谱分析实验室，该实验室也可以进行RNA和DNA分离和分析。
显示保持用于本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的临床标准化词汇的方法的图示显示在图10中。图10显示医生观点和与医生的一名患者相关的患者信息如何可以被其他医生获得，以便其他医生能够利用数据对其患者进行诊断和治疗决定。
图11显示示例性微阵列基因表达数据库的示意图，它可以用作本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的一部分。微阵列基因表达数据库包括外部数据库和内部数据库，它们可以通过基于网络的系统访问。外部数据库可以包括但不限于：UniGene，GO，TIGR，GenBank，KEGG。内部数据库可包括但不限于：组织追踪、LIMS、临床数据、和患者追踪。图12显示示例性微阵列基因表达数据库的图示，它可以用作本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的一部分。实验室数据、临床数据和患者数据均可以容纳在微阵列基因表达数据库中，该数据随后可以由公共/个人形式访问，并由数据分析工具利用。
显示信息通过本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法流动的另一示意图显示在图13中。象图7一样，该示意图包括本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的临床信息管理、医学和文献信息管理和财务管理。图14是显示本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的示例性网络的示意图。患者、医务工作者、医疗中心和实验室都共享和交换大量信息，以根据各种确认的目标给患者提供建议的治疗或药物。
图15-25是计算机屏幕打印输出，与图5-14所示的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法的各个部分相关。图15和16显示计算机屏幕，其中代表病人输入医生信息和保险公司信息。图17-19显示计算机屏幕，其中可以输入信息以预订对患者样品的分析和检验。
图20是计算机屏幕，显示用患者样品检测的特定基因的微阵列分析结果。该信息和计算机屏幕类似于图3C所示的患者特征报告中详细的信息。图22是计算机屏幕，显示特定患者的多种基因的免疫组化检测结果。该信息类似于图3B所示的患者特征报告中包含的信息。
图21是计算机屏幕，显示发现特定患者、预订检验和/或结果、给患者发送报告和追踪当前病例/患者的选项。
图23是计算机屏幕，它概述了产生图3A至3D所示的患者特征报告的一些步骤。图24显示预订患者样品的免疫组化检测的计算机屏幕，图25显示为微阵列分析输入关于原发肿瘤部位的信息的计算机屏幕。本领域技术人员应当理解，任何数量和种类的计算机屏幕可以用来输入应用本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法所必要的信息，以及利用本发明的基于信息的个性化医疗药物发现系统和方法获得信息。
图26-31为表格，按照肿瘤类型显示某些基因和/或基因表达蛋白质的表达的显著性变化频率，即基因和/或基因表达蛋白质按照肿瘤类型被标记为显著过表达或欠表达的靶标的次数(也参见实施例1-3)。该表格显示特定肿瘤类型中基因和/或基因表达的蛋白质过表达或欠表达的总次数，以及是通过免疫组化分析(图26，图28)还是通过微阵列分析(图27，30)确定表达变化。该表格也确定使用免疫组化在特定肿瘤类型中发生任何基因表达蛋白质的过表达的总倍数，以及使用基因微阵列分析在特定肿瘤类型中发生任何基因的过表达或欠表达的总倍数。
因此本发明提供按照以上所述IHC和微阵列检测使用IHC检测和基因微阵列检测分析病变组织的方法和系统。患者可以处于疾病的晚期。可以确定大量肿瘤类型、病变组织类型或病变细胞中的生物标志物模式或生物标志物签名集，包括脂肪、肾上腺皮质、肾上腺、肾上腺髓质、阑尾、膀胱、血管、骨、软骨、脑、乳房、软骨、子宫颈、结肠、乙状结肠、树突细胞、骨骼肌、子宫内膜、食道、输卵管、成纤维细胞、胆囊、肾、喉、肝、肺、淋巴结、黑色素细胞、间皮衬里、肌上皮细胞、成骨细胞、卵巢、胰腺、腮腺、前列腺、唾液腺、鼻窦组织、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、胃、滑膜、关节内衬组织、肌腱、睾丸、胸腺、甲状腺、子宫和子宫体。
本发明的方法可以选择用于任何癌症的治疗，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、结肠和/或直肠的癌症、白血病、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉头、胆囊、甲状旁腺、甲状腺、肾上腺、神经组织、头颈癌、胃、支气管、肾、基底细胞癌、溃疡型和乳头型鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、veticulum细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细胞肿瘤、小细胞肺癌、胰岛细胞癌、原发性脑肿瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞肿瘤、多毛细胞肿瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、肠节细胞神经瘤、增生性角膜神经肿瘤、marfanoid肿瘤、肾母细胞瘤、精原细胞瘤、卵巢瘤、子宫肌瘤、宫颈发育不良和原位癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌、局部皮肤病变、蕈样肉芽肿、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨细胞和其他肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、polycythermia vera、腺癌、胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、恶性黑色素瘤，和表皮样癌。
也可以确定大量肿瘤类型、病变组织类型或病变细胞中的生物标志物模式或生物标志物签名集，包括附件、鼻窦、中耳和内耳、肾上腺、阑尾、造血系统、骨骼和关节、脊髓、乳腺、小脑、子宫颈、结缔组织和软组织、子宫体、食管、眼、鼻、眼球、输卵管、肝外胆管、口的其它部分、肝内胆管、肾、阑尾-结肠、喉、唇、肝、肺和支气管、淋巴结、脑、脊柱、鼻软骨、不包括视网膜、眼，nos、口咽部、其它内分泌腺体、其它女性生殖器、卵巢、胰腺、阴茎和阴囊、垂体、侧甲、胸膜、前列腺、直肠肾盂、输尿管、腹膜、唾液腺、皮肤、小肠、胃、睾九、胸腺、甲状腺、舌、未知的、膀胱、子宫，nos、阴道和阴唇、和阴户，nos。
因此，生物标志物模式或生物标志物签名集可以用来确定能够与生物标志物模式或签名集相互作用的治疗剂或治疗方案。例如，对于晚期乳腺癌，可以利用免疫组化分析确定一种或多种基因表达的蛋白质过表达。因此，可以对于晚期乳腺癌确定生物标志物模式或生物标志物签名集，并且可以确定能够与生物标志物模式或签名集相互作用的治疗剂或治疗方案。
对于晚期乳腺癌的生物标志物模式或生物标志物签名集的这些例子恰好是可从图26-31所示的表中确定的大量晚期疾病或癌症的大量生物标志物模式或生物标志物签名集的一个例子。另外，可以确定大量非疾病特异性疗法或治疗方案，用于利用如图1-2和图5-14所示的上述本发明的方法步骤治疗具有这些生物标志物模式或生物标志物签名集的患者。
生物标志物模式和/或生物标志物签名集在图26和28所示的表格中公开，图27和30所示的表格可用于大量目的，包括但不限于特定癌症/特定检测、特定癌症/疾病治疗，和用于特定癌症/疾病的新药物疗法或方案的鉴别。图26和28所示的表格和图27和30所示的表格中公开的生物标志物模式和/或生物标志物签名集也可以代表特定肿瘤类型或癌症类型的抗药性表达谱。表格中公开的生物标志物模式和/或生物标志物签名集显示于图26和28，图27和30中所示的表格代表晚期抗药谱。
生物标志物模式和/或生物标志物签名集可包含至少一种生物标志物。在另外其它实施方案中，生物标志物模式或签名集可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物。在一些实施方案中，生物标志物签名集或生物标志物模式可包含至少15、20、30、40、50，或60种生物标志物。在一些实施方案中，生物标志物签名集或生物标志物模式可包含至少70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000或50,000种生物标志物。一种或多种生物标志物的分析可以通过一种或多种方法进行。例如，2种生物标志物的分析可以使用微阵列进行。或者，一种生物标志物可以通过IHC分析，另一种通过微阵列分析。本文涉及任何这样的方法和生物标志物组合。
一种或多种生物标志物可选自但不限于：Her2/Neu、ER、PR、c-kit、EGFR、MLH1、MSH2、CD20、p53、细胞周期蛋白D1、bc12、COX-2、雄激素受体、CD52、PDGFR、AR、CD25、VEGF、HSP90、PTEN、RRM1、SPARC、存活蛋白、TOP2A、BCL2、HIF1A、AR、ESR1、PDGFRA、KIT、PDGFRB、CDW52、ZAP70、PGR、SPARC、GART、GSTP1、NFKBIA、MSH2、TXNRD1、HDAC1、PDGFC、PTEN、CD33、TYMS、RXRB、ADA、TNF、ERCC3、RAF1、VEGF、TOP1、TOP2A、BRCA2、TK1、FOLR2、TOP2B、MLH1、IL2RA、DNMT1、HSPCA、ERBR2、ERBB2、SSTR1、VHL、VDR、PTGS2、POLA、CES2、EGFR、OGFR、ASNS、NFKB2、RARA、MS4A1、DCK、DNMT3A、EREG、表皮调节素、FOLR1、GNRH1、GNRHR1、FSHB、FSHR、FSHPRH1、叶酸受体、HGF、HIG1、IL13RA1、LTB、ODC1、PPARG、PPARGC1、淋巴毒素Beta受体、Myc、拓扑异构酶II、TOPO2B、TXN、VEGFC、ACE2、ADH1C、ADH4、AGT、AREG、CA2、CDK2、小窝蛋白、NFKB1、ASNS、BDCA1、CD52、DHFR、DNMT3B、EPHA2、FLT1、HSP90AA1、KDR、LCK、MGMT、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRG、SRC、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、VEGFA或YES1。
例如，可以分析来自个体的生物样品，以确定包含生物标志物的生物标志物模式或生物标志物签名集，该生物标志物例如是HSP90、存活蛋白、RRM1、SSTRS3、DNMT3B、VEGFA、SSTR4、RRM2、SRC、RRM2B、HSP90AA1、STR2、FLT1、SSTR5、YES1、BRCA1、RRM1、DHFR、KDR、EPHA2、RXRG或LCK。在其它实施方案中，生物标志物SPARC、HSP90、TOP2A、PTEN、存活蛋白或RRM1形成生物标志物模式或生物标志物签名集的部分。在另外其它的实施方案中，生物标志物MGMT、SSTRS3、DNMT3B、VEGFA、SSTR4、RRM2、SRC、RRM2B、HSP90AA1、STR2、FLT1、SSTR5、YES1、BRCA1、RRM1、DHFR、KDR、EPHA2、RXRG、CD52或LCK包括在生物标志物模式或生物标志物签名集中。
可以确定HSP90、存活蛋白、RRM1、SSTRS3、DNMT3B、VEGFA、SSTR4、RRM2、SRC、RRM2B、HSP90AA1、STR2、FLT1、SSTR5、YES1、BRCA1、RRM1、DHFR、KDR、EPHA2、RXRG或LCK的表达水平，并用来鉴别用于个体的治疗剂。生物标志物的表达水平可以用来形成生物标志物模式或生物标志物签名集。确定表达水平可以通过分析mRNA或蛋白质的水平，如通过微阵列分析或IHC。在一些实施方案中，生物标志物的表达水平通过IHC进行，如SPARC、TOP2A或PTEN，并用来鉴别用于个体的治疗剂。IHC的结果可以用来形成生物标志物模式或生物标志物签名集。在另外其它的实施方案中，分析来自个体或受试者的生物样品的CD52表达水平，例如通过用包括但不限于微阵列分析的方法确定mRNA表达水平。CD52的表达水平可以用来鉴别用于个体的治疗剂。CD52的表达水平可以用来形成生物标志物模式或生物标志物签名集。
如本文所述，一个或多个靶标的分子谱分析可以用来确定或鉴别用于个体的治疗剂。例如，一个或多个生物标志物的表达水平可以用来确定或鉴别用于个体的治疗剂。一个或多个生物标志物，如本文公开的，那些，可以用来形成生物标志物模式或生物标志物签名集，它用来鉴别用于个体的治疗剂。在一些实施方案中，鉴别的治疗剂是个体以前未用来治疗的治疗剂。
例如，已经为特定治疗建立了参照生物标志物模式，使得具有参照生物标志物模式的个体对于该治疗剂有反应。具有不同于参照的生物标志物模式的个体变化或不同于参照，例如，生物标志物模式中基因的表达变化或不同于参照，将不施用该治疗剂。在另一实例中，表现出的生物标志物模式与参照相同或基本相同的个体建议用该治疗剂治疗。在一些实施方案中，个体以前未用该治疗剂治疗，因此已经为该个体确定了新的治疗剂。
实施例
实施例1：超过500名患者的IHC和微阵列检测
图26A-H和图27A-27H所示的表格中反映的数据涉及544名其病变组织进行IHC检测的患者(图26)和540名其病变组织进行基因微阵列检测的患者(图27)，按照上述IHC和微阵列检测。这些患者都处于疾病晚期。
数据显示大量肿瘤类型、病变组织类型或病变细胞中的生物标志物模式或生物标志物签名集，包括脂肪、肾上腺皮质、肾上腺、肾上腺髓质、阑尾、膀胱、血管、骨、软骨、脑、乳房、软骨、子宫颈、结肠、乙状结肠、树突细胞、骨骼肌、子宫内膜、食道、输卵管、成纤维细胞、胆囊、肾、喉、肝、肺、淋巴结、黑色素细胞、间皮衬里、肌上皮细胞、成骨细胞、卵巢、胰腺、腮腺、前列腺、唾液腺、鼻窦组织、骨骼肌、皮肤、小肠、平滑肌、胃、滑膜、关节内衬组织、肌腱、睾丸、胸腺、甲状腺、子宫和子宫体。
在99名晚期乳腺癌个体中，对20种基因表达的蛋白质的免疫组化分析(图26B)显示分析的基因表达的蛋白质过表达总共367次，且过表达总数的16.35％归因于HSP90过表达，然后12.53％的过表达归因于TOP2A过表达，11.17％的过表达归因于SPARC。另外，9.81％的过表达归因于雄激素受体过表达，9.54％的过表达归因于PDGFR过表达，9.26％的过表达归因于c-kit过表达。
因此，可以对于晚期乳腺癌鉴别生物标志物模式或生物标志物签名集，并且可以确定能够与生物标志物模式或签名集相互作用的治疗剂或治疗方案。
晚期乳腺癌的另一种生物标志物模式或生物标志物签名集由图27A-H代表的表中的微阵列数据显示。例如，在100名晚期乳腺癌个体中(图27B)，64种基因的基因微阵列分析显示分析的基因表现出表达变化总共1,158次，总表达变化的6.39％归因于SSTR3表达变化，然后5.79％的表达变化归因于VDR表达变化，5.35％的表达变化归因于BRCA2表达变化。因此，可以对于晚期乳腺癌鉴别生物标志物模式或生物标志物签名集，并且可以确定能够与生物标志物模式或签名集相互作用的另一种治疗剂或治疗方案。
实施例2：超过1300名患者的IHC检测
图28A至28O的表按照肿瘤类型显示某些基因表达蛋白质的表达的显著性变化频率，即基因表达的蛋白质按照肿瘤类型被标记为显著过表达的靶标的次数。该表格也使用免疫组化分析确定在特定肿瘤类型中发生任何基因表达的蛋白质的过表达的总次数。
图28A至28O所示的表格中反映的数据涉及1392名患者，其病变组织按照上述IHC检测进行IHC检测。这些患者都处于疾病晚期。
数据显示大量肿瘤类型、病变组织类型或病变细胞中的生物标志物模式或生物标志物签名集，包括附件、鼻窦、中耳和内耳、肾上腺、阑尾、造血系统、骨骼和关节、脊髓、乳腺、小脑、子宫颈、结缔组织和软组织、子宫体、食管、眼、鼻、眼球、输卵管、肝外胆管、口的其它部分、肝内胆管、肾、阑尾-结肠、喉、唇、肝、肺和支气管、淋巴结、脑、脊柱、鼻软骨、不包括视网膜、眼，nos、口咽部、其它内分泌腺体、其它女性生殖器、卵巢、胰腺、阴茎和阴囊、垂体、侧甲、胸膜、前列腺、直肠肾盂、输尿管、腹膜、唾液腺、皮肤、小肠、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、未知的、膀胱、子宫，nos、阴道和阴唇、和阴户。
在254名晚期乳腺癌个体中，对19种基因表达的蛋白质的免疫组化分析(图28C)显示分析的基因表达的蛋白质过表达总共767次，且过表达总数的13.43％归因于SPARC过表达，然后12.26％的过表达归因于c-kit过表达，11.47％的过表达归因于EGFR。另外，11.34％的过表达归因于雄激素受体过表达，11.08％的过表达归因于HSP90过表达，10.43％的过表达归因于PDGFR过表达。因此，因此，可以对于晚期乳腺癌鉴别生物标志物模式或生物标志物签名集，并且可以确定能够与生物标志物模式或签名集相互作用的治疗剂或治疗方案。
图29的表格以在检测IHC的所有组织中的频率顺序显示被标记为目标的生物标志物(基因表达的蛋白质)。19种基因表达的蛋白质的免疫组化显示在检测的各种组织中19种基因表达的蛋白质被标记为目标3878次，EGFR是过表达最频繁的基因表达的蛋白质，其次是SPARC。
实施例3：超过300患者的微阵列检测
图30A至30O的表格根据肿瘤类型显示某些基因的表达的显著性变化的频率，即，基因按肿瘤类型被标记为目标的次数，根据微阵列分析为显著过表达或欠表达的。该表格也使用基因微阵列分析确定在特定肿瘤类型中发生任何基因的过表达或欠表达的总次数。
图30A至30O所示的表格中反映的数据涉及379名患者，按照上述微阵列检测对其病变组织进行基因微阵列检测。患者均处于疾病的晚期。数据显示大量肿瘤类型、病变组织类型或病变细胞中的生物标志物模式或生物标志物签名集，包括附件、鼻窦、中耳和内耳、肾上腺、肛管和肛门、阑尾、血液、骨髓和造血系统、骨骼和关节、脑和脑神经和脊髓(不包括脑室和小脑)、乳腺、小脑、子宫颈、结缔组织和软组织、子宫体、食管、眼、鼻、眼球、输卵管、膀胱7肝外胆管、龈和口底和其它口腔部分、肝内胆管、肾、大肠(不包括阑尾-结肠)、喉、唇、肝、肺和支气管、淋巴结、脑膜(大脑、脊柱)、鼻腔(包括鼻软骨)、眼眶和泪腺(不包括视网膜、眼，nos)、口咽部、其它内分泌腺体、其它女性生殖器、卵巢、胰腺、阴茎和阴囊、垂体、侧甲、前列腺、直肠、肾盂和输尿管、腹膜后和腹膜、唾液腺、皮肤、小肠、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、未知的、未指定的消化器官、膀胱、子宫，nos、阴道和阴唇、和阴户，nos。
例如，在168名患有晚期乳腺癌个体中(图30C)，对于63种基因的微阵列分析显示所分析的基因过表达或欠表达总共1863次，并且总表达变化的5.05％归因于SSTR3表达变化，然后是4.83％的表达变化归因于NKFBIA表达变化，4.62％的表达变化归因于VDR。另外，4.35％的表达变化归因于MGMT表达变化，4.19％的表达变化归因于ADA表达变化，3.97％表达变化归因于CES2表达变化。
图31的表格以在检测的所有组织中的频率顺序显示作为靶标的生物标志物。
实施例4：利用患者肿瘤的分子谱分析为难治性癌症发现靶标和选择治 疗的初步研究
主要目的是比较使用通过分子谱分析选择的治疗方案的无进展存活期(PFS)与患者最近进行的方案的PFS(例如患者是自身对照)(图32)。对于PFS比(分子谱分析选择的治疗的PFS/原有治疗的PFS)≥1.3的个体患者，分子谱分析方法被认为是临床有益的。
也进行该研究以确定通过IHC、FISH和微阵列的分子谱分析产生目标的频率，存在针对该目标是可商购的治疗剂，并且确定反应率(RECIST)和4个月无进展或死亡的患者的百分比。
研究在整个美国的9个中心进行。所述方法的概述在图33中显示。从图33可见，为该研究筛选患者并取得知情同意。患者的合格性由两个医生监管人之一证实。相同的医生证实患者是否曾进行原有治疗以及PFS(TTP)有多长。然后如下所述进行肿瘤活检。使用IHC、FISH(对石蜡包埋的材料)和微阵列(对新鲜冷冻的组织)分析检测肿瘤。
将IHC/FISH和微阵列的结果给予两名研究医生，在给患者的经治医生建议治疗时医生通常使用以下算法：1)IHC/FISH和微阵列指示的相同靶标是第一优先级；2)单独的IHC阳性结果是下一优先级；和3)单独的微阵列阳性结果是最后优先级。
向患者的医生通知建议的治疗，用建议的药物(包装插页推荐)治疗患者。每8周评价患者的疾病状态，并通过NCI CTCAE version 3.0评价不利效应。
为了合格加入该研究，要求患者：1)提供知情同意和HIPAA认可；2)具有转移癌的组织学类型的任何历史类型；3)根据至少2种用于晚期疾病的现有方案的RECIST标准；4)能够经历活检或手术，以获得肿瘤样品；5)≥18岁，寿命生命＞3个月，和Eastern Cooperative OncologyGroup(ECOG)Performance Status为0-1；6)具有可测量的或可评价的疾病；7)用最新疗法难以治疗(记录在最后的治疗下的疾病进展；接受≥6周的最新治疗；中断最新的治疗以进展)；8)具有足够的器官和骨髓功能；9)具有足够的出生控制方法；和10)如果CNS转移则充分控制。ECOG操作量表在Oken，M.M.，Creech，R.H.，Tormey，D.C.，Horton，J.，Davis，T.E.，McFadden，E.T.，Carbone，P.P.：Toxicity和Response Criteria Of The EasternCooperative Oncology Group.Am J Clin Oncol 5：649-655，1982(通过引用并入本文)中描述。在进行分子谱分析前，患者所处地点的主要研究人员必须指定他们用什么治疗患者，如果分子谱分析结果都不可获得。
方法
所有活检都在当地研究地点进行。对于针活检，进行2-3个18号针中心活检。对于DNA微阵列(MA)分析，立即冷冻组织并经FedEx在干冰上运送至中心CLIA认证实验室，Caris MPI in Phoenix，Arizona。对于IHC，将石蜡块在冷包上运输。如果≥30％的细胞为2+，IHC被认为对于靶标是阳性的。如果肿瘤和对照器官组织之间基因表达差异为p≤0.001的显著性水平，则MA被认为对于靶标是阳性的。
I)IHC
对于IHC研究，福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤样品具有来自提交IHC检测下列蛋白质组织块的切片：EGFR，SPARC，C-kit，ER，PR，雄激素受体，PGP，RRM1，TOPO1，BRCP1，MRP1，MGMT，PDGFR，DCK，ERCC1，胸苷酸合酶，Her2/neu和TOPO2A。对于所有患者肿瘤进行所有蛋白质的IHC。
将福尔马林固定的石蜡包埋的患者组织块切开(4μm厚)，并固定在载玻片上。用一系列分级的醇脱石蜡和再水合后，按照需要进行预处理以暴露目标抗原。
Her-2和EGFR按照供应商所述染色(DAKO，Denmark)。所有其它抗体购自商业来源，并且使用DAB不含生物素的聚合物检测试剂盒显示。每种抗体使用合适的阳性对照组织。通过将第一抗体替换为适当匹配的同种型阴性对照试剂染色阴性对照玻片。所有玻片用苏木精复染作为最后一步，并盖上盖玻片。组织微阵列切片按照厂商说明通过FISH分析EGFR和HER-2/neu拷贝数。用于HER-2/neu的FISH使用PathVysion HER2 DNA Probe试剂盒(Vysis，Inc)进行。用于EGFR的FISH用LSI EGFR/CEP 7Probe(Vysis)进行。
所有玻片都由第一病理学家半定量评价，他证实原诊断并且使用光学显微镜读取每个免疫组织化学染色。必要时进行一些谱系免疫组织化学染色以证实原诊断。检查染色强度和染色程度；记录阳性的，肿瘤特异性的肿瘤细胞染色，和高度阳性(≥2+)，普遍的(≥30％)肿瘤特异性染色结果。标准10％质量控制由第二病理学家进行。
II)微阵列
获得的用于微阵列的肿瘤样品在切除30分钟内急冻，并在干冰上运送给Caris-MPI。将冷冻的肿瘤片段置于玻璃试管中0.5mL一份冷冻的0.5M异硫氰酸胍溶液上，同时融化并用聚焦声波匀浆器匀浆。加入0.5mL份的TriZol，混合，将溶液加热到65℃5分钟，然后在冰上冷却，通过加入氯仿然后离心分离相。向水相中加入等体积的70％乙醇，混合物在Qiagen Rneasy柱上层析。RNA特异性结合，然后洗脱。通过在Agilent BioAnalyzer上评价28S：18S核糖体RNA之比检测RNA的完整性。将2-5微克肿瘤RNA和2-5微克来自正常组织样品(代表肿瘤组织来源)的RNA转化为cDNA，然后在T7聚合酶扩增过程中用对比荧光素标记的(Cy3，Cy5)CTP标记。标记的肿瘤和其来源参照的组织杂交到具有17,085个独特探针的Agilent H1Av2 60 mer olio阵列芯片上。
该阵列含有用于50种基因的探针，用于基因的可能的治疗剂可能与基因相互作用(高表达或低表达)。这50种基因包括：ADA，AR，ASNA，BCL2，BRCA2，CD33，CDW52，CES2，DNMT1，EGFR，ERBB2，ERCC3，ESR1，FOLR2，GART，GSTP1，HDAC1，HIF1A，HSPCA，IL2RA，KIT，MLH1，MS4A1，MASH2，NFKB2，NFKBIA，OGFR，PDGFC，PDGFRA，PDGFRB，PGR，POLA，PTEN，PTGS2，RAF1，RARA，RXRB，SPARC，SSTR1，TK1，TNF，TOP1，TOP2A，TOP2B，TXNRD1，TYMS，VDR，VEGF，VHL和ZAP70。
芯片在60℃杂交16-18小时，然后洗涤除去非严格杂交的探针，并在Agilent微阵列扫描仪上扫描。提取荧光强度数据，标准化，并用Agilent Feature Extraction软件分析。根据对变化程度显著性的估计判断基因表达不同于其参照，这是使用考虑每个通道的信噪比水平的错误模型进行估计的，并且使用在芯片上复制的大量的阳性和阴性对照对估计值进行调节。p≤0.001水平的表达变化被认为是显著不同的。
III)统计学考虑因素
方案计划需要92名患者入组，其中估计64名患者用通过分子谱分析确定的疗法治疗。另外28名患者不可获得分子谱分析结果，因为(a)该患者不能活检；(b)通过分子谱分析未鉴定靶标；或(c)状况恶化。64名患者需要接受分子谱分析治疗，以排除零假设(Ho)：≤15％的患者的PFS比≥1.3(例如，没有希望的结果)。
IV)治疗选择
使用下列算法根据分子谱分析结果为患者选择治疗：1)IHC/FISH和微阵列表明靶标相同；2)单独的IHC阳性结果；3)单独的微阵列阳性结果。向患者的经治医生通告建议的治疗，患者根据包装插页的建议治疗。每8周评估疾病状态。通过NCI CTCAE version 3.0评价副作用。
结果
患者的分布在图34中图示，患者的特征在表4和5中显示。如图34所见，106名患者知情同意并进行评价。有20名患者由于图34所述的原因不进行分子谱分析(主要是病情恶化或者撤销知情同意或者不希望任何另外的治疗)。有18名患者未按照分子谱分析治疗(主要是由于病情恶化，或者撤销知情同意，因为不希望任何另外的治疗)。有68名患者接受治疗，其中66名按照分子谱分析结果治疗，2人未按照分子谱分析结果治疗。两人中的一人用另一种药物治疗是因为患者的医生认为治疗紧迫，另一人用另一种药物治疗是因为保险公司不涵盖分子谱分析建议的治疗。
医生可以获得的分子谱分析结果的时间中值是从活检起16天(范围为8-30天)，从接受用于分析的组织样品起中值为8天(范围为0-23天)。一些适度的延迟是由当地人员未能立即送达患者的组织块引起的(由于他们需要对标本进行病理学处理)。患者肿瘤来自美国的9个地点，包括：Greenville，SC；Tyler，TX；Beverly Hills，CA；Huntsville，AL；Indiannapolis，IN；San Antonio，TX；Scottsdale，AZ和Los Angeles，CA。
表4显示了对其肿瘤进行分子谱分析并且按照分子谱分析结果进行治疗的66名患者的特征。从表1可见，66名患者大多数为女性，年龄中值为60岁(范围27-75岁)。原有治疗方案的数目，53％的患者为2-4，38％的患者为5-13。有6名患者(9％)只有1次原有治疗，因为无法获得经批准的二线治疗剂。20名患者在原有I期治疗时进展。大多数患者的ECOG状态为1。
表4：患者特征(n＝66)
特征 n ％
性别
女 43 65
男 23 35
年龄
中值(范围) 60 (27-75)
先前治疗数
2-4* 35 53
5-13 25 38
ECOG
0 18 27
1 48 73
*备注：6患者(9％)具有1个原有治疗
如表5所见，66名患者中的肿瘤类型包括乳腺癌18(27％)、结肠直肠癌11(17％)、卵巢(8％)，32名患者(48％)处于混杂的种类。许多患者具有更罕见的癌症类型。
表5：结果-患者肿瘤类型(n＝66)
肿瘤类型 n ％
乳腺癌 18 27
结肠直肠癌 11 17
卵巢癌 5 8
混杂 32 48
前列腺 4 6
肺 3 5
罗色素瘤 2 3
小细胞(食道/腹膜后) 2 3
胆管腺癌 2 3
间皮瘤 2 3
H&N(SCC) 2 3
胰腺癌 2 3
胰的神经内分泌 1 1.5
未知(sCC) 1 1.5
胃 1 1.5
腹膜假粘液瘤 1 1.5
肛管(SCC) 1 1.5
阴道(SCC) 1 1.5
子宫颈 1 1.5
肾 1 1.5
小汗腺腺瘤 1 1.5
唾液腺腺瘤 1 1.5
软组织肉瘤(子宫) 1 1.5
GIST(胃) 1 1.5
甲状腺-未分化 1 1.5
主要终点：PFS比≥1.3
对于该研究涉及主要终点(PFS比of≥1.3)，在66名按照分子谱分析结果治疗的患者中，PFS比大于或等于1.3的患者数为66人中的18人或27％，95％CI 17-38％单侧单样本非参数检验p＝0.007。零假设为该患者群体中的≤15％的PFS比≥1.3。因此，零假设不成立，我们的结论是该分子谱分析方法是有益的。图35详细比较了18名患者的分子谱分析治疗的PFS(棒)与患者最后原有治疗的PFS(TTP)(框)。PFS比中值为2.9(范围1.3-8.15)。
如果检查如表6所示的主要终点，8/18(44％)的乳腺癌患者，4/11(36％)的结肠直肠癌患者，1/5(20％)的卵巢癌患者和5/32(16％)的杂肿瘤类型患者中达到PFS比≥1.3(注意PFS比≥1.3的杂肿瘤类型包括：肺癌1/3，胆管上皮癌1/3，间皮瘤1/2，外泌汗腺肿瘤1/1，和GIST(胃)1/1)。
表6：主要终点-PFS比≥1.3，按照肿瘤类型
肿瘤类型 治疗总数 PFS比≥1.3的数目 ％
乳腺癌 18 8 44
结肠直肠 11 4 36
卵巢 5 1 20
混杂* 32 5 16
总计 66 18 27
*肺1/3，小汗腺腺瘤1/2，间皮瘤1/2，外泌汗腺1/1，GIST(胃)1/1
18名PFS≥1.3的患者根据谱分析接受的治疗如表7所述。从该表可以看出，对于乳腺癌患者，治疗选择从已烯雌酚到nab紫杉醇+吉西他滨到多柔比星。对具有其它肿瘤类型的患者的治疗也在表7中显示。总之，14名联合治疗，4名用单药治疗。
表7：18名PFS比≥1.3(基于分子谱分析)的患者接受的治疗
肿瘤类型 患者接受的治疗
乳腺癌 已烯雌酚
乳腺癌 nab-紫杉醇+曲妥珠单抗
乳腺癌 nab-紫杉醇+吉西他滨
乳腺癌 来曲唑+卡培他滨
乳腺癌 奥沙利铂+5FU+曲妥珠单抗
乳腺癌 吉西他滨+培美曲塞
乳腺癌 多柔比星
乳腺癌 依西美坦
结肠直肠癌 伊立替康+索拉非尼
结肠直肠癌 替莫唑胺+贝伐珠单抗
结肠直肠癌 舒尼替尼+丝裂霉素
结肠直肠癌 替莫唑胺+索拉非尼
卵巢癌 拉帕替尼+他莫昔芬
NSCLC 西妥昔单抗+伊立替康
胆管上皮癌 西妥昔单抗+伊立替康
间皮瘤 吉西他滨+依托泊苷
外泌汗腺 舒尼替尼
GIST(胃) 西妥昔单抗+吉西他滨
次要终点
该研究的次要终点的结果如下。在尝试分子谱分析的86名患者中患者’肿瘤的分子谱分析产生目标的频率为84/86(98％)。通过方法分解，按照IHC/FISH83/86(97％)产生目标，按照微阵列81/86(94％)产生目标。通过在Agilent Bioanalyzer上评价28S与18S核糖体RNA之比检测RNA的完整性。83/86(97％)标本的比值为1或更高，得到高芯片内重复性。这证明了患者标本在整个美国极好的采集和运输，可获得出色的技术结果。
按照66名患者中的RECIST标准，有1个完全反应，5个部分反应，总反应率为10％(乳腺癌患者中一个完全反应，乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌和NSCL癌症患者中部分反应)。在4个月时没有进展的患者包括66中的14人或21％。
在探索分析中，对于目标病变的总直径相对于基线直径的最大％变化产生所有患者的瀑布图。具有进展的患者和在过程中有时肿瘤有一定收缩以及按照RECIST标准部分反应的患者在图36中证明。在47％的患者中患者的肿瘤有一定收缩(其中完成2个或更多的评价)。
其它分析-安全性
安全性分析，没有治疗相关的死亡。有9个治疗相关的严重不良事件，包括贫血(2名患者)、嗜中性白血球减少(2名患者)、脱水(1名患者)、胰腺炎(1名患者)、恶心(1名患者)、呕吐(1患者)和热性中性粒细胞减少(1患者)。只有一名患者(1.5％)由于2度疲劳这一治疗相关的不良事件中断。
其它分析-患者经治医生选择的与分子谱分析选择的之间的关系
也检查了医生在知道治疗建议的分子谱分析结果之前选择治疗患者的方法之间的关系。如图37所示，在两者之间没有关系。更具体地，18名PFS比≥1.3的患者没有匹配。
18名PFS比≥1.3的患者与全部66名患者相比的总存活期显示在图38中。该探索分析是为了帮助确定PFS比是否具有一定的临床相关性。18名PFS比≥1.3的患者的总存活期为9.7个月，而整个人群为5个月-log秩0.026。该探索分析表明PFS比与另一临床参数相关。
结论
这一前瞻性的多中心初步研究证明了：(a)在美国9个不同中心测量患者肿瘤中的分子靶标可靠，具有良好的质量和充分的肿瘤采集-并且根据这些结果治疗患者；(b)对于27％的患者，该分子谱分析方法使用分子谱分析建议的方案比正在进行的方案得到较长的患者(置信区间17-38％)p＝0.007；和(c)这是有希望的结果，证明分子谱分析的应用和益处。
结果也证明患有难治性癌症的患者常常具有简单的靶标(如ER)，对其治疗可以获得并且可能受益于它。对于已经用完其它治疗和也许是I期或II期试验候选人的患者的分子谱分析可能进行该分子谱分析。
实施例5：分子谱分析系统
一个系统具有几个单独的部件，包括使用Agilent 44K芯片的基因表达阵列，它能够通过对从新鲜冷冻组织提取的RNA进行RT-PCR确定大约44,000种不同序列的相对表达水平。由于获得新鲜冷冻组织涉及实用性，只有一部分样品可能运行Agilent 44K分析。除了该基因表达阵列外，该系统也对福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)癌症组织进行一组40个不同的免疫组化分析。最后，通过FISH(荧光原位杂交)确定许多基因的基因拷贝数，并通过对几个特定突变的DNA测序进行突变分析。对每个患者病例保存所有数据。超过64种已经证明影响治疗选项的基因的微阵列结果用来产生最终报告。也从IHC、FISH和DNA测序分析报告数据。该报告由肿瘤科医生解释。一旦报告数据，最终决定就取决于经治医生。
实施例6：Illumina表达分析
Illumina全基因组DASL试验(Illumina Inc.，San Diego，CA)提供了以高通量方式同时对来自最小RNA输入量的超过24,000个转录物进行谱分析的方法，它们来自新鲜冷冻的(FF)和福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织来源。该分析利用全基因组DASL试验，使用UDG(Illumina，cat#DA-903-1024/DA-903-1096)，Illumina杂交炉和IlluminaiScan系统。
全基因组DASL试验按照使用说明进行。使用生物素化的寡聚(dT)和随机九聚引物将从FF或FFPE来源分离的总RNA转化为cDNA。寡聚(dT)和随机九聚引物的使用确保降低的RNA片段(如从FFPE组织获得的)的cDNA合成。生物素化的cDNA然后与DASL Assay Pool(DAP)探针组退火。探针组含有特异性设计为查询转录物中的每个靶序列的寡核苷酸。该探针横跨大约50个碱基，允许对部分降解的RNA进行谱分析。
该试验探针组由上游寡核苷酸和下游寡核苷酸组成，该上游寡核苷酸在5’末端含有基因特异性序列和通用PCR引物序列(P1)，该下游寡核苷酸在3’末端含有基因特异性序列和通用PCR引物序列(P2)。上游寡核苷酸与靶cDNA位点杂交，然后延伸并连接至其相应的下游寡核苷酸，以产生PCR模板，该模板能够使用通用PCR引物按照使用说明扩增。
得到的PCR产物与HumanRef-8Expression BeadChip杂交，以确定特定基因的存在或不存在。HumanRef-8BeadChip迄今为止的特征是覆盖＞24,000种来自National Center for Biotechnology InformationReference Sequnce(RefSeq)数据库(Build 36.2，Release 22)的注释转录物的含量(表8)。
表8.HumanRef-8BeadChip的RefSeq＊含量
探针 说明 数目
NM 编码转录物，确定的注释 23,811
XM 编码转录物，临时注释 426
NR 非编码转录物，确定的注释 263
XR 非编码转录物，临时注释 26
总计 24,526
*Build 36.2，Release 22
杂交后，使用iScan系统扫描HumanRef-8Expression BeadChips。该系统结合有高性能激光器和用于快速定量扫描的检测系统。该系统具有高信噪比、高灵敏度、低检测限和宽动态范围，导致优异的数据质量。
使用DASL化学微阵列的全基因组基因表达分析允许估计特定基因在肿瘤中是否比衍生肿瘤的细胞型更多或更少地产生mRNA。基于给定基因的更高或更低的活性，可以提高肿瘤对特定治疗的反应的可能性，这取决于所治疗的癌症类型。患者肿瘤与正常组织相比的差异基因表达可以提供有用的诊断工具，用于帮助肿瘤学家确定合适的治疗途径。
DASL化学法由于不同于传统直接杂交微阵列方法而解决了使用降解的FFPE RNA的限制。但是，FFPE组织的固定方法存在很大的可变性，这可导致较高水平的RNA降解。DASL试验可用于部分降解的RNA，而不能用于完全降解的RNA。为了使RNA样品在DASL试验分析之前合格，使用实时qPCR方法检查RNA质量，在该方法中使用SYBR绿化学法扩增高度表达的核糖体蛋白质基因RPL13a。如果样品的循环阈值≤29，则该样品被认为足够完整，能够进行DASL化学法。参见Biotinylated cDNA Pre-Qualification，Illumina，Inc.；Abramovitz，M.，等人，Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expressionprofiling in the DASL assay.Biotechniques，2008.44(3)：p.417-23。A260/A280比＜1.5或RPL13a Ct值＞30的任何样品被认为过度降解或严重修饰而不能使用全基因组DASL基因表达化学法处理。Abramovitz，M.，等人。
在HumanRef-8表达BeadChip上杂交之前，沉淀样品。样品沉淀物将是蓝色沉淀块的形式。如果该样品的蓝色沉淀块不可见，则该样品在BeadChip上杂交之前必须重新处理。
尽管全基因组DASL试验检查上千种基因的表达，但只需要分析感兴趣的基因的表达。
为使用Illumina全基因组DASL技术标准化患者数据的报告，使用以下算法。该数据使用Genome Studios Software v2009.1(GeneExpression Module version 1.1.1)获得。
步骤1：用Genome Studios软件确定的检测p-值必须小于0.01。该值的确定是通过检查用于特定基因的同一探针的重复拷贝产生的信号的变异性，以及在阵列上存在的阴性对照探针中观察到的变异性。如果对于特定基因，对照或患者样品的检测p-值大于0.01，则该基因的表达被报告为“不确定”。选择截断值为0.01，因为它表示在表达没有变化的零假设为真时观察到该数据的几率小于1％。p-值可以对多重比较进行校正。
步骤2：差异表达的p-值必须小于0.001。该p-值是使用以下方程式确定的：1/(10^(D/(10*SIGN(PS-CS))))。在该方程式中，“D”代表由Genome Studios产生的差异表达评分。“PS”和“CS”代表分别对于患者样品(PS)和对照样品(CS)，在特定基因阵列上获得的相对荧光单位(RFU)。“SIGN”函数将通过由PS RFU减去CS RFU产生的值指标转化为数值。如果PS减CS＞0，则产生的值为1。如果PS减CS＜0，则产生的值为-1。如果PS等于CS，则产生的值为0。如果对于任何特定基因，差异表达p-值大于.001，则该基因的表达被报告为“没有变化”。选择截断值0.001是因为通过该阈值的基因可以被确认为在大约95％的时间是通过交替方法差异表达的。
步骤3：如果特定基因的表达比小于0.66，该基因的表达将被报告为“欠表达”。如果表达比大于1.5，该基因的表达将被报告为“过表达”。如果表达比介于0.66和1.5之间，特定基因的表达将被报告为“没有变化”。表达比的确定是通过将来自患者样品的基因的RFU除以来自对照样品的同一基因的RFU(PS/CS)。“没有变化”表示在p＜＝0.001的显著性水平上，肿瘤和对照组织之间该基因的表达没有差异。选择p＜＝0.001的显著性水平是因为通过该阈值的基因可以被确认为在大约95％的时间是通过交替方法差异表达的。
“无信息(NI)”表示患者样品或对照样品获得的数据的质量不够高，不足以根据特定RNA转录物的表达水平可靠地进行调用。
步骤4：在只使用FFPE样品的一些情况中，使用上述算法确定为“欠表达的”所有基因都被报告为“不确定的”。这是因为从FFPE样品获得的RNA的降解性质，因此，可能无法确定患者样品中的基因相对于对照样品降低的RFU是否是由于特定RNA的存在减少，或者是否RNA高度降解并且妨碍了特定RNA转录物的检测。使用改进的技术，FFPE样品的一些或全部基因被报告为“欠表达的”。
图39显示从FFPE样品的微阵列谱分析获得的结果。从肿瘤组织提取总RNA，并转化为cDNA。然后使用Illumina cDNA-介导的退火、选择、延伸和连接(DASL)方法对cDNA样品进行全基因组(24K)微阵列分析。然后将80个基因的亚组的表达与组织特异性正常对照进行比较，确定图中所示的这80个靶基因的相对表达比以及不同表达的统计显著性。
实施例7：分子谱分析系统和报道
系统具有几个单独的部件，包括如实施例6所述的使用Illumina全基因组DASL Assay的基因表达阵列。除了该基因表达阵列外，该系统也对福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)癌症组织进行一亚组的免疫组化试验。最后，通过FISH(荧光原位杂交)确定许多基因的基因拷贝数，并通过对几个特定突变的DNA测序进行突变分析。对于每个患者病例存储所有此数据。从微阵列、IHC、FISH和DNA测序分析报道数据。所有实验室实验按照标准操作规程(SOPs)进行。
用于突变分析的DNA在根据病理学家确定％肿瘤细胞核≥10％的区域中固定切片分离(macrodissection)后从福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织提取。如果％肿瘤细胞核≥10％，则提取的DNA仅用于突变分析。使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒按照使用说明(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)提取DNA。使用BRAF Mutector I BRAF试剂盒(TrimGen，cat#MH1001-04)检测BRAF突变(TrimGen Corporation，Sparks，MD)。使用DxS KRAS突变检测试剂盒(DxS，#KR-03)检测KRAS突变(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)。使用Applied Biosystem’sTerminator V 1.1化学法(Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA)进行扩增的DNA的BRAF和KRAS测序。
IHC根据标准方案进行。IHC检测系统根据标志物而不同，包括Dako’s Autostainer Plus(Dako North America，Inc.，Carpinteria，CA)、Ventana Medical SystemsXT(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)和Leica/Vision Biosystems Bond System(Leica MicrosystemsInc.，Bannockbum，IL)。所有系统都按照使用说明进行操作。
对福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)组织进行FISH。用于FISH的FFPE组织玻片必须是苏木精和曙红(H&E)染色的，并且送至病理学家进行评价。病理学家将标出将要进行FISH的肿瘤区域用于分析。病理学家报道必然显示存在肿瘤和足以进行完全分析。使用Abbott Molecular VP2000按照使用说明(Abbott Laboratories，Des Plaines，IA)进行FISH。
该系统产生的报告显示于图40A-40J中。图40A显示患者在卵巢中具有原发性肿瘤。使用石蜡块样品。图40A-40B显示通过微阵列或IHC分析确定为差异表达的生物标志物的概括列表。示出了对应于每种差异表达的生物标志物的治疗选项。患者的医生能够决定使用哪种候选治疗。图40C是将候选治疗与生物标志物相关联的文献证据列表。图40D显示IHC分析的结果，图40E显示微阵列分析的结果。图40F-40G显示差异表达的生物标志物的概述。图40H-40I显示支持与差异表达的生物标志物相关联的候选治疗的文献的概述，对附到每个出版物的证据水平进行分级。图40C的表格解释了证据水平的编码。
尽管本文已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员应当明白这些实施方案只是作为例子提供的。本领域技术人员将会想到大量变化、改变和替代而不偏离本发明。应当理解，本文所述本发明实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。下列权利要求旨在定义本发明的范围，因此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构和它们的等同方案。

Claims (36)

1.试剂在制备为需要的受试者的癌症确定候选治疗的组合物中的用途，包括：
(a)对该样品进行DNA测序以确定至少下组基因的测序突变谱：KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR；和
(b)相对于规则数据库比较测序突变谱，其中该规则数据库包含其对癌细胞的生物活性已知的治疗的图谱，该癌细胞：
在所述测序突变谱中所包括的一种或多种基因中具有0个或更多个突变；和
(c)如果满足以下条件，则确定所述候选治疗：
i.比较表明该治疗应当对该癌症具有生物活性；和
ii.比较没有表明该治疗不能用于治疗该癌症。
2.权利要求1的用途，其中所述样品包括福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织、新鲜冷冻(FF)组织，或保存核酸或蛋白质分子的溶液中包含的组织。
3.权利要求1的用途，其中所述样品通过质量控制测试。
4.权利要求3的用途，其中所述质量控制测试包括A260/A280比或RPL13a mRNA的RT-PCR的Ct值。
5.权利要求4的用途，其中所述质量控制测试包括A260/A280比＜1.5或RPL13a Ct值＞30。
6.权利要求1的用途，其中所述测序突变谱分析进一步包括测定PI3K。
7.权利要求1的用途，其中所述用于测序突变谱分析的基因还包括以下一种或多种：ABCC1、ABCG2、ACE2、ADA、ADH1C、ADH4、AGT、雄激素受体、AR、AREG、ASNS、BCL2、BCRP、BDCA1、BIRC5、B-RAF、BRCA1、BRCA2、CA2、小窝蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDK2、CDW52、CES2、CK14、CK17、CK5/6、c-KIT、c-Myc、COX-2、细胞周期蛋白D1、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、E-钙粘着蛋白、ECGF1、EGFR、EPHA2、表皮调节素、ER、ERBR2、ERCC1、ERCC3、EREG、ESR1、FLT1、叶酸受体、FOLR1、FOLR2、FSHB、FSHPRH1、FSHR、FYN、GART、GNRH1、GNRHR1、GSTP1、HCK、HDAC1、Her2/Neu、HGF、HIF1A、HIG1、HSP90、HSP90AA1、HSPCA、IL13RA1、IL2RA、KDR、KIT、K-RAS、LCK、LTB、淋巴毒素β受体、LYN、MGMT、MLH1、MRP1、MS4A1、MSH2、Myc、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、ODC1、OGFR、p53、p95、PARP-1、PDGFC、PDGFR、PDGFRA、PDGFRB、PGP、PGR、PI3K、POLA、POLA1、PPARG、PPARGC1、PR、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SPARC MC、SPARC PC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活蛋白、TK1、TLE3、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TOPO1、TOPO2B、拓扑异构酶II、TS、TXN、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VEGFA、VEGFC、VHL、YES1和ZAP70。
8.权利要求1的用途，其中所述规则数据库包括表1和/或表2中列出的规则。
9.权利要求1的用途，其中所述规则数据库内包含的规则基于各种治疗的有效性，特别是对于靶基因或基因产物的有效性。
10.权利要求1的用途，其中所述治疗包括施用一种或多种候选治疗剂。
11.权利要求10的用途，其中所述一种或多种候选治疗剂包括5-氟尿嘧啶、阿巴瑞克、阿仑珠单抗、氨鲁米特、阿那曲唑、天冬酰胺酶、阿司匹林、ATRA、阿扎胞苷、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、硼替佐米、骨化三醇、卡培他滨、卡铂、塞来考昔、西妥昔单抗、化学内分泌治疗、胆骨化醇、顺铂、卡铂、环磷酰胺、环磷酰胺/长春新碱、阿糖胞苷、达沙替尼、地西他滨、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依西美坦、氟他胺、氟维司群、吉非替尼、吉非替尼+曲妥珠单抗、吉西他滨、戈那瑞林、戈舍瑞林、羟基脲、伊马替尼、伊立替康、伊沙匹隆、拉帕替尼、来曲唑、亮丙瑞林、脂质体多柔比星、甲羟孕酮、甲地孕酮、氨甲喋呤、丝裂霉素、nab-紫杉醇、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕尼单抗、培门冬酶、培美曲塞、喷司他丁、索拉非尼、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、托泊替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、VBMCP/环磷酰胺、长春新碱，或其任意组合。
12.权利要求10的用途，其中所述一种或多种候选治疗剂包括芳香酶抑制剂。
13.权利要求10的用途，其中所述一种或多种候选治疗剂包括氟嘧啶。
14.权利要求10的用途，其中所述所述一种或多种候选治疗剂包括5FU、贝伐珠单抗、卡培他滨、西妥昔单抗、西妥昔单抗+吉西他滨、西妥昔单抗+伊立替康、环磷酰胺、己烯雌酚、多柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依西美坦、吉西他滨、吉西他滨+依托泊苷、吉西他滨+培美曲塞、伊立替康、伊立替康+索拉非尼、拉帕替尼、拉帕替尼+他莫昔芬、来曲唑、来曲唑+卡培他滨、丝裂霉素、nab-紫杉醇、nab-紫杉醇+吉西他滨、nab-紫杉醇+曲妥珠单抗、奥沙利铂、奥沙利铂+5FU+曲妥珠单抗、帕尼单抗、培美曲塞、索拉非尼、舒尼替尼、舒尼替尼+丝裂霉素、他莫昔芬、替莫唑胺、替莫唑胺+贝伐珠单抗、替莫唑胺+索拉非尼、曲妥珠单抗、长春新碱，或其任意组合。
15.权利要求1的用途，其中所述样品包含癌细胞。
16.权利要求1的用途，其中所述患者以前已经用一种或多种治疗癌症的治疗剂治疗。
17.权利要求1的用途，其中所述患者以前未用一种或多种确定的候选治疗剂治疗。
18.权利要求1的用途，其中所述癌症包括转移癌。
19.权利要求1的用途，其中所述癌症用原有治疗难以治疗。
20.权利要求19的用途，其中所述原有治疗包括癌症的标准治疗。
21.权利要求1的用途，其中所述癌症包括前列腺癌、肺癌、黑素瘤、小细胞食道/腹膜后癌、胆管上皮癌、间皮瘤、头颈癌、胰腺癌、胃癌、腹膜假黏液瘤、肛管癌、阴道癌、宫颈癌、肾癌、小汗腺腺瘤、唾液腺腺瘤、子宫软组织肉瘤、GIST或甲状腺退行发育性癌。
22.权利要求1的用途，其中所述癌症包括以下器官的癌症：中耳、内耳、阑尾、骨骼、关节、脊髓、乳腺、结缔组织、食管、鼻、肝外胆管、口、肝内胆管、肾、阑尾-结肠、喉、肝、肺、支气管、淋巴结、脑、脊柱、眼、口咽部、内分泌腺体、女性生殖器、阴茎、阴囊、胸膜、直肠、肾盂、输尿管、腹膜、唾液腺、皮肤、小肠、胃、睾丸、舌、或膀胱的癌症。
23.权利要求1的用途，其中所述癌症包括软组织癌。
24.权利要求1的用途，其中所述癌症包括胰腺神经内分泌癌、鼻窦癌、唇癌、鼻软骨癌、视网膜癌、造血系统癌、肾盂癌或附件癌。
25.权利要求1的用途，其中所述癌症包括以下器官的癌症：肾上腺、小脑、子宫颈、子宫体、眼球、输卵管、卵巢、胰腺、垂体、前列腺、胸腺、甲状腺、阴道、阴唇或阴户的癌症。
26.权利要求1的用途，其中所述样品包含选自下组的细胞：脂肪、肾上腺皮质、肾上腺髓质、阑尾、膀胱、血液、血管、骨、软骨、脑、乳房、结肠、树突细胞、骨骼肌、食道、输卵管、成纤维细胞、胆囊、肾、喉、肝、肺、淋巴结、黑色素细胞、间皮衬里、肌上皮细胞、卵巢、胰腺、腮腺、前列腺、唾液腺、鼻窦组织、皮肤、小肠、平滑肌、胃、滑膜、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。
27.权利要求1的用途，其中所述样品包含成骨细胞、来自关节内衬组织的细胞、来自肌腱的细胞和来自子宫内膜的细胞。
28.权利要求1的用途，其中所述样品包含选自下组的细胞：子宫颈、乙状结肠和子宫体。
29.权利要求1的用途，其中所述癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、肺癌、胆管上皮癌、间皮瘤、汗腺癌、或GIST癌。
30.权利要求1的用途，其中所述癌症包括非小细胞肺癌。
31.权利要求1的用途，其中所述患者的无进展存活期(PFS)或无病存活期(DFS)延长。
32.权利要求31的用途，其中与现有治疗相比，PFS或DFS延长至少30％。
33.权利要求1的用途，其中通过候选治疗的选择延长所述患者的寿命。
34.权利要求33的用途，其中所述患者的寿命延长至少4周。
35.权利要求1的用途，其中所述DNA测序使用聚合酶链反应(PCR)、焦磷酸测序、实时PCR、Sanger测序、NextGen测序、甲基化特异性PCR(MSPCR)、限制片段长度多态性(RFLP分析)、单核苷酸多态性(SNP)微阵列、原位杂交(ISH)和荧光原位杂交(FISH)中的至少一种进行。
36.权利要求1的用途，其中进行所述DNA测序来鉴定点突变、多态性、缺失、插入、取代、易位、融合、断裂、复制、扩增和重复中的至少一个。
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