CN108676891A - 一种直肠腺癌易感性预测试剂盒及系统 - Google Patents

一种直肠腺癌易感性预测试剂盒及系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种直肠腺癌易感性预测试剂盒，其包括以下组分：STR‑1引物、STR‑2引物、STR‑3引物、STR‑4引物、STR‑5引物、STR‑6引物；进一步地，其还可包括：PCR扩增反应液、LIZ‑500分子量内标、去离子甲酰胺。本发明所述直肠腺癌易感性预测试剂盒可以用于直肠腺癌的诊断及易感性预测。本发明还提供了一种直肠腺癌易感性预测系统。

Description

一种直肠腺癌易感性预测试剂盒及系统
技术领域
本发明涉及生物医学领域。具体而言，涉及直肠腺癌易感性预测试剂盒及直肠腺癌易感性预测系统。更具体地，本发明涉及一种通过短串联重复序列(Short tandemrepeats，简称STR)位点片段分析方法检测直肠腺癌易感性相关基因的STR的试剂盒，并通过结合判别分析统计方法，以此对受检对象的直肠腺癌易感性进行早期预警。
背景技术
肿瘤是一种与遗传基因密切相关的疾病，研究肿瘤的分子遗传学基础，进而提出肿瘤特异性遗传学标志物，是希望它能给平常检测、临床诊断、个性化针对治疗、愈后病情追踪等方面提供简便可行的方法。但病人个体的差异性、不同发展阶段相关生物分子事件发生的交叉性等，都给这项工作带来极大的困难。
直肠腺癌属于直肠癌的一种，是指齿状线以上至乙状直肠与直肠移行部之间的腺癌，占结直肠癌的75％～85％，是消化道常见的恶性肿瘤。我国直肠癌的发病率占大肠癌总发病率的60％～70％，但是病因至今仍不甚清楚。我国直肠腺癌位置较低，直肠指检易触及。对于早期癌，可以行根治性手术切除。对其受检人群的直肠腺癌易感性进行预测，有利于提高患病风险意识，预测结果显示直肠腺癌患病几率较大的人群，可以通过控制饮食等方式降低发病几率或及早发现及早治疗。
大量的研究表明，肿瘤相关基因的遗传多态性在恶性肿瘤的发生发展过程中起到关键作用。但是，肿瘤的发生发展是一个十分复杂的过程，运用单个分子遗传学标志物的变化来诊断该病显然是不可能而且不科学的。以现有的技术手段，仅通过遗传信息尚无法对于肿瘤易感性进行较为准确的早期预警，目前针对肿瘤的早期鉴别与预测方法还有待改进。本发明涉及通过STR位点片段分析法联合检测多个与直肠腺癌的发生具有高关联性的STR位点，结合判别分析统计方法，对直肠腺癌易感性进行早期预警的试剂盒。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明涉及通过STR位点片段分析法联合检测多个与直肠腺癌的发生具有高关联性的STR位点，结合判别分析统计方法，对直肠腺癌易感性进行早期预警。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：发明人通过对直肠腺癌受检对象以及健康对照受检对象基因组DNA的STR进行分析，并在大量直肠腺癌样本以及对照样本进行验证，发现每个独立的STR位点短串联序列重复次数与受检对象罹患直肠腺癌无显著相关性，而某些特定的STR位点短串联序列重复次数的组合与受检对象罹患直肠腺癌有着密切的关系。
为此，本发明提出了一组分离的STR位点，这些位点与罹患直肠腺癌具有高关联性。根据本发明的实施例，这些分离的STR位点包含STR-1～STR-6所示的核苷酸序列(表1)。借助这些分离的STR位点作为参照，能够有效地预测直肠腺癌的易感性。
表1
位点代号 起始位置 所属基因 短串联序列
STR-1 X染色体，第66657655位 AR CAG
STR-2 4号染色体，第55633758位 Bat-25 T
STR-3 5号染色体，第111646983位 D5S346 GT
STR-4 6号染色体，第151806531位 ER1 TA
STR-5 14号染色体，第64253561位 ER2 TG
STR-6 4号染色体，第154587748位 FGA AAAG
关于上述STR位点的详细描述，本领域技术人员可以登陆相关数据库(如GeneBank、Nucleotide等)获得，在此不再赘述。发明人惊奇地发现，通过将受检对象的细胞基因组进行分析获得上述每个STR位点的短串联序列重复次数，以重复次数作为自变量进行判别分析等统计学分析方法，可以对直肠腺癌易感性进行早期预警。
在此基础上，本发明所解决的技术问题之一为提供了一种直肠腺癌易感性预测试剂盒，其包括以下组分：STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物，上述引物分别用于扩增包含表1所列的短串联序列的目的片段，以确定短串联序列的重复次数。
优选地，本发明的直肠腺癌易感性预测试剂盒进一步包括：PCR扩增反应液、LIZ-500分子量内标、去离子甲酰胺。
本发明的直肠腺癌易感性预测试剂盒中，优选地，上述STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物的序列如下表2所示，更优选地，上述各引物的浓度均为10μM：
表2
表2中，HEX、FAM、ROX均为对5'端进行标记的荧光基团，HEX为六氯-6-甲基荧光素，FAM为6-羧基荧光素，ROX为ROX参比染料。
本发明的直肠腺癌易感性预测试剂盒中，优选地，所述PCR扩增反应液为以下试剂的混合液：TaqDNA聚合酶(5U/μL)、Tris-HCl(100mM，在25℃时pH 8.8)、KCl(500mM)、乙基苯基聚乙二醇(0.8％(v/v))、MgCl2(25mM)、dNTP(10mM)、去离子水。
更优选地，所述PCR扩增反应液于-20℃保存。
本发明的直肠腺癌易感性预测试剂盒中，优选地，所述LIZ-500分子量内标可于-20℃保存；
本发明的直肠腺癌易感性预测试剂盒中，优选地，所述去离子甲酰胺可于2-8℃保存。
优选地，本发明的直肠腺癌易感性预测试剂盒还包括使用说明书。
所述使用说明书记载了上述一种直肠腺癌易感性预测试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)PCR反应
(2-1)从冰箱中取出STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物、PCR扩增反应液，平衡至室温，各组分充分溶解后，分别快速离心10秒；
(2-2)取30-300ng样本DNA，加入PCR扩增反应液60μL，加入去离子水补充至115.2μL，充分混匀，快速离心10秒，然后将混合液按照19.6μL/孔分装至6个PCR反应管中；
(2-3)将STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物按照0.8μL/孔分别加入到步骤(2-2)的6个PCR反应管中；盖好PCR反应管盖，记录样本加样情况，快速离心10秒，然后将PCR反应管转移至PCR扩增仪样本槽相应位置，并记录放置顺序，开始PCR扩增反应；扩增反应条件为：95℃3分钟；95℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，10个循环；95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，20个循环；72℃6分钟，得到6组PCR扩增产物；
(3)STR片段分析
(3-1)取990μL去离子甲酰胺，加入10μL的LIZ-500分子量内标，充分混匀，快速离心10秒，按照10μL/孔分别加入到测序反应管中，快速离心10秒；
(3-2)将上述6组PCR扩增产物按照1μL/孔分别加入到6个测序反应管中，快速离心10秒；然后将测序反应管转移至PCR扩增仪样本槽相应位置，98℃加热5分钟，程序结束后立即将测序反应管置于冰水混合物上急速冷却至0℃，快速离心10秒；然后将测序反应管转移至STR位点片段分析仪样本槽相应位置，并记录放置顺序，进行片段分析检测；
(4)结果分析与判定
(4-1)根据片段分析结果，分别记录STR-1、STR-2、STR-3、STR-4、STR-5、STR-6各位点两个等位基因的片段长度：
STR-1两个等位基因中较小的片段长度值记为L1，STR-1两个等位基因中较大的片段长度值记为L2；
STR-2两个等位基因中较小的片段长度值记为L3，STR-2两个等位基因中较大的片段长度值记为L4；
STR-3两个等位基因中较小的片段长度值记为L5，STR-3两个等位基因中较大的片段长度值记为L6；
STR-4两个等位基因中较小的片段长度值记为L7，STR-4两个等位基因中较大的片段长度值记为L8；
STR-5两个等位基因中较小的片段长度值记为L9，STR-5两个等位基因中较大的片段长度值记为L10；
STR-6两个等位基因中较小的片段长度值记为L11，STR-6两个等位基因中较大的片段长度值记为L12；
(4-2)短串联序列的重复次数根据片段长度和如下公式计算得到，记作X1-X12，其中round代表四舍五入取整数：
X1＝round[(L1-191)/3]；X2＝round[(L2-191)/3]；
X3＝round(L3-379)；X4＝round(L4-379)；
X5＝round[(L5-202)/2]；X6＝round[(L6-202)/2]；
X7＝round[(L7-359)/2]；X8＝round[(L8-359)/2]；
X9＝round[(L9-278)/2]；X10＝round[(L10-278)/2]；
X11＝round[(L11-200)/4]；X12＝round[(L12-200)/4]；
(4-3)将上述短串联序列重复次数代入预先设置的判别函数：
FRC＝9.246X1+5.351X2+12.883X3+122.038X4+3.427X5-1.866X6-5.381X7+9.156X8+0.257X9-3.594X10-5.776X11+7.884X12-34.457X13-1870.873
FRN＝8.819X1+5.558X2+13.339X3+124.245X4+3.689X5-2.671X6-4.640X7+8.627X8+0.196X9-3.697X10-6.440X11+7.732X12-35.925X13-1904.903
其中，若受检对象为女性，则X13＝0，若受检对象为男性，则X13＝1；
(4-4)直肠腺癌易感性预测：
比较FRC值和FRN值，若FRC>FRN，则预测受检对象罹患直肠腺癌的几率≥90.2％；若FRC≤FRN，则预测受检对象不罹患直肠腺癌的几率≥88.9％。
本发明中，
优选地，步骤(1)所述提取样本DNA可以使用购买的商用基因组DNA提取试剂盒并按照试剂盒说明书进行操作。所述样本可以为受检对象的全血。
优选地，使用方法中的所有离心的转速优选为3000g/min。
本发明中所述罹患直肠腺癌的几率，为已经罹患直肠腺癌几率，以及未来罹患直肠腺癌的几率的加和。因此既可以用于直肠腺癌的诊断；也可以用于未来罹患直肠腺癌的风险预警，可以协助受检对象进行风险防范，通过药物调理、改变生活作息、饮食规律、定期体检等方式，降低直肠腺癌的患病几率。
本发明所解决的技术问题之二是提供一种直肠腺癌易感性预测方法，即使用上述试剂盒，按照说明书所述方法进行操作。
本发明所解决的技术问题之三是提供了所述直肠腺癌易感性预测试剂盒在制备直肠腺癌诊断产品中的应用。
本发明所解决的技术问题之四是提供了一种直肠腺癌易感性预测系统，其包括：
获得样本DNA的STR位点短串联序列的重复次数的装置；
数据处理和判定装置，其包括以下模块：
数据输入模块，用于输入受检对象年龄、性别、STR位点短串联序列重复次数；
数据库管理模块，用于数据的存储、修改、删除、查询、打印的操作管理；
数据计算模块，用于根据数据输入模块中的STR位点短串联序列重复次数计算判别函数结果；
分析判别及结果输出模块，用于将判别函数结果进行比较，从而做出直肠腺癌易感性预测，并将结果输出。
其中，
所述STR位点短串联序列重复次数为如下6对STR位点短串联序列的重复次数：
位点代号 起始位置 所属基因 短串联序列
STR-1 X染色体，第66657655位 AR CAG
STR-2 4号染色体，第55633758位 Bat-25 T
STR-3 5号染色体，第111646983位 D5S346 GT
STR-4 6号染色体，第151806531位 ER1 TA
STR-5 14号染色体，第64253561位 ER2 TG
STR-6 4号染色体，第154587748位 FGA AAAG
所述判别函数包括：
第一判别函数FRC＝9.246X1+5.351X2+12.883X3+122.038X4+3.427X5-1.866X6-5.381X7+9.156X8+0.257X9-3.594X10-5.776X11+7.884X12-34.457X13-1870.873
第二判别函数FRN＝8.819X1+5.558X2+13.339X3+124.245X4+3.689X5-2.671X6-4.640X7+8.627X8+0.196X9-3.697X10-6.440X11+7.732X12-35.925X13-1904.903
所述判别函数中，
X1为STR-1两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X2为STR-1两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X3为STR-2两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X4为STR-2两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X5为STR-3两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X6为STR-3两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X7为STR-4两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X8为STR-4两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X9为STR-5两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X10为STR-5两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X11为STR-6两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X12为STR-6两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
若受检对象为女性，则X13＝0，若受检对象为男性，则X13＝1。
其中，X1 -X12根据片段长度和如下公式计算得到，其中round代表四舍五入取整数：
X1＝round[(L1-191)/3]；X2＝round[(L2-191)/3]；
X3＝round(L3-379)；X4＝round(L4-379)；
X5＝round[(L5-202)/2]；X6＝round[(L6-202)/2]；
X7＝round[(L7-359)/2]；X8＝round[(L8-359)/2]；
X9＝round[(L9-278)/2]；X10＝round[(L10-278)/2]；
X11＝round[(L11-200)/4]；X12＝round[(L12-200)/4]；
X1 -X12中，L1是STR-1两个等位基因中较小的片段长度值，L2是STR-1两个等位基因中较大的片段长度值；
L3是STR-2两个等位基因中较小的片段长度值，L4是STR-2两个等位基因中较大的片段长度值；
L5是STR-3两个等位基因中较小的片段长度值，L6是STR-3两个等位基因中较大的片段长度值；
L7是STR-4两个等位基因中较小的片段长度值，L8是STR-4两个等位基因中较大的片段长度值；
L9是STR-5两个等位基因中较小的片段长度值，L10是STR-5两个等位基因中较大的片段长度值；
L11是STR-6两个等位基因中较小的片段长度值，L12是STR-6两个等位基因中较大的片段长度值；
所述分析判别及结果输出模块，将第一判别函数FRC的计算结果和第二判别函数FRN的计算结果进行比较，若FRC>FRN，则输出“受检对象罹患直肠腺癌的几率≥90.2％”的预测结果；若FRC≤FRN，则输出“受检对象不罹患直肠腺癌的几率≥88.9％”的预测结果。
所述获得样本DNA的STR位点短串联序列的重复次数的装置，可以包括STR位点片段分析仪、PCR扩增仪等；所述数据处理和判定装置，可以为计算机等设备。
本发明所解决技术问题之五是提供了所述直肠腺癌易感性预测系统在制备直肠腺癌预测产品、直肠腺癌诊断产品、肠道健康辅助产品中的应用。
本发明所解决的技术问题之六是提供了一种直肠腺癌预测产品、一种直肠腺癌诊断产品、或一种肠道健康辅助产品，其包括所述直肠腺癌易感性预测系统。
本发明所使用的检材为人类的基因组DNA，理论上讲，人的基因组DNA在人的一生中不会发生改变。人类基因组DNA编码人类一切生命活动，因此理论上讲，通过检测基因组DNA，可以早期预测受检对象罹患某种疾病的风险，甚至出生时即可预测，本发明即是基于这一理论，因此使用本发明所述试剂盒及系统，既可以起到预警的作用，也可以起到诊断的作用。
肿瘤的发生发展是一个十分复杂的过程。研究肿瘤的分子遗传学基础，是希望它能给平常检测、临床诊断、个性化针对治疗、愈后病情追踪等方面提供简便可行的方法。但病人个体的差异性、不同发展阶段相关生物分子事件发生的交叉性等，都给这项工作带来极大的困难。运用单个分子遗传学的变化来诊断肿瘤显然是不可能而且不科学的。发明人应用现代分子生物学技术对受检对象基因组DNA的多个STR进行联合分析，并结合判别分析等统计学分析方法，从而发明一种对直肠腺癌易感性进行早期预警的试剂盒。
附图说明
图1为本发明所述直肠腺癌易感性预测系统中数据处理和判定装置所含模块示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式进行描述，以便更好地理解本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例中的PCR扩增仪为Mastercycler nexus扩增仪(购自美国eppendorf公司)；
实施例中的STR位点片段分析仪为3730XL测序列分析仪(购自美国ABI公司)；
实施例中的DNA提取试剂盒为血液DNAout试剂盒(购自北京天恩泽公司)；
实施例中的所有离心的转速均为3000g/min。
实施例1一种直肠腺癌易感性预测系统
一种直肠腺癌易感性预测系统，其包括：
获得样本DNA的STR位点短串联序列的重复次数的装置；
数据处理和判定装置，其包括以下模块(如图1)：
数据输入模块，用于输入受检对象年龄、性别、STR位点短串联序列重复次数；
数据库管理模块，用于数据的存储、修改、删除、查询、打印的操作管理；
数据计算模块，用于根据数据输入模块中的STR位点短串联序列重复次数计算判别函数结果；
分析判别及结果输出模块，用于将判别函数结果进行比较，从而做出直肠腺癌易感性预测，并将结果输出。
其中，
所述STR位点短串联序列重复次数为如下6对STR位点短串联序列的重复次数：
位点代号 起始位置 所属基因 短串联序列
STR-1 X染色体，第66657655位 AR CAG
STR-2 4号染色体，第55633758位 Bat-25 T
STR-3 5号染色体，第111646983位 D5S346 GT
STR-4 6号染色体，第151806531位 ER1 TA
STR-5 14号染色体，第64253561位 ER2 TG
STR-6 4号染色体，第154587748位 FGA AAAG
所述判别函数包括：
第一判别函数FRC＝9.246X1+5.351X2+12.883X3+122.038X4+3.427X5-1.866X6-5.381X7+9.156X8+0.257X9-3.594X10-5.776X11+7.884X12-34.457X13-1870.873
第二判别函数FRN＝8.819X1+5.558X2+13.339X3+124.245X4+3.689X5-2.671X6-4.640X7+8.627X8+0.196X9-3.697X10-6.440X11+7.732X12-35.925X13-1904.903
所述判别函数中，
X1为STR-1两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X2为STR-1两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X3为STR-2两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X4为STR-2两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X5为STR-3两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X6为STR-3两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X7为STR-4两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X8为STR-4两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X9为STR-5两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X10为STR-5两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X11为STR-6两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X12为STR-6两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
若受检对象为女性，则X13＝0，若受检对象为男性，则X13＝1。
其中，X1 -X12根据片段长度和如下公式计算得到，其中round代表四舍五入取整数：
X1＝round[(L1-191)/3]；X2＝round[(L2-191)/3]；
X3＝round(L3-379)；X4＝round(L4-379)；
X5＝round[(L5-202)/2]；X6＝round[(L6-202)/2]；
X7＝round[(L7-359)/2]；X8＝round[(L8-359)/2]；
X9＝round[(L9-278)/2]；X10＝round[(L10-278)/2]；
X11＝round[(L11-200)/4]；X12＝round[(L12-200)/4]；
X1 -X12中，L1是STR-1两个等位基因中较小的片段长度值，L2是STR-1两个等位基因中较大的片段长度值；
L3是STR-2两个等位基因中较小的片段长度值，L4是STR-2两个等位基因中较大的片段长度值；
L5是STR-3两个等位基因中较小的片段长度值，L6是STR-3两个等位基因中较大的片段长度值；
L7是STR-4两个等位基因中较小的片段长度值，L8是STR-4两个等位基因中较大的片段长度值；
L9是STR-5两个等位基因中较小的片段长度值，L10是STR-5两个等位基因中较大的片段长度值；
L11是STR-6两个等位基因中较小的片段长度值，L12是STR-6两个等位基因中较大的片段长度值；
所述分析判别及结果输出模块，将第一判别函数FRC的计算结果和第二判别函数FRN的计算结果进行比较，若FRC>FRN，则输出“受检对象罹患直肠腺癌的几率≥90.2％”的预测结果；若FRC≤FRN，则输出“受检对象不罹患直肠腺癌的几率≥88.9％”的预测结果。
实施例2一种直肠腺癌易感性预测试剂盒
一种直肠腺癌易感性预测试剂盒，其包括以下组分：STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物、PCR扩增反应液、LIZ-500分子量内标、去离子甲酰胺、使用说明书。
上述STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物浓度均为10μM，引物序列见下表：
PCR扩增反应液为以下试剂的混合液：TaqDNA聚合酶(5U/μL)、Tris-HCl(100mM，在25℃时pH 8.8)、KCl(500mM)、乙基苯基聚乙二醇(0.8％(v/v))、MgCl2(25mM)、dNTP(10mM)、去离子水。
所述PCR扩增反应液于-20℃保存；LIZ-500分子量内标于-20℃保存；去离子甲酰胺于2-8℃保存。
上述试剂盒还包括使用说明书。
实施例3利用实施例1的系统及实施例2的试剂盒预测该受检对象罹患直肠腺癌的风险
受检对象：女，60岁，就诊于吉林大学第二医院结直肠肛门外科，在充分告知检查目的及用途，在其自愿的前提下，签署知情同意书，并经外周静脉采集抗凝血1mL。
使用实施例2的试剂盒，按照试剂盒说明书上记载的方法进行如下步骤的操作：
(1)提取样本DNA：应用DNA提取试剂盒提取血液基因组DNA；
(2)PCR反应
(2-1)从冰箱中取出STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物、PCR扩增反应液，平衡至室温，各组分充分溶解后，分别快速离心10秒；
(2-2)取100ng样本DNA，加入PCR扩增反应液60μL，加入去离子水补充至115.2μL，充分混匀，快速离心10秒，然后将混合液按照19.6μL/孔分装至6个PCR反应管中；
(2-3)将STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物按照0.8μL/孔分别加入到步骤(2-2)的6个PCR反应管中；盖好PCR反应管盖，记录样本加样情况，快速离心10秒，然后将PCR反应管转移至PCR扩增仪样本槽相应位置，并记录放置顺序，开始PCR扩增反应；扩增反应条件为：95℃3分钟；95℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，10个循环；95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，20个循环；72℃6分钟，得到6组PCR扩增产物；
(3)STR片段分析
(3-1)取990μL去离子甲酰胺，加入10μL的LIZ-500分子量内标，充分混匀，快速离心10秒，按照10μL/孔分别加入到测序反应管中，快速离心10秒；
(3-2)将上述6组PCR扩增产物按照1μL/孔分别加入到6个测序反应管中，快速离心10秒；然后将测序反应管转移至PCR扩增仪样本槽相应位置，98℃加热5分钟，程序结束后立即将测序反应管置于冰水混合物上急速冷却至0℃，快速离心10秒；然后将测序反应管转移至STR位点片段分析仪样本槽相应位置，并记录放置顺序，进行片段分析检测；
(4)结果分析与判定
(4-1)根据片段分析结果，分别记录STR-1、STR-2、STR-3、STR-4、STR-5、STR-6各位点两个等位基因的片段长度：STR-1两个等位基因中较小的片段长度值记为L1，STR-1两个等位基因中较大的片段长度值记为L2；STR-2两个等位基因中较小的片段长度值记为L3，STR-2两个等位基因中较大的片段长度值记为L4；STR-3两个等位基因中较小的片段长度值记为L5，STR-3两个等位基因中较大的片段长度值记为L6；STR-4两个等位基因中较小的片段长度值记为L7，STR-4两个等位基因中较大的片段长度值记为L8；STR-5两个等位基因中较小的片段长度值记为L9，STR-5两个等位基因中较大的片段长度值记为L10；STR-6两个等位基因中较小的片段长度值记为L11，STR-6两个等位基因中较大的片段长度值记为L12；结果显示：L1＝268.39，L2＝268.39，L3＝404.26，L4＝404.26，L5＝229.16，L6＝246.28，L7＝385.01，L8＝388.85，L9＝312.04，L10＝318.40，L11＝260.46，L12＝260.46。
(4-2)根据片段长度和如下公式计算得到，记作X1-X12，其中round代表四舍五入取整数：
X1＝round[(L1-191)/3]＝26；X2＝round[(L2-191)/3]＝26；
X3＝round(L3-379)＝25；X4＝round(L4-379)＝25；
X5＝round[(L5-202)/2]＝14；X6＝round[(L6-202)/2]＝22；
X7＝round[(L7-359)/2]＝13；X8＝round[(L8-359)/2]＝15；
X9＝round[(L9-278)/2]＝17；X10＝round[(L10-278)/2]＝20；
X11＝round[(L11-200)/4]＝15；X12＝round[(L12-200)/4]＝15；
患者为女性，X13＝0。
(4-3)使用运行实施例1所述直肠腺癌易感性预测系统的计算机，对受检对象罹患直肠腺癌的易感性预测：
将受检对象的年龄、性别、STR位点短串联序列重复次数通过数据输入模块输入系统，通过数据计算模块计算判别函数的结果：
第一判别函数FRC＝9.246X1+5.351X2+12.883X3+122.038X4+3.427X5-1.866X6-5.381X7+9.156X8+0.257X9-3.594X10-5.776X11+7.884X12-34.457X13-1870.873＝1920.096
第二判别函数FRN＝8.819X1+5.558X2+13.339X3+124.245X4+3.689X5-2.671X6-4.640X7+8.627X8+0.196X9-3.697X10-6.440X11+7.732X12-35.925X13-1904.903＝1919.24
经分析判别及结果输出模块比较FRC值和FRN值，FRC>FRN，输出“受检对象罹患直肠腺癌的几率≥90.2％”的预测结果。
该受检者于就诊后行腹腔镜下直肠癌根治术，病理检查确诊为直肠中分化腺癌，其临床诊断结果与本发明所述试剂盒预测结果相一致。
实施例4利用实施例1的系统及实施例2的试剂盒预测该受检对象罹患直肠腺癌的风险
受检对象：女，65岁，就诊于吉林大学第二医院结直肠肛门外科，在充分告知检查目的及用途，在其自愿的前提下，签署知情同意书，并经外周静脉采集抗凝血1mL。
参照实施例3的预测方法，对血样进行相同的处理和测试，结果显示：L1＝270.91，L2＝276.45，L3＝404.16，L4＝404.16，L5＝228.63，L6＝228.63，L7＝388.71，L8＝388.71，L9＝313.58，L10＝320.24，L11＝248.32，L12＝270.04。
根据片段长度和如下公式计算得到，记作X1-X12，其中round代表四舍五入取整数：
X1＝round[(L1-191)/3]＝27；X2＝round[(L2-191)/3]＝28；
X3＝round(L3-379)＝25；X4＝round(L4-379)＝25；
X5＝round[(L5-202)/2]＝13；X6＝round[(L6-202)/2]＝13；
X7＝round[(L7-359)/2]＝15；X8＝round[(L8-359)/2]＝15；
X9＝round[(L9-278)/2]＝18；X10＝round[(L10-278)/2]＝21；
X11＝round[(L11-200)/4]＝12；X12＝round[(L12-200)/4]＝18；
患者为女性，X13＝0。
使用运行实施例1所述直肠腺癌易感性预测系统的计算机，对受检对象罹患直肠腺癌的易感性预测：
将受检对象的年龄、性别、STR位点短串联序列重复次数通过数据输入模块输入系统，通过数据计算模块计算判别函数的结果：
第一判别函数FRC＝9.246X1+5.351X2+12.883X3+122.038X4+3.427X5-1.866X6-5.381X7+9.156X8+0.257X9-3.594X10-5.776X11+7.884X12-34.457X13-1870.873＝1980.292
第二判别函数FRN＝8.819X1+5.558X2+13.339X3+124.245X4+3.689X5-2.671X6-4.640X7+8.627X8+0.196X9-3.697X10-6.440X11+7.732X12-35.925X13-1904.903＝1989.26
经分析判别及结果输出模块比较FRC值和FRN值，FRC≤FRN，输出“受检对象不罹患直肠腺癌的几率≥88.9％”的预测结果。
该受检对象于就诊后诊断为结肠息肉，其临床诊断结果与本发明所述试剂盒预测结果相一致。
以上所述是本发明的优选实施方式，不用以限制本发明，应当指出，在不脱离本发明原理和宗旨的前提下作出的任何变化、修改、替换和变型等(如：增加、减少、改变STR位点，使用受检对象的其它来源的细胞或组织，采用其他类似统计学方法等)，均应包含在为本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> 一种直肠腺癌易感性预测试剂盒及系统
<130> DI18-8178-XC47
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<223> STR-1引物上游引物
<400> 1
agggctggga agggtcta 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<223> STR-1引物下游引物
<400> 2
ggagaaccat cctcaccct 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> STR-2引物上游引物
<400> 3
cgcctccaag aatgtaagtg 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<223> STR-2引物下游引物
<400> 4
aactcaagtc tatgcttcac cc 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<223> STR-3引物上游引物
<400> 5
ggtttccatt gtagcatctt g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> STR-3引物下游引物
<400> 6
gcctggttgt ttccgtagta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> STR-4引物上游引物
<400> 7
tctgttgggt gtttgggata 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> STR-4引物下游引物
<400> 8
ttacattgtc ggtctggtcc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> STR-5引物上游引物
<400> 9
atctcagtct ccccaagtgc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> STR-5引物下游引物
<400> 10
tccttcaaga taaccaccga 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<223> STR-6引物上游引物
<400> 11
tcggttgtag gtattatcac gg 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> STR-6引物下游引物
<400> 12
tgccccatag gttttgaact 20

Claims (10)

1.一种直肠腺癌易感性预测试剂盒，其包括以下组分：STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物，所述STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物分别用于扩增包含下列短串联序列的目的片段，以确定下列短串联序列的重复次数：
2.一种直肠腺癌易感性预测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物；
所述STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物的序列如下所示：
优选地，所述STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物的使用浓度均为10μM。
3.如权利要求2所述的直肠腺癌易感性预测试剂盒，其特征在于，还包括：PCR扩增反应液、LIZ-500分子量内标、去离子甲酰胺。
4.如权利要求3所述的直肠腺癌易感性预测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增反应液为以下试剂的混合液：TaqDNA聚合酶5U/μL、Tris-HCl 100mM、KCl 500mM、乙基苯基聚乙二醇0.8％(v/v)、MgCl2 25mM、dNTP 10mM、去离子水；其中，Tris-HCl在25℃时pH为8.8。
5.如权利要求4所述的直肠腺癌易感性预测试剂盒，其特征在于：还包括使用说明书；
所述使用说明书记载了所述一种直肠腺癌易感性预测试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)PCR反应
(2-1)从冰箱中取出STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物、PCR扩增反应液，平衡至室温，各组分充分溶解后，分别快速离心10秒；
(2-2)取30-300ng样本DNA，加入PCR扩增反应液60μL，加入去离子水补充至115.2μL，充分混匀，快速离心10秒，然后将混合液按照19.6μL/孔分装至6个PCR反应管中；
(2-3)将STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物按照0.8μL/孔分别加入到步骤(2-2)的6个PCR反应管中；盖好PCR反应管盖，记录样本加样情况，快速离心10秒，然后将PCR反应管转移至PCR扩增仪样本槽相应位置，并记录放置顺序，开始PCR扩增反应；扩增反应条件为：95℃3分钟；95℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，10个循环；95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，20个循环；72℃6分钟，得到6组PCR扩增产物；
(3)STR片段分析
(3-1)取990μL去离子甲酰胺，加入10μL的LIZ-500分子量内标，充分混匀，快速离心10秒，按照10μL/孔分别加入到测序反应管中，快速离心10秒；
(3-2)将上述6组PCR扩增产物按照1μL/孔分别加入到6个测序反应管中，快速离心10秒；然后将测序反应管转移至PCR扩增仪样本槽相应位置，98℃加热5分钟，程序结束后立即将测序反应管置于冰水混合物上急速冷却至0℃，快速离心10秒；然后将测序反应管转移至STR位点片段分析仪样本槽相应位置，并记录放置顺序，进行片段分析检测；
(4)结果分析与判定
(4-1)根据片段分析结果，分别记录STR-1、STR-2、STR-3、STR-4、STR-5、STR-6各位点两个等位基因的片段长度：
STR-1两个等位基因中较小的片段长度值记为L1，STR-1两个等位基因中较大的片段长度值记为L2；
STR-2两个等位基因中较小的片段长度值记为L3，STR-2两个等位基因中较大的片段长度值记为L4；
STR-3两个等位基因中较小的片段长度值记为L5，STR-3两个等位基因中较大的片段长度值记为L6；
STR-4两个等位基因中较小的片段长度值记为L7，STR-4两个等位基因中较大的片段长度值记为L8；
STR-5两个等位基因中较小的片段长度值记为L9，STR-5两个等位基因中较大的片段长度值记为L10；
STR-6两个等位基因中较小的片段长度值记为L11，STR-6两个等位基因中较大的片段长度值记为L12；
(4-2)短串联序列的重复次数根据片段长度和如下公式计算得到，记作X1-X12，其中round代表四舍五入取整数：
X1＝round[(L1-191)/3]；X2＝round[(L2-191)/3]；
X3＝round(L3-379)；X4＝round(L4-379)；
X5＝round[(L5-202)/2]；X6＝round[(L6-202)/2]；
X7＝round[(L7-359)/2]；X8＝round[(L8-359)/2]；
X9＝round[(L9-278)/2]；X10＝round[(L10-278)/2]；
X11＝round[(L11-200)/4]；X12＝round[(L12-200)/4]；
(4-3)将上述短串联序列重复次数代入预先设置的判别函数：
FRC＝9.246X1+5.351X2+12.883X3+122.038X4+3.427X5-1.866X6-5.381X7+9.156X8+0.257X9-3.594X10-5.776X11+7.884X12-34.457X13-1870.873
FRN＝8.819X1+5.558X2+13.339X3+124.245X4+3.689X5-2.671X6-4.640X7+8.627X8+0.196X9-3.697X10-6.440X11+7.732X12-35.925X13-1904.903
其中，若受检对象为女性，则X13＝0，若受检对象为男性，则X13＝1；
(4-4)直肠腺癌易感性预测：
比较FRC值和FRN值，若FRC>FRN，则预测受检对象罹患直肠腺癌的几率≥90.2％；若FRC≤FRN，则预测受检对象不罹患直肠腺癌的几率≥88.9％。
6.如权利要求5所述的直肠腺癌易感性预测试剂盒，其特征在于：所述样本为受检对象的全血。
7.权利要求1～6中任一项所述直肠腺癌易感性预测试剂盒在制备直肠腺癌诊断产品中的应用。
8.一种直肠腺癌易感性预测系统，其特征在于，包括：
获得样本DNA的下列STR位点短串联序列的重复次数的装置：
数据处理和判定装置，其包括以下模块：
数据输入模块，用于输入受检对象年龄、性别、STR位点短串联序列重复次数；
数据库管理模块，用于数据的存储、修改、删除、查询、打印的操作管理；
数据计算模块，用于根据数据输入模块中的STR位点短串联序列重复次数计算判别函数结果；
分析判别及结果输出模块，用于将判别函数结果进行比较，从而做出直肠腺癌易感性预测，并将结果输出。
9.如权利要求8所述的直肠腺癌易感性预测系统，其特征在于，使用权利要求2所述的试剂盒获得样本DNA的STR位点短串联序列的重复次数X1-X12；以及
其中：
所述判别函数包括：
第一判别函数FRC＝9.246X1+5.351X2+12.883X3+122.038X4+3.427X5-1.866X6-5.381X7+9.156X8+0.257X9-3.594X10-5.776X11+7.884X12-34.457X13-1870.873
第二判别函数FRN＝8.819X1+5.558X2+13.339X3+124.245X4+3.689X5-2.671X6-4.640X7+8.627X8+0.196X9-3.697X10-6.440X11+7.732X12-35.925X13-1904.903
所述判别函数中，
X1为STR-1两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X2为STR-1两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X3为STR-2两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X4为STR-2两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X5为STR-3两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X6为STR-3两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X7为STR-4两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X8为STR-4两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X9为STR-5两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X10为STR-5两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
X11为STR-6两个等位基因中较小的片段的短串联序列的重复次数；
X12为STR-6两个等位基因中较大的片段的短串联序列的重复次数；
若受检对象为女性，则X13＝0，若受检对象为男性，则X13＝1；
其中，X1 -X12根据片段长度和如下计算得到，其中round代表四舍五入取整数：
X1＝round[(L1-191)/3]；X2＝round[(L2-191)/3]；
X3＝round(L3-379)；X4＝round(L4-379)；
X5＝round[(L5-202)/2]；X6＝round[(L6-202)/2]；
X7＝round[(L7-359)/2]；X8＝round[(L8-359)/2]；
X9＝round[(L9-278)/2]；X10＝round[(L10-278)/2]；
X11＝round[(L11-200)/4]；X12＝round[(L12-200)/4]；
X1 -X12中，L1是STR-1两个等位基因中较小的片段长度值，L2是STR-1两个等位基因中较大的片段长度值；
L3是STR-2两个等位基因中较小的片段长度值，L4是STR-2两个等位基因中较大的片段长度值；
L5是STR-3两个等位基因中较小的片段长度值，L6是STR-3两个等位基因中较大的片段长度值；
L7是STR-4两个等位基因中较小的片段长度值，L8是STR-4两个等位基因中较大的片段长度值；
L9是STR-5两个等位基因中较小的片段长度值，L10是STR-5两个等位基因中较大的片段长度值；
L11是STR-6两个等位基因中较小的片段长度值，L12是STR-6两个等位基因中较大的片段长度值；
所述分析判别及结果输出模块，将第一判别函数FRC的计算结果和第二判别函数FRN的计算结果进行比较，若FRC>FRN，则输出“受检对象罹患直肠腺癌的几率≥90.2％”的预测结果；若FRC≤FRN，则输出“受检对象不罹患直肠腺癌的几率≥88.9％”的预测结果。
10.权利要求8所述直肠腺癌易感性预测系统在制备直肠腺癌预测产品、直肠腺癌诊断产品、肠道健康辅助产品中的应用。
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