CN109536612B - 一种与鼻咽癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用 - Google Patents

一种与鼻咽癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种与鼻咽癌癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用，该标志物为let‑7b‑5p,miR‑140‑3p,miR‑144‑3p,miR‑17‑5p,miR‑20a‑5p,miR‑20b‑5p和miR‑205‑5p中的一种或多种。血浆miRNA作为新型的生物标志物，具有稳定性好、微创易获取，灵敏性和特异性高的特点。这类分子标志物的开发利用将为包括肿瘤在内的各种疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。本研究将更有针对性的得出具有临床诊断潜能的鼻咽癌血浆miRNA标记物。研究证实了这组miRNA作为诊断鼻咽癌的无创标记物的可靠性以及可重复性。

Description

一种与鼻咽癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与鼻咽癌癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用。
背景技术
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是发生于鼻咽粘膜上皮的恶性肿瘤。虽然相比于其他种类的恶性肿瘤鼻咽癌的全球发病率并不高，但其发病率具有明显的种族和地域差异。根据世界卫生组织报道，全球有80％的鼻咽癌患者在中国，尤其在中国南部地区。目前，放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法，对早期患者有极高的治愈率，显著提升了整体生存率。但是很多患者疾病早期时并无症状，并在就诊时已处于中晚期，对单纯放疗的疗效较差，不利于疾病的控制。目前针对鼻咽癌的分子和临床特征的研究不断深入，鼻咽镜检查、病理检查、影像学检查都成为了临床筛查的重要手段。近年来研究发现，EB病毒感染与鼻咽癌的发生、发展密切相关，EB病毒抗体或病毒DNA的检测可以帮助早期发现高危人群。但是，这些方法或者过于依赖检测者经验，或者具有侵入性而不适合常规筛查，或者价格太高无法推广，或者检测灵敏度和特异性还有待加强。因此，迫切需要开发新的可靠的非侵入性早期诊断标记物，促进早期干预和治疗，延长病人的生存期。
微小RNA(Micro ribonucleic acids，miRNAs)的发现是最近这些年来重大发现之一。成熟的miRNA是一类进化保守，长度在18-25个核苷酸的小非编码RNA分子。据研究，miRNA可在转录后水平调控机体1/3以上的基因，从而参与机体的众多生理病理过程。miRNA的表达具有时间特异性以及组织特异性。同时，一些miRNA能够参与特定的生理病理以及特异的疾病过程。因此，某些特异的miRNA可以作为某些生理病理以及某些疾病例如肿瘤等疾病的标志物。2008年，Mitchell在外周血中检测到游离的miRNA，发现其能够稳定存在于外周血，并且能够作为诊断肿瘤的无创标志物。这一研究发现拉开了全球众多研究者开始探索循环miRNA作为无创标志物的大幕。现有研究证实了循环miRNA在包括肺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌中的潜在诊断价值。目前对于循环miRNA在鼻咽癌中的诊断价值研究并不充分，并且由于研究方法及纳入人群的差异，各研究结果并不完全一致。因此，本研究利用Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的相对定量法，通过对大样本的鼻咽癌血浆的研究，旨在寻找对鼻咽癌具有潜在诊断价值的血浆miRNA。并对这些miRNA在鼻咽癌组织和不同临床特征患者血浆中的表达水平进行验证和比较，以进一步明确其与鼻咽癌的关系及诊断价值。若根据这类miRNA设计针对于鼻咽癌的诊断试剂盒，将会推动我国鼻咽癌的诊治水平，也为将来对鼻咽癌的进一步研究提供思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与鼻咽癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物。
本发明的另一目的在于提供上述血浆miRNA标志物及其引物在制备鼻咽癌辅助诊断试剂盒以及在制备治疗鼻咽癌的药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供用于鼻咽癌辅助诊断和治疗的试剂盒及药物。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种与鼻咽癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物，该标志物为let-7b-5p(ugagguaguagguugugugguu),miR-140-3p(uaccacaggguagaaccacgg),miR-144-3p(uacaguauagaugauguacu),miR-17-5p(caaagugcuuacagugcagguag),miR-20a-5p(uaaagugcuuauagugcagguag),miR-20b-5p(caaagugcucauagugcagguag)和miR-205-5p(uccuucauuccaccggagucug)中的一种或多种。
该血浆miRNA标志物优选为let-7b-5p,miR-140-3p,miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p中两种或两以上的组合，进一步优选为let-7b-5p,miR-140-3p,miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p七种miRNA所组成的组合。
上述的血浆miRNA标志物在辅助诊断鼻咽癌中的应用。
上述的血浆miRNA标志物在制备鼻咽癌辅助诊断试剂盒或治疗鼻咽癌药物中的应用。
一种与鼻咽癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物的引物，该引物包含let-7b-5p,miR-140-3p,miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p中的一种或多种miRNA的引物；优选为包含血浆miRNA中let-7b-5p,miR-140-3p,miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p中两种或两以上miRNA的引物；进一步优选为包含血浆miRNA中let-7b-5p,miR-140-3p,miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p七种miRNA的引物。
上述的引物在辅助诊断鼻咽癌或制备鼻咽癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种鼻咽癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含有血浆miRNA中let-7b-5p,miR-140-3p,miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p中的一种或多种miRNA的引物；优选为含有血浆miRNA中let-7b-5p,miR-140-3p,miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p中两种或两种以上miRNA的引物；进一步优选为含有血浆miRNA中let-7b-5p,miR-140-3p,miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p七种miRNA的引物。
该试剂盒中还包括PCR技术常用的试剂或/和免疫组化技术常用的试剂。
该试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。
本发明所涉及的与鼻咽癌诊断相关的血浆miRNA标志物let-7b-5p,miR-140-3p,miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p中的每种miRNA的序列均已公开，但是将各miRNA标志物进行组合作为鼻咽癌辅助诊断标志物需要本领域技术人员付出创造性劳动。各miRNA标志物的扩增引物均可通过市场购买获得，本发明实施例中使用的血浆miRNA标志物的引物为购自广州锐博公司所合成生产的特异性miRNA茎环RT-PCR引物。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血浆miRNA差异表达谱分析：分析鼻咽癌和正常对照人群中差异表达的血浆miRNA，并对差异表达miRNAs进行进一步大样本多阶段验证。(3)通过多阶段的验证，明确这些miRNA诊断鼻咽癌的能力。(4)血浆miRNA诊断试剂盒的研制：根据鼻咽癌与正常人群血浆中的差异表达miRNA开发miRNAs诊断试剂盒，实现对鼻咽癌患者的无创辅助诊断。(4)分析这些miRNA在鼻咽癌组织以及不同临床病理特征患者血浆中的表达情况，揭示这些miRNA与鼻咽癌的关系，为将来研制可能与这些miRNA相关的治疗鼻咽癌的药物提供依据。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料，并采用了Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及qRT-PCR方法等。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本选择：初治、未行手术以及放化疗干预且之后经病理确认为鼻咽癌的病人。正常对照为在医院进行体检的正常人群。
2.Exiqon miRNA qPCR panel芯片初筛：利用TRIZOL-LS试剂对血浆混合样本进行RNA提取，并进行qRT-PCR操作获得初筛结果。
3.训练集、验证集以及额外验证集：利用AM1556试剂盒(ABI公司)对每个血浆样本进行RNA提取，通过逆转录反应得到cDNA样品，加入PCR引物和SYBR Green荧光染料进行PCR反应。通过比对标准品的Ct值，得出样本中的miRNA含量。
4.利用TRIZOL-LS试剂提取鼻咽癌和正常鼻黏膜组织中的RNA，通过qRT-PCR的方法，检测miRNA在组织中的表达差异。
5.统计分析：运用χ2检验、配对t检验以及非参数秩和检验比较miRNA表达水平在不同研究组中的差异。通过计算风险值和ROC曲线分析证实血浆miRNA的诊断价值。
本发明研究组目前通过对鼻咽癌病人的外周血浆中的miRNA进行系统的表达分析，现已发现了一组7个具有临床诊断潜能的鼻咽癌血浆microRNA标记物(let-7b-5p,miR-140-3p,miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p)。
本发明的有益效果：
1.相较于传统的肿瘤标志物，血浆miRNA作为新型的生物标志物，具有稳定性好、微创易获取，灵敏性和特异性高的特点。这类分子标志物的开发利用将为包括肿瘤在内的各种疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。
2.研究者通过Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的相对定量法，对鼻咽癌和正常对照人群血浆中的差异表达miRNA进行严密、多阶段的验证和评价。证实了这组miRNA作为诊断鼻咽癌的无创标记物的可靠性以及可重复性。
3.研究者发现miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p和miR-205-5p在鼻咽癌组织中的表达与血浆中表达一致，而let-7b-5p和miR-140-3p在鼻咽癌组织中的表达与血浆中表达相反，显示了这些miRNA与鼻咽癌之间的紧密关系。同时，相比于正常人，EB病毒阳性的鼻咽癌患者血浆中let-7b-5p,miR-140-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p表达显著升高，而miR-144-3p的表达显著降低；相比于正常人，EB病毒阴性的鼻咽癌患者血浆中这七种miRNA的表达都显著增高；此外，EB病毒阳性鼻咽癌患者血浆中let-7b-5p的表达相比EB病毒阴性患者显著上调，而miR-144-3p和miR-20a-5p则显著下调。这些结果将给未来研究这些miRNA对于鼻咽癌的机制以及针对这些miRNA对于鼻咽癌的治疗提供新的思路。
附图说明
图1：实验流程图
图2：在鼻咽癌血浆中高表达的7个miRNA
图3：对所获得的miRNA进行ROC曲线分析
A：训练集；B：验证集；C：外部验证集；D:训练集、验证集与外部验证集的合集
图4：7个miRNA在鼻咽癌组织中的表达情况
图5：7个miRNA在EB病毒阳性或阴性鼻咽癌患者血浆中的表达情况
具体实施方式
发明人于2014年至2016年从南京医科大学第一附属医院和江苏省肿瘤医院收集了大量的鼻咽癌患者和正常体检人群的静脉血浆样品，通过对样品资料的整理，从中选择了200例鼻咽癌和189例正常对照的样本作为Exiqon miRNA qPCR panel芯片初筛和后续一系列qRT-PCR验证的实验样品。同时还留取了48例鼻咽癌肿瘤组织和32例正常鼻黏膜组织。所选择的患者血浆样本均来自于初治、未行手术以及放化疗干预且之后经病理确认为鼻咽癌的病人。并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料。
参照流程图(图1)，从鼻咽癌以及正常对照血浆样本中随机选择了20例鼻咽癌样本以及10例正常对照，并且分别混合成了2例鼻咽癌血浆混合样本和1个正常混合样本(一个混合样本由10例200ul血浆样本汇合形成2ml的样本)。对这3例混合样本进行ExiqonmiRNA qPCR panel芯片初筛和分析，具体步骤参照Exiqon miRNA qPCR panel芯片的说明书：
1.血浆抽提
取出血浆样品，样品化冻后3000x g离心5min去除一些碎片及一些不溶成分。转移上清至新的1.5ml管中，加入750ul TRIZOL-LS后，剧烈震荡5s。
2.两相分离
匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟。每1ml的TRIZOL-LS试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下13,000g离心15分钟。
3.RNA沉淀
将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为：每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL-LS试剂的同时加0.5ml的异丙醇和5ul的糖元。4℃静置半小时，让RNA尽可能的析出。于4℃13,000g离心15分钟。
4.RNA清洗
移去上清液，每1ml TRIZOL-LS试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％(v/v)乙醇，清洗RNA沉淀。静置10分钟，然后4℃下10000g离心5分钟。
5.重新溶解RNA沉淀
去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。
6.测量浓度：
通常能得到～5μg RNA/50ml血浆。
7.cDNA合成
(1)稀释模板RNA：使用DEPC水将20－25ng模板RNA稀释至14ul(终浓度为1.492－1.786ng/μl)。
(2)准备反应液：将5×Reaction Buffer以及DEPC水置于冰上溶解，并震荡混匀。Enzyme mix置于-20℃冰盒，使用前轻弹混匀后置于冰上。所有试剂均离心后使用。
(3)配置反应液：配置下表中的反应液
Figure BDA0001917635990000061
(4)混合并离心试剂：震荡或者抽吸混匀反应液后离心，以保证所有溶液彻底混合均匀。
(5)逆转录反应及热失活：将反应液于42℃温育60分钟后，于95℃温育5分钟以失活逆转录酶。
8.Real-Time PCR
试剂：
Nuclease free water(Exiqon)
SYBRTM Green master mix(Exiqon)
cDNA模板
ROX(Invitrogen)
miRNA PCR ARRAY(Exiqon)
仪器：
ABI PRISM7900 system(Applied Biosystems)
(1)准备Real-time PCR试剂：将制备的cDNA模板，DEPC水和SYBRTM Green mastermix置于冰上溶解15-20分钟。
(2)稀释cDNA模板：将RT反应获得的cDNA模板用nuclease free water稀释110倍(例如，向20μl反应液中加入2180ul nuclease free water)。
(3)混合所有反应试剂：
A.将PCR板简单离心后，移去封膜。
B.将110倍稀释的cDNA模板与2×SYBR Green master mix按照1：1混合。
C.倒置混匀反应液并离心
D.将混合反应液加入板中的每个孔
E.重新封好PCR板
(4)将PCR板简单低温离心
(5)Real-time PCR扩增：根据下表中的反应条件进行Real-time PCR扩增和溶解曲线分析。
Real-time PCR循环条件如下表：
Figure BDA0001917635990000071
数据分析：采用ΔΔCt方法
使用PCR仪器附带的软件进行初步数据分析，获得原始的Cq值(Cp或Ct，依仪器不同名称可能不同)。
我们建议使用GenEx qPCR分析软件(www.exiqon.com/mirna-pcr-analysis)对数据进行标准和深入的数据分析。
a.计算每个处理组中的每个通路相关基因的ΔCt。
ΔCt(group 1)＝average Ct–average of HK genes’Ct for group 1array
ΔCt(group 2)＝average Ct–average of HK genes’Ct for group 2array
b.计算2个PCR Array(或两组)中每个基因的ΔΔCt。
ΔΔCt＝ΔCt(组2)–ΔCt(组1)
备注：通常组1是对照，组2是实验组。
c.同过2-ΔΔCt计算组2与组1对应基因的表达差异。
在芯片初筛后，得到了如下表中的31个差异表达miRNA(2个鼻咽癌血浆混合样本相对于正常样本都超过了1.5倍差异)。
Figure BDA0001917635990000072
Figure BDA0001917635990000081
对于初筛得到的31个差异表达miRNA，通过训练集、验证集以及额外验证集，采用基于qRT-PCR的相对定量法进行验证，具体步骤为：
1.血浆RNA提取：选用ABI公司血浆RNA提取试剂盒(AM1556)，参照试剂盒说明，每个样本吸取200ul进行提取RNA，并最后用100ul DEPC水进行溶解。
2.cDNA的制备：
1)采用50μL反应体系进行逆转录实验
Figure BDA0001917635990000082
Figure BDA0001917635990000091
以上反应体系混匀，瞬时离心后，以下列程序进行反应：
Figure BDA0001917635990000092
2)上述反应之后再反应体系中再加入如下反应物
Figure BDA0001917635990000093
3.qPCR1)采用5μL反应体系，按以下比例进行试验
Figure BDA0001917635990000094
反应体系混匀，瞬时离心后，放置于实时定量PCR仪中，以下列程序进行反应：
Figure BDA0001917635990000095
反应结束后添加溶解曲线。
数据分析：利用SPSS 22.0软件进行统计分析，得到了一组在训练集，验证集中都一致于鼻咽癌血浆中高表达7个miRNA：let-7b-5p,miR-140-3p,miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p(在训练集，验证集中P值都小于0.05，图2)。通过这7个miRNA，可以计算每个样本的ROC曲线，如图3，这7个miRNA组成的分子标志物能够很好的区分鼻咽癌患者和正常人群。额外训练集则进一步证实了结果的可靠性(图3)。
研究组之后进一步检测了这7个miRNA在鼻咽癌组织的表达，鼻咽癌组织提取RNA利用TRIZOL。
运用非参数检验分析发现，miR-144-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p和miR-205-5p在鼻咽癌组织中的表达高于正常组织，而let-7b-5p和miR-140-3p在鼻咽癌组织中的表达低于正常组织(图4)。
同时，相比于正常人，EB病毒阳性的鼻咽癌患者血浆中let-7b-5p,miR-140-3p,miR-17-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p和miR-205-5p表达显著升高，而miR-144-3p的表达显著降低；相比于正常人，EB病毒阴性的鼻咽癌患者血浆中这7种miRNA的表达都显著增高；此外，EB病毒阳性鼻咽癌患者血浆中let-7b-5p的表达相比EB病毒阴性患者显著上调，而miR-144-3p和miR-20a-5p则显著下调(图5)。
试剂盒包括一批血浆miRNA qRT-PCR引物，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水，荧光探针，RNA 酶抑制剂，Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的正常人样本等)。此试剂盒的价值在于只需要血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光法检测血浆样本中miRNA的表达含量，来辅助诊断该样本来源患者的罹患鼻咽癌的可能性。血浆miRNA不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断以及进一步的个体化治疗。

Claims (2)

1.检测血浆miRNA标志物的引物在制备鼻咽癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，该血浆miRNA标志物由let-7b-5p, miR-140-3p, miR-144-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p,miR-20b-5p和 miR-205-5p组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒中还包括PCR技术常用的试剂。
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