CN111286538B - 一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环miRNA和癌胚miRNA标志物及其应用 - Google Patents

一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环miRNA和癌胚miRNA标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环miRNA标志物和癌胚miRNA标志物及其应用，该循环miRNA和癌胚miRNA作为新型的生物标志物，具有稳定性好、微创易获取、灵敏性和特异性高的特点。这类分子标志物的开发利用将为包括肿瘤在内的各种疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。本研究将更有针对性的得出具有临床诊断潜能的泛肿瘤循环miRNA标记物和癌胚miRNA标志物。研究证实了这组miRNA作为诊断泛肿瘤的无创标记物的可靠性以及可重复性。

Description

一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环miRNA和癌胚miRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环miRNA和癌胚miRNA标志物及其应用。
背景技术
癌症是全球主要的死亡原因之一。近年来，虽然人们对癌症的分子机制和临床特征有了更深入的了解并开发了更多的治疗手段及方法，但是癌症患者的预后仍然很差。由于缺乏明显的症状和以及足够敏感的生物标志物，许多患者被诊断时已处于晚期，失去了手术机会。早期检测和干预是改善肿瘤患者长期结局的关键策略。如今，对组织标本的病理检查仍是诊断癌症的金标准。但是，这些方法过于依赖检测者经验，且其侵入性的检测方法限制了其在大规模人群中筛查疾病的可行性。现有的无创性肿瘤标志物，如CEA、CA19-9等，在癌症诊断中的敏感性或特异性不高。因此，迫切需要寻找新型的肿瘤标志物，促进早期干预和治疗，延长病人的生存期。
微小RNA(miRNAs)是一类长度在22个左右的核苷酸的小非编码RNA分子，其通过转录后调控广泛参与了各种生命活动过程，包括肿瘤的发生、侵袭及转移等。研究发现，miRNA的表达在肿瘤中有不同程度的上调和下调，为其能够作为一种新兴的肿瘤标志物奠定了基础。2008年，Mitchell在外周血中检测到游离的miRNA，发现其能够稳定存在于外周血中，并且可以作为诊断肿瘤的无创标志物。现已有研究证实了循环miRNA在甲状腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤中的潜在诊断价值。但由于研究方法及纳入人群的差异，导致研究结果不完全一致。因此，本研究利用Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的相对定量法，通过对大样本的泛肿瘤患者血清及血浆的研究，旨在寻找对泛肿瘤具有潜在诊断价值的循环miRNA。同时通过纳入脐带血进行研究，与泛肿瘤循环miRNA进行比较分析，得到癌胚miRNA标志物，对泛肿瘤具有更好的诊断价值。若根据这类miRNA设计针对于泛肿瘤的诊断试剂盒，将会推动我国肿瘤的诊治水平，也为将来对泛肿瘤的进一步研究提供思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环癌胚miRNA标志物。
本发明的另一目的在于提供一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环miRNA标志物。
本发明的另一目的在于提供上述循环miRNA标志物及其引物在制备泛肿瘤辅助诊断试剂盒以及在制备治疗泛肿瘤的药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种泛肿瘤辅助诊断试剂盒或辅助治疗药物。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环癌胚miRNA标志物，该循环癌胚miRNA标志物包含血清癌胚miRNA标志物miR-19b-3p,miR-20a-5p,miR-223-3p,miR-93-5p,miR-25-3p,miR-425-5p,miR-19a-3p,miR-92a-3p和miR-20b-5p；以及血浆癌胚miRNA标志物miR-106a-5p,miR-146a-5p,miR-18a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-21-5p,miR-409-3p和miR-584-5p中两种或两种以上miRNA的组合；优选的，包含血清癌胚miRNA标志物miR-19b-3p,miR-20a-5p,miR-223-3p,miR-93-5p,miR-25-3p,miR-425-5p,miR-19a-3p,miR-92a-3p和miR-20b-5p以及血浆癌胚miRNA标志物miR-106a-5p,miR-146a-5p,miR-18a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-21-5p,miR-409-3p和miR-584-5p十七种miRNA标志物。
一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环miRNA标志物，该循环miRNA标志物包含血清标志物let-7b-5p(ugagguaguagguugugugguu)，miR-106a-5p(aaaagugcuuacagugcagguag)，miR-10b-5p(uacccuguagaaccgaauuugug)，miR-122-5p(uggagugugacaaugguguuug)，miR-133a-3p(uuugguccccuucaaccagcug)，miR-140-3p(uaccacaggguagaaccacgg)，miR-143-3p(ugagaugaagcacuguagcuc)，miR-146a-5p(ugagaacugaauuccauggguu)，miR-151a-3p(cuagacugaagcuccuugagg)，miR-16-5p(uagcagcacguaaauauuggcg)，miR-192-5p(cugaccuaugaauugacagcc)，miR-195-5p(uagcagcacagaaauauuggc)，miR-19a-3p(ugugcaaaucuaugcaaaacuga)，miR-19b-3p(ugugcaaauccaugcaaaacuga)，miR-204-5p(uucccuuugucauccuaugccu)，miR-20a-5p(uaaagugcuuauagugcagguag)，miR-20b-5p(caaagugcucauagugcagguag)，miR-21-5p(uagcuuaucagacugauguuga)，miR-221-3p(agcuacauugucugcuggguuuc)，miR-223-3p(ugucaguuugucaaauacccca)，miR-223-5p(cguguauuugacaagcugaguu)，miR-24-3p(uggcucaguucagcaggaacag)，miR-25-3p(cauugcacuugucucggucuga)，miR-296-5p(agggcccccccucaauccugu)，miR-29c-3p(uagcaccauuugaaaucgguua)，miR-423-3p(agcucggucugaggccccucagu)，miR-425-5p(aaugacacgaucacucccguuga)，miR-451a(aaaccguuaccauuacugaguu)，miR-484(ucaggcucaguccccucccgau)，miR-485-3p(gucauacacggcucuccucucu)，miR-590-5p(gagcuuauucauaaaagugcag)，miR-92a-3p(uauugcacuugucccggccugu)，miR-92b-3p(uauugcacucgucccggccucc)和miR-93-5p(caaagugcuguucgugcagguag)以及血浆标志物let-7b-5p(ugagguaguagguugugugguu)，miR-106a-5p(aaaagugcuuacagugcagguag)，miR-122-5p(uggagugugacaaugguguuug)，miR-125b-5p(ucccugagacccuaacuuguga)，miR-140-3p(uaccacaggguagaaccacgg)，miR-142-3p(uguaguguuuccuacuuuaugga)，miR-144-3p(uacaguauagaugauguacu)，miR-146a-5p(ugagaacugaauuccauggguu)，miR-151a-5p(ucgaggagcucacagucuagu)，miR-17-5p(caaagugcuuacagugcagguag)，miR-181a-5p(aacauucaacgcugucggugagu)，miR-185-5p(uggagagaaaggcaguuccuga)，miR-18a-5p(uaaggugcaucuagugcagauag)，miR-192-5p(cugaccuaugaauugacagcc)，miR-193b-3p(aacuggcccucaaagucccgcu)，miR-19b-3p(ugugcaaauccaugcaaaacuga)，miR-205-5p(uccuucauuccaccggagucug)，miR-20a-5p(uaaagugcuuauagugcagguag)，miR-20b-5p(caaagugcucauagugcagguag)，miR-210-3p(cugugcgugugacagcggcuga)，miR-2110(uuggggaaacggccgcugagug)，miR-21-5p(uagcuuaucagacugauguuga)，miR-221-3p(agcuacauugucugcuggguuuc)，miR-223-3p(ugucaguuugucaaauacccca)，miR-25-3p(cauugcacuugucucggucuga)，miR-409-3p(gaauguugcucggugaaccccu)，miR-425-5p(aaugacacgaucacucccguuga)，miR-451a(aaaccguuaccauuacugaguu)，miR-486-5p(uccuguacugagcugccccgag)，miR-584-5p(uuaugguuugccugggacugag)，miR-92b-3p(uauugcacucgucccggccucc)和miR-93-5p(caaagugcuguucgugcagguag)中的一种或多种；优选为包含上述所有血清标志物和血浆标志物。
上述的循环癌胚miRNA标志物或/和循环miRNA标志物在辅助诊断泛肿瘤中的应用。
上述的循环癌胚miRNA标志物或/和循环miRNA标志物在制备泛肿瘤辅助诊断试剂盒或制备治疗泛肿瘤药物中的应用。
一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环癌胚miRNA标志物的引物，该引物包含血清癌胚miRNA标志物miR-19b-3p,miR-20a-5p,miR-223-3p,miR-93-5p,miR-25-3p,miR-425-5p,miR-19a-3p,miR-92a-3p和miR-20b-5p；以及血浆癌胚miRNA标志物miR-106a-5p,miR-146a-5p,miR-18a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-21-5p,miR-409-3p和miR-584-5p中两种或两种以上miRNA引物的组合；优选的，包含血清癌胚miRNA标志物miR-19b-3p,miR-20a-5p,miR-223-3p,miR-93-5p,miR-25-3p,miR-425-5p,miR-19a-3p,miR-92a-3p和miR-20b-5p以及血浆癌胚miRNA标志物miR-106a-5p,miR-146a-5p,miR-18a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-21-5p,miR-409-3p和miR-584-5p十七种miRNA标志物的引物。
一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环miRNA标志物的引物，该引物包含血清标志物let-7b-5p,miR-106a-5p,miR-10b-5p,miR-122-5p,miR-133a-3p,miR-140-3p,miR-143-3p,miR-146a-5p,miR-151a-3p,miR-16-5p,miR-192-5p,miR-195-5p,miR-19a-3p,miR-19b-3p,miR-204-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p,miR-21-5p,miR-221-3p,miR-223-3p,miR-223-5p,miR-24-3p,miR-25-3p,miR-296-5p,miR-29c-3p,miR-423-3p,miR-425-5p,miR-451a,miR-484,miR-485-3p,miR-590-5p,miR-92a-3p,miR-92b-3p和miR-93-5p；以及血浆标志物let-7b-5p,miR-106a-5p,miR-122-5p,miR-125b-5p,miR-140-3p,miR-142-3p,miR-144-3p,miR-146a-5p,miR-151a-5p,miR-17-5p,miR-181a-5p,miR-185-5p,miR-18a-5p,miR-192-5p,miR-193b-3p,miR-19b-3p,miR-205-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-2110,miR-21-5p,miR-221-3p,miR-223-3p,miR-25-3p,miR-409-3p,miR-425-5p,miR-451a,miR-486-5p,miR-584-5p,miR-92b-3p和miR-93-5p中的一种或多种miRNA的引物；优选为包含上述所有血清标志物和血浆标志物的引物。
上述的引物在辅助诊断泛肿瘤或制备泛肿瘤辅助诊断试剂盒中的应用。
一种泛肿瘤辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含有血清标志物let-7b-5p,miR-106a-5p,miR-10b-5p,miR-122-5p,miR-133a-3p,miR-140-3p,miR-143-3p,miR-146a-5p,miR-151a-3p,miR-16-5p,miR-192-5p,miR-195-5p,miR-19a-3p,miR-19b-3p,miR-204-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p,miR-21-5p,miR-221-3p,miR-223-3p,miR-223-5p,miR-24-3p,miR-25-3p,miR-296-5p,miR-29c-3p,miR-423-3p,miR-425-5p,miR-451a,miR-484,miR-485-3p,miR-590-5p,miR-92a-3p,miR-92b-3p和miR-93-5p；以及血浆标志物let-7b-5p,miR-106a-5p,miR-122-5p,miR-125b-5p,miR-140-3p,miR-142-3p,miR-144-3p,miR-146a-5p,miR-151a-5p,miR-17-5p,miR-181a-5p,miR-185-5p,miR-18a-5p,miR-192-5p,miR-193b-3p,miR-19b-3p,miR-205-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-2110,miR-21-5p,miR-221-3p,miR-223-3p,miR-25-3p,miR-409-3p,miR-425-5p,miR-451a,miR-486-5p,miR-584-5p,miR-92b-3p和miR-93-5p中的一种或多种miRNA的引物；优选为包含上述所有血清标志物和血浆标志物的引物。
一种泛肿瘤辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含有血清癌胚miRNA标志物miR-19b-3p,miR-20a-5p,miR-223-3p,miR-93-5p,miR-25-3p,miR-425-5p,miR-19a-3p,miR-92a-3p和miR-20b-5p以及血浆癌胚miRNA标志物miR-106a-5p,miR-146a-5p,miR-18a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-21-5p,miR-409-3p和miR-584-5p中两种或两种以上miRNA的引物；进一步优选的，该试剂盒包含癌胚血清miR-19b-3p,miR-20a-5p,miR-223-3p,miR-93-5p,miR-25-3p,miR-425-5p,miR-19a-3p,miR-92a-3p和miR-20b-5p以及癌胚血浆miR-106a-5p,miR-146a-5p,miR-18a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-21-5p,miR-409-3p和miR-584-5p十七种miRNA的引物。
上述的试剂盒中还可以包括PCR技术常用的试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。
本发明所涉及的与泛肿瘤诊断相关的循环miRNA标志物let-7b-5p，miR-106a-5p，miR-10b-5p，miR-122-5p，miR-125b-5p，miR-133a-3p，miR-140-3p，miR-142-3p，miR-143-3p，miR-144-3p，miR-146a-5p，miR-151a-3p，miR-151a-5p，miR-16-5p，miR-17-5p，miR-181a-5p，miR-185-5p，miR-18a-5p，miR-192-5p，miR-193b-3p，miR-195-5p，miR-19a-3p，miR-19b-3p，miR-204-5p，miR-205-5p，miR-20a-5p，miR-20b-5p，miR-210-3p，miR-2110，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-223-3p，miR-223-5p，miR-24-3p，miR-25-3p，miR-296-5p，miR-29c-3p，miR-409-3p，miR-423-3p，miR-425-5p，miR-451a，miR-484，miR-485-3p，miR-486-5p，miR-584-5p，miR-590-5p，miR-92a-3p，miR-92b-3p和miR-93-5p中的每种miRNA的序列均已公开，但是将各miRNA标志物进行组合作为泛肿瘤辅助诊断标志物需要本领域技术人员付出创造性劳动。各miRNA标志物的扩增引物均可通过市场购买获得，本发明实施例中使用的循环miRNA标志物的引物为购自广州锐博公司所合成生产的特异性miRNA茎环RT-PCR引物，但不限于此。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血清及血浆miRNA差异表达谱分析：分析包括常见的15类常见的肿瘤患者和年龄性别匹配的正常对照人群中差异表达的循环miRNA，并对差异表达miRNAs进行进一步大样本多阶段验证。(3)通过多阶段的验证，明确这些miRNA诊断15类常见的肿瘤的能力。(4)通过纳入并分析脐带血与正常成年人群中差异表达的循环miRNA，与泛肿瘤的miRNA差异表达谱进行比较分析获得癌胚miRNA，明确癌胚miRNA诊断泛肿瘤的能力。(5)循环miRNA诊断试剂盒的研制：根据泛肿瘤患者与正常人群血清及血浆中的差异表达miRNA以及癌胚miRNA开发miRNAs诊断试剂盒，实现对临床常见的15类泛肿瘤患者的无创辅助诊断。(6)分析这些miRNA在泛肿瘤组织中的表达情况，揭示这些miRNA与临床常见的15类泛肿瘤的关系，为将来研制可能与这些miRNA相关的治疗泛肿瘤的药物提供依据。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料，并采用了Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及qRT-PCR方法等。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本选择：初治、未行手术以及放化疗干预且经病理确认为临床常见的15类泛肿瘤患者(具体包括：鼻咽癌、甲状腺癌、食管癌、肺鳞癌、肺腺癌、贲门癌、胃腺癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌和卵巢癌)以及新生儿脐带血。正常对照为在医院进行体检的正常成年人群。
2.Exiqon miRNA qPCR panel芯片初筛：利用TRIZOL-LS试剂对血清、血浆样本进行RNA提取，并进行qRT-PCR操作获得初筛结果。
3.训练集、测试集以及额外验证集：利用AM1556试剂盒(ABI公司)对每个血清、血浆样本进行RNA提取，通过逆转录反应得到cDNA样品，加入PCR引物和SYBR Green荧光染料进行PCR反应。通过比对spike-in control的Ct值，利用相对定量法获得样本中的miRNA的相对含量。
4.统计分析：运用χ2检验、配对t检验以及非参数秩和检验比较miRNA表达水平在不同研究组中的差异。分析泛肿瘤患者中的差异miRNA与脐带血中的差异miRNA具有一致的表达趋势，则认定为癌胚miRNA。通过计算ROC曲线分析证实血清及血浆miRNA的诊断价值。
本发明研究组目前通过对临床常见的15类泛肿瘤患者(具体包括：鼻咽癌、甲状腺癌、食管癌、肺鳞癌、肺腺癌、贲门癌、胃腺癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌和卵巢癌)以及新生儿脐带血的血清及血浆中的miRNA进行系统的表达分析，现已发现了一组具有临床诊断潜能的泛肿瘤循环miRNA标志物(血清标志物let-7b-5p,miR-106a-5p,miR-10b-5p,miR-122-5p,miR-133a-3p,miR-140-3p,miR-143-3p,miR-146a-5p,miR-151a-3p,miR-16-5p,miR-192-5p,miR-195-5p,miR-19a-3p,miR-19b-3p,miR-204-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p,miR-21-5p,miR-221-3p,miR-223-3p,miR-223-5p,miR-24-3p,miR-25-3p,miR-296-5p,miR-29c-3p,miR-423-3p,miR-425-5p,miR-451a,miR-484,miR-485-3p,miR-590-5p,miR-92a-3p,miR-92b-3p和miR-93-5p以及血浆标志物let-7b-5p,miR-106a-5p,miR-122-5p,miR-125b-5p,miR-140-3p,miR-142-3p,miR-144-3p,miR-146a-5p,miR-151a-5p,miR-17-5p,miR-181a-5p,miR-185-5p,miR-18a-5p,miR-192-5p,miR-193b-3p,miR-19b-3p,miR-205-5p,miR-20a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-2110,miR-21-5p,miR-221-3p,miR-223-3p,miR-25-3p,miR-409-3p,miR-425-5p,miR-451a,miR-486-5p,miR-584-5p,miR-92b-3p和miR-93-5p。以及癌胚miRNA标志物：其中血清癌胚miRNA标志物miR-19b-3p,miR-20a-5p,miR-223-3p,miR-93-5p,miR-25-3p,miR-425-5p,miR-19a-3p,miR-92a-3p和miR-20b-5p；血浆癌胚miRNA标志物miR-106a-5p,miR-146a-5p,miR-18a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-21-5p,miR-409-3p和miR-584-5p)。
本发明的有益效果：
1.相较于传统的肿瘤标志物，循环miRNA作为新型的生物标志物，具有稳定性好、微创易获取、灵敏性和特异性高的特点。这类分子标志物的开发利用将为包括肿瘤在内的各种疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。
2.研究者通过Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的相对定量法，对泛肿瘤以及脐带血和正常对照人群血清及血浆中的差异表达miRNA进行严密、多阶段的验证和评价。证实了循环miRNA以及癌胚miRNA作为诊断泛肿瘤的无创标记物的可靠性以及可重复性。
3.研究者发现利用TCGA数据库分析发现，血清癌胚miRNA标志物miR-19b-3p,miR-20a-5p,miR-223-3p,miR-93-5p,miR-25-3p,miR-425-5p,miR-19a-3p,miR-92a-3p和miR-20b-5p以及血浆癌胚miRNA标志物miR-106a-5p,miR-146a-5p,miR-18a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-21-5p,miR-409-3p和miR-584-5p在泛肿瘤组织标本中大部分都是高表达的状态，与癌胚miRNA在相应肿瘤中的表达一致。这些结果将给未来研究miRNA对于泛肿瘤的机制以及针对这些miRNA对于泛肿瘤的治疗提供新的思路。
附图说明
图1：实验流程图(除了贲门癌、胃癌、卵巢癌的血清样本以及卵巢癌的血浆样本采用了初筛、验证集和测试集三阶段，其余所有研究均采用初筛、验证集、测试集和额外验证集四阶段)
图2：在脐带血中的血清及血浆中分别高表达的18和16个miRNA
A：血清样本；B：血浆样本
图3：在15种临床常见的泛肿瘤中获得的可用于诊断相对应肿瘤的miRNA总览。
A：根据15种肿瘤相对应的瘤种获得的用于诊断该肿瘤的miRNA；B：用于诊断泛肿瘤的循环miRNA(左图：血清；右图：血浆)及癌胚miRNA(红色标记)在染色体上的位置
图4：血清癌胚miRNA(A-H)和血浆癌胚miRNA(I-N)诊断泛肿瘤的能力。
图5：癌胚miRNA在TCGA组织库中泛肿瘤中的表达情况。
具体实施方式
发明人于2010年至2018年从南京医科大学第一附属医院收集了大量的泛肿瘤患者(具体包括：鼻咽癌、甲状腺癌、食管癌、肺鳞癌、肺腺癌、贲门癌、胃腺癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌和卵巢癌)以及新生儿脐带血和正常体检人群的血清及血浆样品，通过对样品资料的整理，从中选择了3831例肿瘤标本(2050例血清标本和1781例血浆标本)、248例脐带血标本(120例血清标本和128例血浆标本)以及相匹配的共4148例正常成年人对照(2119例血清标本和2029例血浆标本)的样本作为Exiqon miRNAqPCR panel芯片初筛和后续一系列qRT-PCR验证的实验样品。所选择的患者血清及血浆样本均来自于初治、未行手术以及放化疗干预且经病理确认为肿瘤的病人。脐带血为婴儿分娩之后即立即采集的婴儿脐带血。并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料。具体各瘤种、脐带血及正常对照样本的总例数及分阶段的例数见附表中的表1。
参照流程图(图1)，从泛肿瘤、脐带血以及正常对照血清、血浆样本中各随机选择了20/30/40例泛肿瘤或者脐带血样本以及10例正常对照，分别混合成了相对应的肿瘤或者脐带血血清、血浆混合样本各2/3/4例和正常混合样本1个(一个混合样本由10例200ul血清或血浆样本汇合形成2ml的样本)。对这些混合样本进行Exiqon miRNA qPCR panel芯片初筛和分析，具体步骤参照Exiqon miRNA qPCR panel芯片的说明书：
1.血清/血浆抽提
取出血清/血浆样品，样品化冻后3000g离心5min去除一些碎片及一些不溶成分。转移上清至新的1.5ml管中，加入750ul TRIZOL-LS后，剧烈震荡5s。
2.两相分离
匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟。每1ml的TRIZOL-LS试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下13,000g离心15分钟。
3.RNA沉淀
将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为：每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL-LS试剂的同时加0.5ml的异丙醇和5ul的糖元。4℃静置半小时，让RNA尽可能的析出。于4℃13,000g离心15分钟。
4.RNA清洗
移去上清液，每1ml TRIZOL-LS试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％(v/v)乙醇，清洗RNA沉淀。静置10分钟，然后4℃下10000g离心5分钟。
5.重新溶解RNA沉淀
去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。
6.测量浓度：
通常能得到～5μg RNA/50ml血清/血浆。
7.cDNA合成
(1)稀释模板RNA：使用DEPC水将20－25ng模板RNA稀释至14ul。
(2)准备反应液：将5×Reaction Buffer以及DEPC水置于冰上溶解，并震荡混匀。Enzyme mix置于-20℃冰盒，使用前轻弹混匀后置于冰上。所有试剂均离心后使用。
(3)配置反应液：配置下表中的反应液
Figure BDA0002383232960000091
(4)混合并离心试剂：震荡或者抽吸混匀反应液后离心，以保证所有溶液彻底混合均匀。
(5)逆转录反应及热失活：将反应液于42℃温育60分钟后，于95℃温育5分钟以失活逆转录酶。
8.Real-Time PCR
试剂：
Nuclease free water(Exiqon)
SYBRTM Green master mix(Exiqon)
cDNA模板
ROX(Invitrogen)
miRNA PCR ARRAY(Exiqon)
仪器：
ABI PRISM7900 system(Applied Biosystems)
(1)准备Real-time PCR试剂：将制备的cDNA模板，DEPC水和SYBRTM Green mastermix置于冰上溶解15-20分钟。
(2)稀释cDNA模板：将RT反应获得的cDNA模板用nuclease free water稀释110倍(例如，向20μl反应液中加入2180ul nuclease free water)。
(3)混合所有反应试剂：
A.将PCR板简单离心后，移去封膜。
B.将110倍稀释的cDNA模板与2×SYBR Green master mix按照1：1混合。
C.倒置混匀反应液并离心。
D.将混合反应液加入板中的每个孔。
E.重新封好PCR板。
(4)将PCR板简单低温离心
(5)Real-time PCR扩增：根据下表中的反应条件进行Real-time PCR扩增和溶解曲线分析。
Real-time PCR循环条件如下表：
Figure BDA0002383232960000101
数据分析：采用ΔΔCt方法
使用PCR仪器附带的软件进行初步数据分析，获得原始的Cq值(Cp或Ct，依仪器不同名称可能不同)。
我们建议使用GenEx qPCR分析软件(www.exiqon.com/mirna-pcr-analysis)对数据进行标准和深入的数据分析。
a.计算每个处理组中的每个通路相关基因的ΔCt。
ΔCt(group 1)＝average Ct–average of HK genes’Ct for group 1array
ΔCt(group 2)＝average Ct–average of HK genes’Ct for group 2array
b.计算2个PCR Array(或两组)中每个基因的ΔΔCt。
ΔΔCt＝ΔCt(组2)-ΔCt(组1)
备注：通常组1是对照，组2是实验组。
c.通过2-ΔΔCt计算组2与组1对应基因的表达差异。
在芯片初筛后，分别得到了相对应的肿瘤及脐血相对应的血清和血浆差异表达miRNA(每个肿瘤、脐血的血清/血浆混合样本中相对于正常样本都超过了1.5倍差异可被选为备选miRNA)。
对于初筛得到的各瘤种及脐血中差异表达的血清miRNA和血浆miRNA，通过训练集、测试集及额外验证集(贲门癌、胃癌、卵巢癌的血清样本以及卵巢癌的血浆样本采用了初筛、验证集和测试集三阶段)，采用基于qRT-PCR的相对定量法进行验证，具体步骤为：
1.血清/血浆RNA提取：选用ABI公司血清RNA提取试剂盒(AM1556)，参照试剂盒说明，每个样本吸取200ul进行提取RNA，并最后用100ul DEPC水进行溶解。
2.cDNA的制备：
1)采用50μL反应体系进行逆转录实验
Figure BDA0002383232960000102
Figure BDA0002383232960000111
2)上述反应之后再反应体系中再加入如下反应物
Figure BDA0002383232960000112
3.qPCR1)采用5μL反应体系，按以下比例进行试验
Figure BDA0002383232960000113
反应体系混匀，瞬时离心后，放置于实时定量PCR仪中，以下列程序进行反应：
Figure BDA0002383232960000114
Figure BDA0002383232960000121
反应结束后添加溶解曲线。
数据分析：利用SPSS 16.0软件进行统计分析，对在训练集、测试集以及额外验证集中均一致差异表达的miRNA认定为该肿瘤的诊断标志物。在泛肿瘤患者血清及血浆中各阶段一致差异表达的miRNA见附表中的表2。
同时，通过脐带血与正常成人样本的分析，获得脐血血清差异表达miRNA以及血浆差异表达miRNA(图2)，脐血血清中差异表达的miRNA见附表的表3。脐血血浆中差异表达的miRNA见附表的表4。
对所有15种肿瘤及脐血中的差异miRNA进行分析(图3)，得到9个血清癌胚miRNA(分别为miR-19b-3p,miR-20a-5p,miR-223-3p,miR-93-5p,miR-25-3p,miR-425-5p,miR-19a-3p,miR-92a-3p和miR-20b-5p)及8个血浆癌胚miRNA(分别为miR-106a-5p,miR-146a-5p,miR-18a-5p,miR-20b-5p,miR-210-3p,miR-21-5p,miR-409-3p和miR-584-5p)。进一步分析这些癌胚miRNA对相应的肿瘤的诊断能力。如图4，血清癌胚miRNA(A-H分别为：鼻咽癌、甲状腺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肺鳞癌、乳腺癌和子宫内膜癌)及血浆癌胚miRNA(I-N分别为：鼻咽癌、食管癌、胃癌、肺鳞癌、肺腺癌和子宫内膜癌)能很好的诊断出相应的肿瘤患者。
研究组之后进一步对这些癌胚miRNA在TCGA数据库中泛肿瘤组织中的表达进行了分析，如图5所示，这些miRNA大多数在泛肿瘤中呈高表达，这些结果将给未来研究miRNA对于泛肿瘤的机制以及针对这些miRNA对于泛肿瘤的治疗提供新的思路。
试剂盒包括一批血清及血浆miRNA qRT-PCR引物，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水，荧光探针，RNA酶抑制剂，Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的正常人样本等)。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光法检测血清/血浆样本中miRNA的表达含量，来辅助诊断该样本来源患者的患泛肿瘤的可能性。血清及血浆miRNA检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断以及进一步的个体化治疗。
Figure BDA0002383232960000131
Figure BDA0002383232960000141
Figure BDA0002383232960000151
Figure BDA0002383232960000161
Figure BDA0002383232960000171

Claims (2)

1.检测血清癌胚miRNA标志物miR-19b-3p, miR-20a-5p, miR-223-3p, miR-93-5p,miR-25-3p, miR-425-5p, miR-19a-3p, miR-92a-3p和miR-20b-5p；以及血浆癌胚miRNA标志物miR-106a-5p, miR-146a-5p, miR-18a-5p, miR-20b-5p, miR-210-3p, miR-21-5p,miR-409-3p和miR-584-5p十七种 miRNA表达水平的引物在制备泛肿瘤辅助诊断试剂盒中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒中还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC 水、荧光探针、RNA 酶抑制剂和Taq 酶。
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