CN112176060B - 一组血浆非编码rna及检测其表达水平的引物组与结直肠癌检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一组血浆非编码RNA及检测其表达水平的引物组与结直肠癌检测试剂盒，该血浆非编码RNA是由碱基序列依次如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.6所示的血浆非编码RNA组成，检测该血浆非编码RNA组的引物组序列依次如组SEQ ID NO.7‑SEQ ID NO.18所示，该引物组可应用于制备结直肠癌检测试剂盒；本申请首次联合应用血浆miRNA、lnc RNAs生物标志物，相比于单个生物标志物，提高了结直肠肿瘤诊断的灵敏性和特异性，对早期诊断结直肠癌、术后监测肿瘤复发具有重大临床意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及临床医学领域，涉及与结直肠癌发生发展相关的血浆中的一组非编码RNA及其引物组在制备早期筛查结直肠肿瘤、术后监测结直肠肿瘤复发检测试剂盒中的应用。
背景技术
结直肠癌(CRC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一，具有发病率高、病死率高、预后差等特点。据统计，结直肠癌的发病率和死亡率分别居癌症的第3位和第2位。近年来，随着医学科学的不断发展和诊疗技术不断提高，包括新辅助、外科手术、免疫治疗在内的多种治疗方式取得了很大的进步，许多的结直肠癌病人获得规范治疗，并且可以取得较好疗效，但在结直肠癌的早期诊断、术后监测复发和转移仍是影响患者生存率和生活质量的主要问题。
目前，公认的在结直肠癌的诊断和术后监测有意义的肿瘤标记物包括癌胚抗原(CEA)和糖类抗原19-9(CA19-9)。其中，癌胚抗原(CEA)变化水平是结直肠肿瘤患者早期诊断、术后监测复发重要参考指标。然而，在实际的临床应用中，普遍认为CEA的敏感性和特异性并不理想，尤其缺乏对早期结直肠肿瘤的诊断价值，且仅有45％的患者升高。因此，加强在结直肠癌治疗方式的探索的同时，寻找高灵敏度、高特异性的新诊断标记物以达到更早的诊断结直肠癌的目的，对提高结直肠癌的治疗效果和增加结直肠癌患者的生存率和生活质量具有重大意义。
非编码RNA指不编码蛋白的RNA，包括短小非编码单链小分子RNA(microRNA，即miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，即lncRNA)等。近年来，miRNA和lncRNA在肿瘤的发生、发展中得到了广泛的关注，相关的研究已经展开并在不断深入。研究显示，非编码RNA在肿瘤组织和细胞中表达有显著组织特异性和肿瘤相关性。但miRNA和lncRNA的在临床应用研究中通常受到多方面影响，例如肿瘤组织标本来源有限、检测方法繁琐等。
研究发现外周血中非编码RNA的表达同样具有特异性，而外周血标本的获取十分简单，如果能在外周血中寻找出理想的肿瘤生物标志物，对早期诊断肿瘤具有重大意义。但现有外周血中非编码RNA标志物检测存在假阳性干扰，且由于非编码RNA表达量较低，对检测的要求较高，不宜临床大规模推广使用，同时现有研究中未能将结直肠癌(CRC)与结直肠腺瘤(CRA)区分开来，间接影响了其在结直肠肿瘤诊断的准确性和阳性率。目前尚未见针对结直肠癌的病人外周血非编码RNA相关的研究报道。
发明内容
针对现有直肠癌检测标志物miRNA及或lncRNA表达差异有限的情况，本申请提供一组miRNA和lncRNA血浆标志物，他们联合用于结直肠癌检检测试剂盒的制备。
具体而言，本申请是通过以下技术方案实现的：
本申请首先提供了一组血浆非编码RNA，编码这些RNA的DNA碱基序列分别如SEQID NO.1(miR-20b-5p)、SEQ ID NO.2(miR-329-3p)、SEQ ID NO.3(miR-374b-5p)、SEQ IDNO.4(miR-503-5p)、SEQ ID NO.5(XLOC_001120)、SEQ ID NO.6(ENSG0000243766.2)组成。可利用ROC、RSA统计学方法对该组血浆非编码RNA(包括miRNA和lncRNA)的表达谱进行验证分析，进一步用于辅助诊断结直肠癌以及鉴别结直肠癌、结直肠腺瘤、正常人群。
其次，本申请还提供了用于检测细胞和组织中的上述血浆长链非编码RNA表达水平的引物组，包括：核苷酸序列分别如SEQ ID No.7(上游)和SEQ ID No.8(下游)所示的检测血浆非编码RNA miR-20b-5p的引物、核苷酸序列如SEQ ID No.9(上游)和SEQ ID No.10(下游)所示的检测血浆非编码RNA miR-329-3p的引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.11(上游)和SEQ ID No.12(下游)所示的检测血浆非编码RNA miR-374b-5p的引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.13(上游)和SEQ ID No.14(下游)所示的检测血浆非编码RNA miR-503-5p的引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.15(上游)和SEQ ID No.16(下游)所示的检测血浆非编码RNA XLOC_001120的引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.17(上游)和SEQ ID No.18(下游)所示的检测血浆非编码RNA ENSG0000243766.2的引物对。
第三，本申请提供了核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所述的引物组在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用。
第四，本申请提供了包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.18所述引物组的结直肠癌检测试剂盒；该试剂盒将上述引物联合用于诊断、监测结直肠癌的发生发展。
第五，进一步地，该检测试剂盒还包括含有半定量RT-PCR内参β-Actin、U6、18S的上下游引物，这些引物均为本领域常见的引物，如该内参β-Actin的半定量RT-PCR引物序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，U6的引物序列如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示，18S的引物序列如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示。
第六，进一步而言，该检测试剂盒还含有RT-PCR反应所需的下列成分：5×PCRbuffer,10mM dNTPs,Taq酶,ddH2O等PCR试剂盒常见组分。
血浆中存在多种miRNA和lncRNA，其性质稳定，易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，本申请通过分离和比较正常对照、大肠腺瘤患者和结直肠癌患者血浆的miRNAs、lnc RNAs，发现了血浆中存在可用于评估是否患有结直肠肿瘤的特异性和敏感性的miRNA联合lnc RNAs组合，进一步提出了(碱基序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示的)结直肠癌的血浆miRNA、lnc RNAs结合体作为结直肠癌早期诊断、术后监测的标志物，以及该血浆miRNA、lnc RNAs及其引物组在制备结直肠癌诊断或监测试剂中的应用，研制出可便于临床应用的结直肠癌诊断、监测试剂盒。该检测试剂盒可以利用qRT-PCR技术检测血浆中(碱基序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示的)miRNA和lncRNA生物标志物表达量。
本申请证明了血浆中miRNA和lncRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA有望取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标志物的新境界。与现有标志物相比，其优越性在于：
(1)血浆miRNA、lnc RNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅表达稳定、诊断微创、易于检测，且定量精确，该类小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)本发明提供的血浆miRNAs、lnc RNAs标志物可用于结直肠肿瘤诊断标志物，可避免侵入性诊断，并可在早期通过微创方式获得结直肠肿瘤的患病风险，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。
(3)联合应用血浆miRNA、lnc RNAs生物标志物，采用相关的ROC、RSA统计学方法分析，相比于单个生物标志物，将进一步提高结直肠肿瘤诊断的灵敏性和特异性，对早期诊断结直肠癌、术后监测肿瘤复发具有重大临床意义和应用价值。
(4)本发明采用符合结直肠癌和健康对照人群、以及大肠腺瘤患者的样本进行验证，证明这几种标志物表达量存在显著性差异并具有稳定性，以说明该标志物具有特异性，可作为诊断标志物使用。
附图说明
图1为候选基因表达量检测示意图。
图2为个体血浆中miRNA、lnc RNAs表达稳定性的检测结果示意图。
图3为扩大样本量验证结果示意图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的包含范围不限于下述的。
实施例1研究对象选择和分组依据
本实施例目的在于建立统一的标本库和数据库，以标准的操作程序采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。另以相同方式取同期胃肠病科确诊为大肠息肉并排除结直肠癌诊断的献血者血液样本，取常规体检者血液样本。所有实验均经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准。本研究按照《赫尔辛基宣言》设定的准则进行。
具体的样品归类标准如下：
A组：健康对照组(n＝600，3人芯片筛选，597人一期验证，随机40人独立人群验证)：
1、年龄在18岁以上75岁以下的正常人群。
B组：大肠息肉组(n＝19，19人一期验证，19人独立人群验证)：
1、年龄在18岁以上75岁以下；
2、定性诊断：肠镜诊断为大肠息肉，经内镜切除息肉，术后病理诊断为良性腺瘤；3、定位诊断：息肉位于结肠/直肠；
4、排除：妊娠期或哺乳期妇女；严重精神障碍患者；五年内罹患其他恶性肿瘤；活动性溃疡性结肠炎或克罗恩病；全身应用激素。
C组：结直肠癌组(n＝597，随机3人芯片筛选，594人一期验证，随机40人独立人群验证)：
1、年龄：18-75岁；
2、定性诊断：肠镜病理活检证实为腺癌，经外科手术切除肿瘤常规病理诊断为腺癌；
3、定位诊断：肿瘤位于结肠/直肠；
4、腹盆平扫及增强CT或MRI排除远处脏器转移。
5、排除：妊娠期或哺乳期妇女；严重精神障碍患者；五年内罹患其他恶性肿瘤；活动性溃疡性结肠炎或克罗恩病；全身应用激素。
本实施例以上健康对照、结直肠癌组取3组血浆，采用高通量测序，筛选具有表达差异的非编码基因，得到了各组miRNA和lncRNA的不同表达水平。通过分析最终得到6个miRNA和6个lncRNA候选基因。分别为miR-20b-5p,miR-329-3p,miR-374b-5p,miR-503-5p，miR-21-5p,miR-24-2-5p和XLOC_001120，ENSG0000243766.2，ENST00000457302.2，ENSG00000248932.1，ENST00000440688.1，TCONS_0003661。
针对筛选获得的候选基因设计引物，其中检测miRNA候选基因：miR-20b-5p的引物核苷酸序列分为如SEQ ID No.7(上游)和SEQ ID No.8(下游)所示，检测miR-329-3p的引物核苷酸序列分别如SEQ ID No.9(上游)和SEQ ID No.10(下游)所示，检测miR-374b-5p的引物核苷酸序列分为如SEQ ID No.11(上游)和SEQ ID No.12(下游)所示，检测miR-503-5p的引物核苷酸序列分为如SEQ ID No.13(上游)和SEQ ID No.14(下游)所示；
检测lncRNA候选基因：检测XLOC_001120的引物核苷酸序列分别如SEQ ID No.15(上游)和SEQ ID No.16(下游)所示，检测ENSG0000243766.2的引物核苷酸序列分别如SEQID No.17(上游)和SEQ ID No.18(下游)所示。
而候选基因miR-21-5p,miR-24-2-5p,ENST00000457302.2，ENSG00000248932.1，ENST00000440688.1，TCONS_0003661检测结果表示在正常人群、结直肠腺瘤组和结直肠癌组中表达无明显差异，故舍去。其中，miR-21-5p的引物核苷酸序列分为如SEQ ID No.21(上游)和SEQ ID No.22(下游)所示，miR-24-2-5p的引物核苷酸序列分为如SEQ ID No.23(上游)和SEQ ID No.24(下游)所示,ENST00000457302.2的引物核苷酸序列分为如SEQ IDNo.25(上游)和SEQ ID No.26(下游)所示，ENSG00000248932.1的引物核苷酸序列分为如SEQ ID No.27(上游)和SEQ ID No.28(下游)所示，ENST00000440688.1的引物核苷酸序列分为如SEQ ID No.29(上游)和SEQ ID No.30(下游)所示，TCONS_0003661的引物核苷酸序列分为如SEQ ID No.31(上游)和SEQ ID No.32(下游)所示。
实施例2验证候选血浆miRNA生物标志物
1、总RNA提取和cDNA样品样品制备：
本实施例目的在于提取样本中的RNA、制备后续实验所需的cDNA,本例所采用的方法为常规分子生物学方法，所用试剂均为市场在售(商品/试剂)，具体实施例步骤如下：
a)取100微升血浆加入新鲜肝素抗凝血5毫升，于离心机3000转/分钟离心5分钟，吸取上清液；
b)加入900微升Trizol试剂，振荡混匀，4度，12000转/分钟离心15分钟，取上清液，弃下层废液；
c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀，转至离心柱，12000转/分钟离心15秒，取上清液，弃下层废液；
d)在离心柱上加入700微升RWT缓冲液，10000转/分钟离心15秒，弃下层废液；
e)在离心柱上加入500微升RPE缓冲液，10000转/分钟离心15秒，弃下层液。
f)重复e；
g)将离心柱加入一个新的2毫升的离心管，10000转/分钟离心1分钟，用于去除RPE缓冲液；
h)在柱子上加入50微升DEPC处理水12000转/分钟离心收集RNA；
i)通过RNA逆转录反应得到cDNA。
按试剂TrackTM miRNA qRT-PCR Starter Kit说明书配制所需的Poly(A)Tailing反应体系，如下表1所示：
表1 Poly(A)Tailing反应体系
混匀表1中上述反应体系，37℃反应1h；上述反应完成后置于冰上备用或者于-80℃保存；
配置如表2所示的冰上制备逆转录反应体系:
表2
混匀上述反应体系，42℃反应1小时，然后于72℃孵育10分钟反应完成后所得cDNA置于冰上备用或者于-20℃保存。
2、检测实施例1获得的血浆miRNA生物标志物表达量，Real-time PCR方法验证血浆miRNAs表达量：
冰上制备qPCR反应体系，按下表3配制比例配制所需的反应体系：
表3
1.轻轻混匀上述反应体系(避免剧烈涡旋振荡)，使用三步法进行qPCR反应
表4
4、检测并比较健康对照组(Control)、大肠腺瘤(良性，CRA)、结肠癌组(CRC)血浆样本中miRNAs相对表达量(相对于半定量内参β-Act in)的差异，结果如图1所示。由图1可见，候选基因非编码RNA miR-20b-5p、miR-329-3p、miR-374b-5p、miR-503-5p、XLOC_001120和ENSG0000243766.2在进行验证时，有表达差异，可作为预测CRC的有效标志物。
实施例3验证候选血浆lncRNA生物标志物
本实施例验证目的在于验证实施例1筛选获得的6个lncRNA生物标志物表达量。总RNA的提取如上述实施例2所述。逆转录后续实验所需的cDNA具体步骤如下所述：取经前处理的血浆RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。按说明书配制所需的反应体系，如下表5所示：
表5
以上体系混匀后，瞬时离心，RT反应程序为：42℃60分钟，70℃10分钟。
2.检测实施例1获得的血浆miRNA生物标志物表达量，RT-PCR方法验证血浆lncRNAs表达量：
冰上制备qPCR反应体系，如下表6所示:
表6
3.轻轻混匀上述反应体系(避免剧烈涡旋振荡)，使用三步法进行qPCR反应，检测体系如下：
表7
4.检测并比较健康对照组、大肠腺瘤、结肠癌组血浆样本中lnc RNAs表达量的差异，结果如图1所示。
实施例4个体血浆中miRNA、lnc RNAs表达量的稳定性分析
本实施例采用随机选取实施例1中3组血浆样本，等分成3分，分别进行以下处理：室温静置12小时、24小时、3个循环快速冻融试验后，采用实施例2和3相同的方法，miRNA以内源性内参U6为对照，lncRNA以内源性内参18S为对照，比较同一样本在不同暴露条件下，表达是否有差异，其中U6的引物核苷酸序列分为如SEQ ID No.33(上游)和SEQ ID No.34(下游)所示，18S的引物核苷酸序列分为如SEQ ID No.35(上游)和SEQ ID No.36(下游)所示检测结果如图2所示。
图2结果显示，血浆中miR-20b-5p、miR-329-3p、miR-374b-5p、miR-503-5p、XLOC_001120和ENSG00000243766.2表达稳定。这些都提示了这些血浆miRNA、lnc RNAs的表达量较为稳定，具备作为诊断/监测标志物的特性。
实施例5扩大样本量用于选择CRC诊断的生物标志物，分析评价选择的非编码RNA的诊断性能。
本实施例对具有明显表达差异的基因进行扩大样本量进行RT-PCR验证，验证方法同实施例2、3。随后采用ROC分析评价选择的非编码RNA的诊断性能。
扩大样本量验证结果如图3所示；Receiver Operating Characteristic(ROC曲线)、RSA分析结果如表8所示，其中训练集(即扩大样本量验证之前)mi R-20b-5p、mi R-329-3p、mi R-374b-5p、mi R-503-5p、XLOC_001120、ENSG00000243766.2的ROC曲线下方的面积大小(AUC)分别为0.800、0.908、0.950、0.867、0.925、0.650；组合后AUC为0.996。当样本量扩大到597CRC v 585Control时(扩大样本量后)，单个目的非编码RNA及其组合的AUC分别为0.682、0.852、0.914、0.734、0.676、0.684和0.954。
表8
PPV，阳性诊断率；NPV，阴性诊断率。
风险评分分析法(RSA)计算CRC和非癌样本的风险评分：通过logistic回归模型计算各血浆样本的风险值，将其风险评分作为参数。采用风险评分的计算截止值将血浆样本分为高分组(代表CRC)和低分组(代表非癌正常组)。在计算的截止值9.825下，敏感性联合特异性值最大，在训练集中，CRC的预测精度为0.97，非癌对照的预测值为0.97。然后，利用计算的截止值9.825验证其在较大验证样本中的有效性，正预测值和负预测值分别为0.96和0.77(表8)，评测6条非编码RNA作为CRC诊断标记的实用价值。
上述检测结果证明了采用血浆mi R-20b-5p、mi R-329-3p、mi R-374b-5p、mi R-503-5p、XLOC_001120、ENSG00000243766.2能够很好地将非癌组和CRC分开，可作为结直肠癌检测的标志物。
实施例6制备用于结直肠癌诊断和监测的血浆中miRNA、lnc RNAs诊断试剂盒
本实施例提供一种用于检测上述结直肠癌血浆非编码RNA的试剂盒，该试剂盒用于检测外周血的血浆中上述全部6个非编码RNA(其序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示)，该试剂盒包括：
1)上述6个非编码RNA引物对。其中，miRNA引物包括mi R-20b-5p、mi R-329-3p、miR-374b-5p、mi R-503-5p、U6的上下游引物(SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34)；Lnc RNA引物包括XLOC_001120、ENSG00000243766.2、18S的上下游引物(SEQ ID NO.35及SEQ IDNO.36)；
2)内参β-Actin的半定量RT-PCR上下游引物(SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20)；3)其他成分：PCR缓冲液,10mM dNTPs混合液,Taq酶,ddH2O。
在具体的应用中，也可采用相应的市售产品，或PCR所需的其他标准品/对照品、缓冲液、染料等成分,以满足RT-PCR检测技术的要求。
本实施例中，具体试剂盒组成如下：
1)包含的引物序列分别如：SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.18共6对引物组；这12条引物序列含量均为10μM，0.25μl；
2)0.3μl Taq酶，1μl SYBR Green染料，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl 2.5mM dNTP混合液，2μl 5×PCR缓冲液；
3)10μM内参U6、18S和β-Actin上下游引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示)各0.5μl，12.4μlddH2O。
试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于miRNA、lncRNA含量检测的相应试剂。
检测时，只需要一次抽出少量(2毫升)外周血液，按照实施例2提取血浆中的RNA，利用该试剂盒PCR技术即可检测血浆中miRNA、lnc RNAs标志物的相对表达含量，再通过该变化趋势预测结直肠癌发生可能性或诊断以及术后监测复发转移，并易于进行动态监测和观察治疗效果。
序列表
<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
<120> 一组血浆非编码RNA及检测其表达水平的引物组与结直肠癌检测试剂盒
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaagtgctc acagtgcagg tag 23
<210> 2
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttcgcttc tggtaccgga agagaggttt tctgggtctc tgtttctttg atgagaatga 60
aacacaccca gctaaccttt ttttcagtat caaatcc 97
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atataataca acctgctaag t 21
<210> 4
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgccctagca gcgggaacag ttctgcagtg agcgatcggt gctctggggt attgtttccg 60
ctgccagggt a 71
<210> 5
<211> 262
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgtgaggag aggggtgtgg gctgggtggg gtgtgagctg tgtggtgtgt gagcaggaga 60
ggggtgtgag ctgtgtggtg tgtgaggagg agaggggtgt gagctgtgtg gtgtgtgagg 120
aggagagggg tgtgagctgt ctggtgtgtg aggagagggg tgtgggctgt gtggtgtgtg 180
aggagagggg tgtgagctgt gtggtgtgtg aggaggagag gggtgtgggc tgtgtggtgt 240
gtgagcagga gaggggtgtg ag 262
<210> 6
<211> 781
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgctaaagcc tagagggtca gtggggaagg tagttagttc tgaactgaaa tgaaatcacc 60
cagggctcca gtgacttccc caacccggcc atcctgcagg agcagcgcgt aggcagcctc 120
gagtgatagc ctggtccaac ggcccacacc ttagcgccag gctcaaggaa ccggcgcgta 180
tttctgcagt gagaccacag gacggacatc ggcgccttcg gcttcgatgg agttgcgatt 240
ttgctctttc cagggaaaca gtggcagggt gtttgctgct tatcggttcc tgcggatatg 300
cctgggtccc aggacattcc actggaggct tggactgcat ttaggagccc ctatcccttc 360
cctgtccaca ctgttagtga gcaatttcat atgtttgcat ttagacccat agactcagaa 420
cgactcatca cacacacaca cagtgtacac tgacacactc acattcgcac acttaggtat 480
acagcctgat ccttgctctg acctggtaac aacgcttcct cctccagaga ctttgagata 540
gagcgagcga tccctgtgca ccattcatcc atgctcccac ctcgccagta tggctggctt 600
agttctggaa ggggcttaag aggaacaagc cccagctgtg cttctggctg ggacttaaac 660
cccccttctg ggccctaaag ccacgcttct ttgtggaccg gacctgactc tccaggaatc 720
tgggaacccg ctatttcact ctattttggg acaagaaaaa ggggctcttt ggggccactt 780
c 781
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgccgcaaag tgctcatagt g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagccacaaa agagcacaat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcggcaacac acctggttaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagccacaaa agagcacaat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcggcatata atacaacctg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagccacaaa agagcacaat 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgggctagca gcgggaacag t 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagccacaaa agagcacaat 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcgggcttag tagcttcagg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gttgggtagt tgccgtctcc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tccctgtgca ccattcatcc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caggtccggt ccacaaagaa 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctccatcctg gcctcgctgt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gctgtcacct tcaccgttcc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgggctagct tatcagactg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cagccacaaa agagcacaat 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cgccgtgcct actgagctga 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cagccacaaa agagcacaat 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgtgacctga gggactgaac 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aagccattag ccacagggaa a 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aacgaagtgc ctaatccccg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ctggagactc gtttcgcctt 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agccacatgg ctcaggattc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgccactcca tagtcaccag 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gggtgactca ctgaagacgg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ataatcgcac aggcagaggg 20
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acacggacag gattgacaga 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggacatctaa gggcatcaca 20
Claims (5)
1.用于检测血浆非编码RNA表达水平的引物组，其特征在于，所述引物组由核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18所示的引物组成。
2.如权利要求1所述的引物组在制备结直肠癌检测试剂盒中的应用。
3.一种结直肠癌检测试剂盒，其特征在于，所述结直肠癌检测试剂盒中含有如权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的结直肠癌检测试剂盒，其特征在于，所述结直肠癌检测试剂盒还包括内参U6、18S、β-Actin的引物。
5.根据权利要求3或4所述的结直肠癌检测试剂盒，其特征在于，所述结直肠癌检测试剂盒还包括：5×PCR buffer、dNTPs、 Taq酶、ddH2O。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011083864.6A CN112176060B (zh) | 2020-10-12 | 2020-10-12 | 一组血浆非编码rna及检测其表达水平的引物组与结直肠癌检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011083864.6A CN112176060B (zh) | 2020-10-12 | 2020-10-12 | 一组血浆非编码rna及检测其表达水平的引物组与结直肠癌检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112176060A CN112176060A (zh) | 2021-01-05 |
| CN112176060B true CN112176060B (zh) | 2023-06-13 |
Family
ID=73949115
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011083864.6A Active CN112176060B (zh) | 2020-10-12 | 2020-10-12 | 一组血浆非编码rna及检测其表达水平的引物组与结直肠癌检测试剂盒 |
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| Country | Link |
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105018638A (zh) * | 2015-08-25 | 2015-11-04 | 王振宁 | 胃癌发生相关分子标志物lncRNA HOTTIP的检测及应用 |
| CN111286538A (zh) * | 2020-02-13 | 2020-06-16 | 朱伟 | 一种与泛肿瘤辅助诊断相关的循环miRNA和癌胚miRNA标志物及其应用 |
| CN112609002A (zh) * | 2021-01-11 | 2021-04-06 | 中国医科大学 | 一种外周血miRNA结肠癌诊断标志物组合及其检测试剂盒 |
-
2020
- 2020-10-12 CN CN202011083864.6A patent/CN112176060B/zh active Active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105018638A (zh) * | 2015-08-25 | 2015-11-04 | 王振宁 | 胃癌发生相关分子标志物lncRNA HOTTIP的检测及应用 |
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Non-Patent Citations (3)
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| A microRNA expression signature of the postprandial state in response to a high-saturated-fat challenge;Sergio Lopez等;J Nutr Biochem;第57卷;45-55 * |
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| miR-503在结直肠癌组织和细胞中的表达及对细胞增殖、凋亡的影响;中国老年学杂志;中国老年学杂志;第36卷;369-371 * |
Also Published As
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|---|---|
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