CN112779336B

CN112779336B - 基于外泌体LncCLDN23表达水平的结直肠癌早期转移诊断试剂盒

Info

Publication number: CN112779336B
Application number: CN202110138441.8A
Authority: CN
Inventors: 张健; 李纪鹏; 郝俊; 朱军
Original assignee: Air Force Medical University of PLA
Current assignee: Air Force Medical University of PLA
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2041-02-01
Also published as: CN112779336A

Abstract

本发明公开了一种基于外泌体LncCLDN23表达水平的结直肠癌早期转移诊断试剂盒，该试剂盒包括外泌体LncCLDN23的实时定量PCR扩增引物。采集结直肠癌未转移患者外周血，离心得到血浆，提取血浆中的外泌体总RNA，将外泌体总RNA反转录成cDNA作为模板，通过实时定量PCR检测血浆中的外泌体LncCLDN23的含量，从而可以为预测结直肠癌早期转移提供重要参考。

Description

基于外泌体LncCLDN23表达水平的结直肠癌早期转移诊断试剂盒

技术领域

本发明属于肿瘤医学领域，涉及检测血浆样本中外泌体LncCLDN23的含量，以及用于根据外泌体LncCLDN23表达情况预测结直肠癌早期转移的诊断试剂盒。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，具有高发病率、高死亡率的特点，发病率和死亡率逐年上升。资料显示结直肠癌治疗失败的主要原因是术后的局部复发和远处转移。其中，大约23％的患者在就诊时已患有转移性疾病，大约40％的患者在治疗过程中发生转移，而结直肠癌的转移是导致超过一半的患者死亡的原因，且转移性结直肠癌患者的5年总生存率低于10％。也有15％的患者在肝转移被早期诊断并及早治疗后获益，其5年生存率可以提高至40％～74％，因此，检测结直肠癌早期转移对于提高患者的生存率至关重要。近年来对结直肠癌患者出现转移进行早期判断和预测已经成为临床研究的热点之一。

目前许多研究都集中在可以预测原发性肿瘤的转移部位的生物标记物方面。但由于血清肿瘤标志物的检测对转移的预测价值不高，例如CEA、CA19-9等肿瘤标志物，仅能预测发生肿瘤的可能性，而不能预测肿瘤是否转移。外泌体的功能之一是作为细胞间通讯的介质，与肿瘤的增殖、凋亡、耐药和转移息息相关。而作为主要的活性物质之一的非编码RNA，是肿瘤外泌体发挥以上功能的生物学基础。非编码RNA主要包括微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，环状RNA(ciRNA)等。其中以LncRNA与miRNA的功能研究较为充分与透彻。长链非编码RNA是一类长度超过200个核苷酸的转录本。随着对LncRNAs的研究不断深入，大量研究证实LncRNAs在肿瘤组织中差异表达并且在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。肿瘤细胞内的LncRNAs可被包裹进外泌体，经细胞分泌进入血液循环，这使得外泌体LncRNAs成为一种潜在的肿瘤诊断及预后生物标记物。

Claudin家族是相对分子质量为20～27×10³、含4个跨膜结构域的蛋白，是细胞间紧密连接的结构性及功能性组成成分，在维持细胞的排列、黏附以及细胞间的物质转运方面发挥着重要作用。人类Claudin-23基因序列在2003年首次被KATO等报道，目前关于Claudin-23与结直肠癌的相关性的研究极少。既往研究表明Claudin-23基因在结直癌组织的表达较正常组织降低，但这些研究仅是针对Claudin-23的mRNA在结直肠癌组织中的表达情况进行检测，并未涉及LncRNA，例如LncCLDN23。LncCLDN23的NONCODE TRANSCRIPT ID为NONHSAT124878.2；NONCODE Gene ID为NONHSAG049472.3，Chromosome为chr8，Start Site为8555272，End Site为8577595。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于外泌体LncCLDN23表达水平的结直肠癌早期转移诊断试剂盒，该试剂盒可以通过对血浆中的外泌体LncCLDN23的含量进行分析，提高对结直肠癌早期转移诊断的准确性，改善结直肠癌患者的预后状况。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测血浆中外泌体LncCLDN23含量的方法，包括以下步骤：

1)提取结直肠癌患者血浆中的外泌体总RNA；

2)以所述外泌体总RNA的反转录本(反转录本是将外泌体总RNA进行反转录而得到的cDNA)为模板，通过实时定量PCR扩增血浆中的外泌体LncCLDN23对应的cDNA序列；

3)扩增结束后确定外泌体LncCLDN23对应的cDNA序列的扩增循环阈值Ct(简称外泌体LncCLDN23的扩增循环阈值Ct)。

优选的，所述步骤1)具体包括以下步骤：对采集的结直肠癌未转移患者(例如，通过影像学检测未发现转移病灶)外周血进行离心，得到血浆，从该血浆中抽提得到外泌体总RNA。

优选的，所述步骤2)中，实时定量PCR的扩增引物对为：

上游引物LncCLDN23F：5`-AGCTACCAAAGACCACTGCC-3`

下游引物LncCLDN23R：5`-GTGGCCCAGAGTTACCTGTC-3`。

优选的，所述步骤2)中，实时定量PCR的扩增反应体系包括40～400nmol/L上游引物以及40～400nmol/L下游引物。

优选的，所述步骤2)中，实时定量PCR的扩增反应程序为：1)95℃30s；2)95℃5s，60℃30～34s，共40个循环。

一种结直肠癌早期转移诊断试剂盒，该试剂盒包括用于对结直肠癌患者血浆中外泌体LncCLDN23的含量进行分析的检测试剂。

优选的，所述检测试剂包括外泌体LncCLDN23对应的cDNA序列的实时定量PCR扩增引物对(即上述上游引物LncCLDN23F和下游引物LncCLDN23R)。

优选的，当结直肠癌未转移患者血浆中外泌体LncCLDN23的扩增循环阈值Ct或相对表达量在限值以内(例如，LncCLDN23的扩增循环阈值Ct≤29，内参基因的扩增循环阈值Ct为18～20)时，则表明该患者血浆中外泌体LncCLDN23的表达水平高，无转移风险，当结直肠癌未转移患者血浆中外泌体LncCLDN23的扩增循环阈值Ct或相对表达量超出限值(例如，LncCLDN23的扩增循环阈值Ct>29，内参基因的扩增循环阈值Ct为18～20)时，则表明该患者血浆中外泌体LncCLDN23的表达水平偏低，存在转移风险。

本发明的有益效果体现在：

本发明依据高通量测序所筛选出的与结直肠癌转移密切相关的外泌体LncCLDN23(分析发现结直肠癌转移患者血浆中外泌体LncCLDN23表达下调，大量临床样本验证与测序结果一致)开发诊断试剂盒，诊断结果不受外泌体LncCLDN23在结直肠癌转移与未转移患者癌组织中表达差异不明显的影响，可以通过检测结直肠癌未转移患者血浆中的外泌体特异性LncCLDN23的表达，预测结直肠癌早期转移的发生，且不易受其他基础疾病影响，从而为结直肠癌患者临床用药、营养支持提供准确、可靠的参考标准。本发明的诊断试剂盒是基于外泌体RNA提取及LncRNA检测等成熟技术而开发，只需要采集少量血液，适用于大多数结直肠癌患者，并且可快速、方便的获得诊断结果。

进一步的，本发明通过对实时定量PCR扩增引物的序列设计，可以对结直肠癌患者血浆中外泌体特异性LncCLDN23的表达变化进行快速、准确、可靠的检测。

附图说明

图1A为所提取外泌体的电镜(TEM)鉴定。

图1B为所提取外泌体的纳米颗粒跟踪分析(NTA)。

图1C为所提取外泌体的Western Blotting鉴定。

图2为5例结直肠原位癌患者和5例结直肠癌淋巴结转移患者的血浆外泌体的高通量测序分析结果。

图3为筛选出的LncCLDN23在结直肠癌患者血浆中的表达情况；其中：n0代表结直肠原位癌组；n+代表结直肠癌淋巴结转移组；***P≤0.05，具有统计学差异。

图4为筛选出的LncCLDN23在结直肠癌患者组织中的表达情况；其中：(A)LncCLDN23在结直肠癌组织(Tumor)和癌旁组织(Normal)中的表达情况；(B)LncCLDN23在结直肠原位癌组n0和结直肠癌淋巴结转移组n+的组织中的表达情况；**P＜0.01，具有显著统计学差异；ns无统计学差异。

图5为敲低LncCLDN23后结直肠癌细胞系HCT-116、SW620的细胞增殖情况；其中：NC为敲低干扰RNA(SiRNA)阴性对照；si-1为敲低干扰RNA1；si-2为敲低干扰RNA2；**P＜0.01具有显著统计学差异；***P＜0.001具有极其显著统计学差异。

图6为敲低LncCLDN23后结直肠癌细胞系HCT-116、SW620的细胞侵袭情况；其中：N-cad、E-cad分别为转移相关促癌因子和抑癌因子；NC为敲低干扰RNA(SiRNA)阴性对照；si-1为敲低干扰RNA1；si-2为敲低干扰RNA2；ns无统计学差异；*P＜0.05具有统计学差异；**P＜0.01具有显著统计学差异；***P＜0.001具有极其显著统计学差异。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

1、样本的收集

登记患者详细信息，用5mL抗凝采血管采集结直肠癌患者的外周血，并将外周血样本在采集后30min内于4℃、1000g离心15min，取上清，即为血浆；同时收集结直肠癌患者的癌组织标本和癌旁组织标本；分别标记，冻存至-80℃冰箱。每位患者的样本分为三部分：血浆、癌旁组织、癌组织。采集地点：空军军医大学第一附属医院消化病医院；采集时间：2019年8月-2020年8月；外周血和组织都是同一天收集，手术当天早上收集外周血，手术时收集组织。

2、筛选结直肠癌患者血浆外泌体中与结直肠癌淋巴结转移相关的LncRNAs

2.1血浆外泌体提取与全转录组测序

随机提取5例结直肠原位癌患者和5例结直肠癌淋巴结转移患者的血浆外泌体，将-70℃冻存的外泌体样本送往北京恩泽康泰生物科技有限公司，对样本进行全转录组测序。

其中，血浆外泌体的提取采用外泌体快速提取试剂盒(试剂盒的使用分为两个阶段，第一阶段提取外泌体)，包括以下步骤：

1)用5mL抗凝采血管采集结直肠癌患者外周血，并将样本在采集后30min内于4℃、1000g离心15min，取上清，即为血浆；

2)使用0.8μm滤器将所得血浆(1～2mL)过滤至5mL EP管中，以去除细胞碎片及较大细胞囊泡；

3)向EP管中加入等体积的XBP Buffer(上步血浆与XBP Buffer比例是1:1)，立即轻柔颠倒混匀5次；

4)将混合液转移至exoEasy spin column离心柱中，500g离心1min，丢弃液体，并将柱子放回收集管中(若柱子膜上仍有液体，5000g再次离心1min)；

5)向离心柱中加入3.5mL XWP Buffer，5000g离心5min，丢弃液体及收集管；

6)将离心柱放置于新的收集管中，400μL XE Buffer洗脱，5000g离心5min，所得洗脱液即为外泌体溶液。

参见图1A、图1B及图1C，所提取的外泌体的鉴定结果具体如下：

1)电镜显示：外泌体形态结构完整，分布均匀；

2)纳米颗粒跟踪分析(NTA)结果显示：外泌体的粒径(直径)在125nm左右；

3)Western Blotting显示：外泌体表达膜标记分子CD9、CD81以及囊内标记分子TSG-101。

2.2筛选与结直肠癌淋巴结转移相关的差异性表达LncRNAs

根据对5例结直肠原位癌患者和5例结直肠癌淋巴结转移患者血浆外泌体的全转录组进行高通量测序的结果，分析结直肠原位癌患者和结直肠癌淋巴结转移患者血浆外泌体中LncRNAs表达谱的变化，从而筛选出在结直肠癌淋巴结转移患者外泌体中差异性表达倍数最大的5个LncRNAs作为候选分子，其中，LncCLDN23(图2)和另一个LncRNA经临床样本验证与测序结果一致。

3、验证LncCLDN23与结直肠癌转移的关系

3.1依据高通量测序筛选出的与结直肠癌淋巴结转移相关的差异性表达倍数最大的候选分子LncCLDN23，通过实时定量PCR对其在结直肠癌转移患者血浆外泌体中的表达情况进行验证。

3.1.1 LncCLDN23及内参基因扩增引物设计

上游引物LncCLDN23F：5`-AGCTACCAAAGACCACTGCC-3`

下游引物LncCLDN23R：5`-GTGGCCCAGAGTTACCTGTC-3`

上游引物GAPDHF：5`-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3`

下游引物GAPDHR：5`-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3`

3.1.2结直肠癌患者血浆外泌体总RNA提取

外泌体总RNA提取采用外泌体快速提取试剂盒(试剂盒的使用分为两个阶段，第二阶段提取外泌体总RNA)，包括以下步骤：

6)将离心柱放置于新的收集管中；

7)向离心柱的膜上加入700μL QIAzol，5000g离心5min，获得裂解液并转移至2mLEP管中；

8)Vortex简短涡旋振荡，室温(15～25℃)孵育5min；

9)向EP管中加入90μL氯仿，盖紧EP管盖子，剧烈摇晃15s；

10)室温(15～25℃)孵育2～3min；

11)12000g、4℃离心15min；

12)转移最上层水样液体至一新的2mL EP管中，向其中加入两倍体积的无水乙醇，用移液枪吹打数次混匀；

13)将RNeasy MinElute spin column离心柱放置于2mL收集管中，吸取步骤12)中所得混合液700μL，转移至离心柱中，盖紧盖子，12000g室温离心15s，丢弃液体；

14)吸取步骤12)剩余混合液，重复步骤13)进行转移、离心，丢弃液体；

15)向离心柱中加入700μL RWT Buffer，盖上盖子，12000g离心15s，丢弃液体；

16)向离心柱中加入500μL RPE Buffer，盖上盖子，12000g离心15s，丢弃液体；

17)向离心柱中加入500μL RWT Buffer，盖上盖子，12000g离心2min，丢弃液体；

18)将离心柱放置于新的2mL收集管中，打开盖子，以离心机的最大转速离心5min，以风干离心柱的膜，丢弃收集管；

19)将离心柱放置于新的1.5mL收集管中，向离心柱的中心膜上加入14μL RNase-free water，盖紧盖子，静置1min，之后全速离心1min以洗脱RNA，即获得外泌体总RNA溶液，进行RNA浓度测定。

3.1.3反转录

取1μg外泌体总RNA，使用TaKaRa公司的反转录试剂盒(Prime Script RT reagentkit)进行反转录，反应体系(20μL)为：5×Prime Script RT Master Mix 4μL、补RNaseFree dH₂O至20μL。反应条件为：37℃15min；85℃5s，4℃10min。

用超纯水稀释(1:2)反应体系中的cDNA，根据内参基因定量结果进一步调整cDNA含量，内参基因定量Ct值一般在18左右即可。

3.1.4实时定量PCR(Real-time PCR)

采用TaKaRa公司TB Green Premix Ex Taq II试剂进行Real-time PCR反应，每个样本做三个重复。

反应体系为10μL：2×TB Green Premix Ex Taq II 5μL、10μM上游引物0.4μL、10μM下游引物0.4μL、cDNA模板1μL、ROX 0.2μL、补去离子水至10μL。

在罗氏LightCycler 96实时定量PCR仪上，按照实时定量PCR两步法扩增标准程序进行：

Stage 1预变性：95℃30s；

Stage 2PCR反应：95℃5s，60℃30s，共40个循环。

反应完成后，进行数据分析。在调整基线循环和计算阈值后，根据仪器自动得出的Ct值，采用2^-ΔΔCt法计算LncCLDN23与内参基因(GAPDH)的相对表达量。

通过Real-time PCR对94例结直肠癌患者血浆样本进行基因表达检测。其中，46例为结直肠癌未转移患者，48例为结直肠癌转移患者。结果显示(图3)，相比未转移组，结直肠癌转移组患者血浆外泌体中LncCLDN23表达水平较低，且具有统计学差异。

3.2依据高通量测序筛选出的与结直肠癌淋巴结转移相关的差异性表达倍数最大的候选分子LncCLDN23，通过Real-time PCR对其在结直肠癌转移患者组织中的表达情况进行验证。

3.2.1LncCLDN23及内参基因扩增引物设计

上游引物LncCLDN23F：5`-AGCTACCAAAGACCACTGCC-3`

下游引物LncCLDN23R：5`-GTGGCCCAGAGTTACCTGTC-3`

上游引物GAPDHF：5`-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3`

下游引物GAPDHR：5`-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3`

3.2.2结直肠癌患者癌组织和癌旁组织RNA提取

1)先将肿瘤组织以及癌旁组织的纤维、脂肪清除干净，加入到EP管中，同时加入两颗2mm的研磨珠、2mL RNase-free于EP管中；

2)经第一步处理后的样品，每管样品加1mL预冷的Trizol，并将EP管放置于高速组织研磨仪中，研磨组织60s(60HZ)；

3)向EP管中加200μL氯仿，充分震荡混匀，静置5min使其分层；

4)4℃、12000rpm离心15min，用200μL移液枪吸取上层水样液体400μL左右至新的1.5mL EP管中；

5)加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10min；

6)4℃、12000rpm离心15min，弃上清；

7)加入1mL 75％乙醇，充分洗涤后4℃、7500rpm离心5min，弃上清；

8)将EP管置于超净台中风干4min，可见底部有白色沉淀，即为总RNA；

9)风干后，用20μL DEPC水溶解；

10)RNA定量：取2μL步骤9获得的RNA，用紫外分光光度计测定其A260/A280值，计算所提取总RNA的纯度和浓度，根据实验需要将总RNA稀释。

3.2.3样本基因表达检测

参照3.1.3和3.1.4对组织样本中LncCLDN23的相对表达量进行分析。

通过对36对结直肠癌组织样本以及相应的癌旁组织样本进行基因表达检测，结果表明：参见图4A，相比癌旁组织，癌组织中LncCLDN23表达更低，且具有统计学差异；参见图4B，结直肠癌转移组与未转移组患者的癌组织中LncCLDN23表达无统计学差异。

4、结直肠癌早期转移诊断

本发明通过高通量测序发现结直肠癌淋巴结转移患者血浆外泌体中LncCLDN23表达下调。实时定量PCR结果显示LncCLDN23在结直肠癌转移患者血浆外泌体和组织中都是低表达的，这与高通量测序结果一致。通过细胞增殖、侵袭实验发现，敲低LncCLDN23可以显著增加结直肠癌细胞的增殖，且转移相关因子N-cad表达也明显增加(图5、图6)。基于上述发现，推测外泌体LncCLDN23在结直肠癌的发生、发展中起到关键的作用，并且与患者术后病理的转移密切相关。因此，外泌体LncRNA是结直肠癌转移的生物标志物(BIOMARK)，可以为结直肠癌早期转移的预测和诊断提供新的思路与手段。

LncCLDN23为结直肠癌早期转移预测和诊断提供了新的靶点，可用以设计和开发直接针对靶点诊断结直肠癌早期转移的新方法。以下为具体举例说明。

4.1LncCLDN23及内参基因Real-Time PCR引物设计

上游引物LncCLDN23F：5`-AGCTACCAAAGACCACTGCC-3`

下游引物LncCLDN23R：5`-GTGGCCCAGAGTTACCTGTC-3`

上游引物GAPDHF：5`-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3`

下游引物GAPDHR：5`-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3`

4.2样本预处理

用5mL抗凝采血管(EDTA)采集结直肠癌转移情况不明(转移与未转移)的患者外周血，并将样本在采集后30min内于4℃、1000g离心15min，取上清，即为血浆，做好标记，-80℃保存备用。

4.3利用Real-Time PCR方法快速、简便的检测血浆外泌体中LncCLDN23的基因表达量

1)主要试剂

2)主要仪器

3)溶液的配制

引物储存液配制：将引物冻干粉12000rpm，离心1min，按照引物管壁所示加入对应的ddH₂O/TE溶解，浓度为100μmol/L。

引物工作液配制：将浓度为100μmol/L的引物储存液加入ddH₂O/TE稀释10倍，浓度为10μmol/L。

4.4采用2^-ΔΔCt法计算LncCLDN23的相对表达量

Real-Time PCR扩增反应程序后，仪器自动根据得出的Ct值计算代表相对表达量的值。

根据大量临床样本定量结果验证，结直肠癌转移组患者血浆外泌体LncCLDN23对应的Ct值均高于29，而结直肠癌未转移组患者血浆外泌体LncCLDN23对应的Ct值均低于29，因此，将Ct值29作为限值用以预测结直肠癌原位癌患者转移风险。

总之，本发明通过实验证明了外泌体LncCLDN23与结直肠癌肿瘤的发生发展(转移)密切相关，因此，以外泌体LncCLDN23作为结直肠癌基因组学中一个重要的靶标，通过采集结直肠癌患者少量外周血并对血浆中外泌体LncCLDN23的表达进行检测分析，可以为结直肠癌早期转移的预测以及后期的营养学支持提供重要参考。

<110> 中国人民解放军空军军医大学

<120> 基于外泌体LncCLDN23表达水平的结直肠癌早期转移诊断试剂盒

<160> 4

<210>1

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

agctaccaaa gaccactgcc 20

<210>2

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 2

gtggcccaga gttacctgtc 20

<210>3

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 3

ctcctccacc tttgacgctg 20

<210>4

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 4

tcctcttgtg ctcttgctgg 20

Claims

1.一种检测血浆外泌体中LncCLDN23表达量的试剂在制备检测结直肠癌早期转移诊断试剂中的应用，其特征在于：包括以下步骤：

1)提取结直肠癌患者血浆中的外泌体RNA；

2)以所述外泌体RNA的反转录本为模板，通过实时定量PCR扩增血浆中的外泌体LncCLDN23；LncCLDN23的NONCODE TRANSCRIPT ID为NONHSAT124878.2，NONCODE Gene ID为NONHSAG049472.3；

3)确定外泌体LncCLDN23的扩增循环阈值Ct；

当结直肠癌未转移患者血浆中外泌体LncCLDN23的扩增循环阈值Ct或相对表达量在限值以内时，则表明该患者无转移风险，当结直肠癌未转移患者血浆中外泌体LncCLDN23的扩增循环阈值Ct或相对表达量超出限值时，则表明该患者存在转移风险；

所述扩增循环阈值Ct的限值为29。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤1)具体包括以下步骤：对采集的结直肠癌未转移患者外周血进行离心，得到血浆，从该血浆中抽提得到外泌体RNA。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤2)中，实时定量PCR的扩增引物对为：

上游引物LncCLDN23F：5`-AGCTACCAAAGACCACTGCC-3`

下游引物LncCLDN23R：5`-GTGGCCCAGAGTTACCTGTC-3`。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤2)中，实时定量PCR的扩增反应体系包括40～400nmol/L上游引物以及40～400nmol/L下游引物。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤2)中，实时定量PCR的扩增反应程序为：1)95℃30s；2)95℃5s，60℃30～34s，共40个循环。