CN107475441A

CN107475441A - 一种预测乳腺癌患者对at方案新辅助化疗的反应性的生物标记物

Info

Publication number: CN107475441A
Application number: CN201710950423.3A
Authority: CN
Inventors: 徐兵河; 马飞; 瞿望; 翟晓宇; 李春晓
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2017-10-13
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2037-10-13
Also published as: CN107475441B

Abstract

本发明公开了一种预测乳腺癌患者对AT方案新辅助化疗的反应性的生物标记物，该生物标志物是miR‑4772‑3p。本发明实验证明，与疗效PR组乳腺癌患者相比，疗效SD组乳腺癌患者血液外泌体中miR‑4772‑3p表达水平明显上调，因此可以将miR‑4772‑3p作为预测乳腺癌患者对AT方案新辅助化疗的反应性的生物标记物。本发明的研究成果可以为临床医生制定乳腺癌患者的治疗方案提供指导。

Description

一种预测乳腺癌患者对AT方案新辅助化疗的反应性的生物标记物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及miR-4772-3p在预测乳腺癌患者对新辅助化疗反应性方面的用途。

背景技术

外泌体是由细胞膜或多囊泡胞内体与细胞膜融合过程中所产生的分子直径30～100nm的小囊泡，在真核生物的血液、尿液和唾液等多种甚至全部体液中广泛分布。在对外泌体组分的研究中，通过进一步的离心、纯化发现，外泌体由脂质双分子层构成，并含有大量与其细胞来源相关的蛋白质、核酸等组分。蛋白质主要包括以CD9、CD63、CD81和CD82为主的四跨膜蛋白、Annexins和Flotillin等融合蛋白以及分子伴侣蛋白和细胞骨架蛋白。以及众多与肿瘤发生发展相关的蛋白，如热休克蛋白、张力蛋白类似物等。外泌体含有的核酸主要包括mRNA、miRNA、siRNA等，分别在蛋白质表达、翻译调控和基因沉默方面发挥各自的作用，参与众多的病理生理过程。而在这其中，mi RNA扮演着重要的角色。

miRNA为长度在21-25碱基对的非编码RNA，其前体pri-mi RNA由RNA聚合酶II合成，经Drosha和Dicer核酸内切酶作用产生成熟的mi RNA，并通过与Ago2形成RNA诱导的沉默符合体(RISC)降解靶RNA或干扰其翻译，在转录后水平调控基因的表达。而在人类基因组中，受mi RNA调控的基因可达30％以上。作为女性发病率最高的肿瘤，已有较多实验针对乳腺癌中miRNA的表达进行了研究，结果发现包括miR-195在内的血清总miRNA在乳腺癌及健康对照组间存在一定的差异，但循环miRNA作为肿瘤标志物的研究因其内在的异质性仍无法得到较为统一的结论。然而由于外泌体本身对miRNA具有富集作用以及双层膜结构的保护作用，外泌体miRNA较循环中更为稳定，在临床应用上可能有着更为巨大的潜力。

作为女性发病率及死亡率均位居前列的肿瘤，乳腺癌仅在2015年就夺去了近70万中国妇女的生命，并且在中国的发病率仍有不断升高的趋势。同时，乳腺癌作为一类异质性突出的恶性肿瘤，可以基于不同的基因表达谱，进一步分为不同的亚型，而乳腺癌发生发展的分子机制更是决定疗效好坏的基石。不同亚型的乳腺癌临床特征、对治疗的反应及预后存在很大差异。2011年《St.Gallen早期乳腺癌初始治疗国际专家共识》将ER、PR、Her-2的免疫组化结果及Ki-67增殖指数的高低作为乳腺癌分型的依据，并将其分为Luminal A型、Luminal B型、Her-2过表达型和基底细胞样(Basal-like)型4型。在这其中Luminal A型是乳腺癌最常见的分子亚型，发病率为50％-5％。近年来针对外泌体及其所含microRNA的研究发现，其与乳腺癌的发病及预后都密切相关，如miR-101、miR-372、miR-21及miR-1246的水平相较正常人在乳腺癌患者的血清外泌体中明显升高。此外，不同亚型的乳腺癌外泌体miRNA的变化也不相同。受体阴性的乳腺癌病人中，血清外泌体miR-373的水平较luminal型的乳腺癌病人明显升高，考虑到外泌体与来源细胞之间的密切联系，外泌体miRNA可能在乳腺癌的早期诊断和临床评估中发挥重要作用。

由于外泌体的研究是近年来新兴的热点，具体的实验设计、提取方法目前仍缺乏统一的标准。作为易受环境影响的敏感指标，不同实验miRNA水平的差异尚不能除外实验设计本身的影响。细胞系miRNA的变化亦不能完全代表体内mi RNA的波动。此外，大多数的实验尚处于探索阶段，目前还没有针对乳腺癌患者血清外泌体miRNA的大规模研究，因而miRNA水平的差异也不能除外样本偏倚的可能。而基于既往的血清、组织等miRNA的结果开展的研究也可能导致一些差异表达的miRNA被忽视。二代测序(Next GenerationSequencing，NGS)相较一代测序(Sanger测序)，能够同时对大规模的DNA片段进行平行测序(Parallel Sequencing)以及边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，因此具有高通量、高效率等优势。随着NGS技术的日趋成熟，测序成本和实验周期都逐渐减少，使其大规模应用成为可能。针对外泌体miRNA进行的NGS，可以帮助我们明确体内mi RNA的表达情况，验证体外实验的结果，甚至发现新的差异表达的mi RNA及其可能的下游通路。综上所述，截至目前，已在多种肿瘤中开展的大量外泌体miRNA的基础及临床研究，绝大多数都在细胞系中进行，并往往受制于既往外周血或组织miRNA的研究结果。直接针对病人血浆外泌体的大规模研究尚处于起步阶段。本实验旨在对乳腺癌最常见的亚型Luminal A型病人的血浆外泌体进行研究，通过二代测序的手段探索与耐药性相关的miRNA及相应的靶基因及信号通路，并结合DIANA Tools、TCGA、Kaplan Miere plot等数据库作进一步分析，为下一步大规模的外泌体研究应用做铺垫。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种可用于预测乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性的生物标志物。

本发明的目的之二在于提供上述生物标志物在预测乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性方面的用途。

本发明的目的之三在于提供一种可用于预测乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性的工具。

本发明的目的之四在于提供一种可用于治疗乳腺癌的药物组合物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种检测样本中miR-4772-3p表达水平的试剂在制备预测乳腺癌患者对AT方案新辅助化疗的反应性的工具中的应用。

在本发明的具体实施方式中，所述AT方案新辅助化疗是指表柔比星和紫杉醇联合应用化疗。

进一步，检测样本中miR-4772-3p表达水平的试剂没有限制，可以是任何能够检测出miR-4772-3p表达水平的试剂。包括但不限于利用反转录聚合酶链式反应方法，实时荧光定量聚合酶链式反应方法，Northern印迹杂交方法，核糖核酸酶保护分析方法，Solexa测序技术，或生物芯片检测miR-4772-3p表达水平时所需的试剂。

进一步，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。

优选地，所述试剂盒包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-4772-3p的部分或全部序列；所述试纸包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针。

进一步，所述乳腺癌患者是luminal型乳腺癌患者。

进一步，所述样本来源可以是组织或体液。在本发明的具体实施例中，所述样本来源是血液外泌体。

本发明还提供了一种用于预测乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性的工具，所述工具包括检测miR-4772-3p表达水平的试剂。

进一步，所述检测miR-4772-3p表达水平的试剂包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针。

在本发明的具体实施方案中，针对miR-4772-3p的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物是通用反向引物。

进一步，所述试剂盒包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-4772-3p的部分或全部序列；所述试纸包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针。

进一步，所述试剂盒中的针对miR-4772-3p的引物和/或探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于检测miR-4772-3p表达水平的引物和/或探针。将miR-4772-3p的多种检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中联合预测乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性的情况也包含在本发明的保护范围之内。

进一步，所述芯片上固定的所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于检测miR-4772-3p的表达水平的寡核苷酸探针。将miRNA的多种检测探针放置在同一芯片上联合预测乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性的情况也包含在本发明的保护范围之内。

进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

本发明还提供了miR-4772-3p的抑制剂在制备乳腺癌治疗药物中的应用。

进一步，所述抑制剂能够抑制miR-4772-3p的表达、或者能够抑制miR-4772-3p的稳定性、或者能够抑制miR-4772-3p的活性、或者能够缩短权miR-4772-3p的作用时间。

所述抑制剂的靶标不限于miR-4772-3p本身，还包括miR-4772-3p的上下游，例如：编码miR-4772-3p的基因组序列，miR-4772-3p的靶基因、调控miR-4772-3p的蛋白或者基因。

进一步，所述抑制剂选自以下组：蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体。

优选地，所述miR-4772-3p抑制剂是miR-4772-3p的反义寡核苷酸(anti-miR-4772-3p)或者miR-4772-3p模拟物。

根据miR-4772-3p序列容易设计出它的反义寡核苷酸，将反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调miR-4772-3p的表达。“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。

所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleic acid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2’氧原子和4’碳原子连接起来的修饰技术。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。

进一步，所述所述乳腺癌是luminal型乳腺癌。

本发明还提供了一种治疗乳腺癌患者的药物组合物，所述药物组合物的有效成分是前面所述的miR-4772-3p抑制剂。

本发明的药物组合物除了上述miR-4772-3p抑制剂之外，还可包括药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

所述药物组合物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

所述药物组合物可以单独施用；或者与其他能够治疗乳腺癌的药物进行组合施用。

所述药物组合物可以离体施用：将药物组合物在体外导入人体自身或异体细胞(或异种细胞)，经体外细胞扩增后，输回人体。

所述药物组合物可以体内施用：将药物组合物直接导入体内。

施用本发明的药物组合物的受体可以是人类或者其他哺乳动物。更具体地，受体可以是器官、组织、细胞。

本发明的“miR-4772-3p”指的是成熟的miRNA。

本发明的“新辅助化疗”是指在实施局部治疗方法(如手术或放疗)前所做的全身化疗，目的是使肿块缩小、及早杀灭看不见的转移细胞，以利于后续的手术、放疗等治疗。主要是用于某些中期肿瘤患者，以期通过先做化疗使肿瘤缩小，再通过手术或放疗等治疗方法治愈肿瘤。对于早期肿瘤患者通畅可以通过局部治疗方案治愈，并不需要做新辅助化疗。而对于晚期肿瘤患者由于失去了根治肿瘤的机会，通常也不采用新辅助化疗的方法。新辅助化疗也有风险，部分患者接受新辅助化疗的效果不好，使病变增大或患者体质下降，也可能失去根治肿瘤的机会。因此在进行新辅助化疗前进行新辅助化疗反应性的预测对于控制新辅助化疗的风险是非常必要的。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了miR-4772-3p与乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性之间的相关性，通过检测miR-4772-3p的表达水平可以预测乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性，从而有助于医生确定乳腺癌患者的化疗方案。

附图说明

图1显示利用电镜观察外泌体的结构图；

图2显示利用Western bolt检测外泌体表面蛋白表达的免疫印迹图；

图3显示利用QPCR检测miR-4772-3p表达水平的柱状图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

实施例1筛选与乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性相关的miRNA

1.研究对象

1.1纳入标准

研究纳入2014年10月到2016年12月中国医学科学院肿瘤医院接受新辅助化疗的luminal A型乳腺癌住院患者样本作为实验组，患者均为女性，均由空心针穿刺确诊为乳腺浸润性癌，病理免疫组化结果显示为luminal A型。X线、CT、超声、MRI及全身骨显像等影像学检查证实无远处转移，有局部淋巴结转移。均采用表柔比星+紫杉醇(AT)方案进行5周期的新辅助化疗。

1.2样本和临床资料采集

全部患者均在中国医学科学院肿瘤医院住院治疗，由住院医师采集病史资料，主要包括性别，出生日期，家族史，影像学检查，病理类型，免疫组化，化疗方案及疗效评价。取得患者知情同意后，在开始新辅助化疗前，用一次性真空采血针采集患者血样，用4ml EDTA抗凝BD采血管保存。静置10分钟后3000rpm离心10分钟，将上层血浆(约2.5ml)转移至2个1.5ml离心管中，于-80℃冰箱中保存，实验过程中避免反复冻融。

疗效评价

按照国际抗癌联盟(UICC)实体瘤通用疗效评定标准进行评估。完全缓解(CR)：临床检查肿瘤完全消失超过1个月；部分缓解(PR)：肿瘤最大直径与其最大垂直径的乘积减少>50％以上；病情稳定(SD)：肿瘤最大直径与其最大垂直径的乘积减少<50％，或增加<25％；疾病进展(PD)：肿瘤最大直径与其最大垂直径的乘积增加>25％。

将疗效CR和PR的患者定义为化疗有效，将疗效SD和PD的患者定义为化疗无效。

18例患者详细信息见表1。

表1患者基本临床信息汇总

3、血浆提取外泌体

使用SBI公司的Exoquick外泌体沉降试剂盒提取血浆中外泌体，详细步骤如下：

1)将血样在冰上冻融，将凝血酶按每0.5ml血浆5μl的比例加入至离心管中，使终浓度为5U/ml。枪头吹打混匀后，室温放置5分钟；

2)室温、12000转/分钟，离心5分钟。将上清转移至一新的1.5ml离心管中；

3)将Exo Quick Exosome Precipitation Solution按照每250μl样品加63μl的比例加入离心管中，上下颠倒混匀。4℃孵育1小时；

4)4℃、1500g，离心30分钟；

5)吸去上清后将剩余的样品在4℃、1500g离心5分钟。用移液器吸去所有剩余的液体后，将外泌体于-80℃冰箱中保存备用。

4、Western Blot实验步骤

4.1外泌体总蛋白提取

1)取由Exoquick试剂盒沉淀所得的血浆外泌体，用100μl冰预冷的l×PBS将外泌体重悬、溶解；

2)向溶解的外泌体溶液中加入适量(200-300μl)蛋白裂解液，冰上作用40分钟，每10分钟剧烈震荡一次；

3)12,000rpm，4℃，离心20分钟；

4)上清即为裂解所得的外泌体蛋白，转至新的1.5ml微量离心管内于-80℃冰箱中保存备用。

4.2Western Blot

Bradford法测定总蛋白浓度，将各组蛋白浓度调到同一水平。制备10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶,每孔加蛋白样品100μg，电泳后通过半干式电转移仪(美国Bio-Rad公司)将蛋白转到硝酸纤维素滤膜。丽春红S染色确定转膜情况并标记蛋白Marker位置。5％脱脂奶粉TBS缓冲液封闭4℃冰箱过夜；一抗1∶1 000稀释，室温下摇2h后TBS洗膜3次；按1∶1 000加入过氧化物酶标记羊抗兔IgG-HRP60min，TBS洗3次后加入ECL2-3min，暗室显影2min后冲洗胶片。凝胶成像分析系统摄像分析。Western blot保存图片，用Image-Quant进行整合及条带灰度值分析。

5、电镜鉴定外泌体

实验步骤：

2)用移液器吸取溶解的外泌体样品30μl(若浓度过高影响观察，可用PBS稀释10-100倍)，滴加到直径2mm的铜网上，用滤纸从液珠边缘吸去多余的液体；

3)将醋酸铀溶于水，约20-30分钟，配制成1％的醋酸铀染液。滴加至铜网上，室温负染10分钟；

4)滤纸吸干负染液后自然环境下晾干，约2小时，干燥后即可电镜观察；

5)将铜网置于透射电镜的样品室内，120kv条件下观察，拍照记录外泌体形态。

6、提取外泌体总RNA

使用QIAGEN公司的RNeasy mini kit试剂盒提取外泌体总RNA，详细步骤如下：

1)将700μl QIAzol Lysis Reagent加入离心管中裂解外泌体，枪头吹打混匀，室温放置5分钟；

2)加入140μl三氯甲烷，剧烈振摇混匀15秒，室温孵育2-3分钟；

3)4℃、12000g，离心15分钟；

4)离心后分为3层，其中上层水相为RNA，小心将其移入新的1.5ml RNAase Free离心管中，加入1.5倍体积(约525μl)的无水乙醇后，用移液器吹打混匀；

5)吸取700μl样品(包括沉淀)，移入2ml离心管内的RNeasy mini过滤柱中，盖紧盖子，室温、8000g条件下离心15秒。丢弃滤液，将剩余样品重复这一操作；

6)将700μl RWT缓冲液加入到RNeasy mini过滤柱中，盖上盖子，室温、8000g条件下离心15秒，丢弃滤液；

7)将500μl RPE缓冲液加入到RNeasy mini过滤柱中，盖上盖子，室温、8000g条件下离心15秒，丢弃滤液。再次加入500μl RPE缓冲液，盖上盖子，室温、8000g条件下离心2分钟，丢弃滤液；

8)将RNeasy mini过滤柱转移至一新的2ml RNAase Free离心管中，室温、12000g条件下离心1分钟；

9)将RNeasy mini过滤柱转移至一新的2ml RNAase Free离心管中，再向过滤柱中加入适量(150μl)DEPC水。盖上盖子，室温、8000g条件下离心1分钟，丢弃过滤柱，滤过的RNA于-80℃冰箱中保存备用。

7、miRNA文库构建主要步骤

7.1实验原理

将提取的总RNA样本进行片段选择，通过胶分离技术收集17-30nt或15-35nt的小RNA片段，富集后按照Tru Seq Small RNA Sample Preparation Kit(Illumina，RS-200-0048)方法及流程进行。在分离得到的RNA片段的两端分别连接上接头，然后反转录成cDNA，进行PCR扩增建立测序文库，具体如下。

7.2实验步骤

7.2.1小RNA分离纯化

将血浆外泌体提取所得的总RNA样本于上样缓冲液及去离子甲酰胺中混匀，55℃孵育30分钟。冰浴后采用15％PAGE胶进行小RNA(18-30nt)分离，分离后的小RNA经乙醇沉淀离心富集。

7.2.2连接3’接头

1)将1μg RNA溶于5μl无RNA酶水中，与1μl RA3一起加入一新的200μl PCR管中(总体积6μl)。

2)用枪头混匀，短暂离心后放入预热的PCR仪中，于70℃孵育2分钟。

3)将样品取出置于冰盒内，PCR仪设定为28℃。

4)将2μl连接缓冲液、1μl RNA酶抑制剂及1μl T4RNA连接酶2加入到一新的200μlPCR管中，操作在冰盒内进行(总体积4μl，可根据样品数量作相应调整)。

5)用枪头混匀，短暂离心后加入RA3/小RNA混合物(总体积10μl)，用枪头混匀后放入预热的PCR仪中。

6)于28℃孵育1小时，加入1μl终止液后混匀，继续于28℃孵育15分钟。

7)将样品取出置于冰盒内暂存。

7.2.3连接5’接头

1)将1.1μl RA5加入到一新的200μl PCR管中，放入预热的PCR仪中，于70℃孵育2分钟。

2)将样品取出置于冰盒内，PCR仪设定为28℃。

3)将1.1μl 10mM ATP加入到PCR管内并混匀，再加入1.1μl T4RNA连接酶，混匀。

4)取出3μl加入到RA3混合物中并混匀，于28℃孵育1小时。

5)将样品取出置于冰盒内暂存。

7.2.4反转录

1)将0.5μl 25mM dNTP混合物及0.5μl超纯水加入到dNTP混合管中，稀释为12.5mMdNTP，总体积1μl(可根据样品数量作相应调整)。

2)混匀短暂离心后置于冰上。

3)将6μl加上接头的RNA文库加入到一新的200μl PCR管内，再加入μl RNA反转录引物，混匀。

4)短暂离心后放入预热的PCR仪中，于70℃孵育2分钟。

5)将样品取出置于冰盒内暂存，PCR仪设定为50℃。

6)将2μl 5×第一链缓冲液、0.5μl 12.5mM dNTP混合物、1μl 100mm DTT、1μl RNA酶抑制剂、1μl Super Script II反转录酶加入到一新的200μl PCR管内，总体积5.5μl。

7)混匀后短暂离心，取5.5μl加到文库/引物混合物中，混匀后短暂离心，总体积为12.5μl。

8)放入预热的PCR仪中，于50℃孵育1小时，将样品取出置于冰盒内暂存。

7.2.5文库扩增

1)将8.5μl超纯水、25μl PCR混合物、2μl RNA PCR引物、2μl RNA PCR引物Index加入到一新的200μl PCR管中，总体积37.5μl；

2)混匀短暂离心后置于冰上，将37.5μl的混合物与连接接头的RNA混合物混匀；

3)短暂离心后放入预热的PCR仪中，PCR条件：98℃30秒；98℃10秒；60℃30秒；72℃16秒；进行11个循环，然后72℃10分钟，完后4℃保温。

7.2.6文库纯化

1)将2μl RNA ladder与2μl DNA上样染料在1.5ml微量离心管内混匀，上样2条泳道。

2)将1μl高分辨ladder与1μl DNA上样染料在1.5ml微量离心管内混匀，上样1条泳道。

3)将所有扩增的cDNA(约48-50μl)与10μl DNA上样染料在1.5ml微量离心管内混匀，上样2条泳道，总上样量50μl。

4)145V恒压电泳1小时，至染料跑出凝胶。

5)将胶取下，用溴化乙锭染2-3分钟后用凝胶成像系统显影。

6)用刀片将22-30nt小RNA片段的凝胶切下，放入0.5ml的破胶离心管中。

7)在20000g条件下离心2分钟除去胶。

7.2.7文库浓缩

1)加300μl超纯水至残胶中，振荡2小时以上或过夜以析出DNA。

2)将残胶和液体滤过5μlm滤器，600g离心10秒，弃去滤器。

3)向滤液中加入2μl糖原、30μl 3M乙酸钠、975μl无水乙醇，4℃、20000g离心20分钟。

4)弃去上清，若沉淀疏松，再次20000g离心2分钟。

5)用500μl 75％乙醇洗涤沉淀，20000g离心2分钟，弃去上清。

6)开盖37℃下将沉淀烘干(约7分钟)，用10μl 10mM Tris-HCl(pH8.5)将沉淀重悬。

7)取1μl重悬的文库于Agilent Technologies 2100Bioanalyzer进行库检及测序。(由安诺优达公司完成)

8、二代测序及分析

Illumina测序技术基于微阵列和可逆终止子技术进行大规模的平行测序及边合成边测序。c DNA的随机片断通过接头序列附着到流动槽(flow cell)表面，然后通过桥式扩增，形成数以亿计的DNA簇，然后用4种不同荧光标记的末端封闭的碱基进行边合成边测序。Illumina测序技术在一定程度上保证了高精确度，单个碱基逐个测序可有效避免同聚物和重复序列产生的测序错误。7.数据过滤处理对高通量测序结果所获得的原始测序序列(Raw Reads)进行去接头、去低质量片段等处理，以获得用于后续分析的目标序列(CleanReads)。

数据过滤处理的具体步骤包括：

1)去除测序质量较低的序列；

2)去除无法确定碱基信息的比例大于10％的序列；

3)去除没有3'接头的序列；

4)去除有5'接头污染的序列；

5)去除没有插入片段的序列；

6)去除包含ploy A/T的序列(大部分连续的poly A/T，可能来源于测序错误)；

9、信息分析

9.1已知miRNA分析

通过与存储miRNA信息的最主要数据库之一的miRBase(Release 21)中基因组注释信息进行比对，或者将数据库中的miRNA序列比对到样本的基因组中，从而得到目前已知的所有miRNA成熟体和前体在基因组中的定位信息，继而按100％的位置重叠来匹配目标序列在基因组中的比对信息与miRNA的定位信息，便能鉴定出两组样品中已知的miRNA，通过统计学方法得出数据，进一步对其序列、结构特征和数量等进行分析。

9.2miRNA差异表达分析

miRNA的表达具有组织特异性和时序性，因而两组样本中miRNA的表达可能存在差异，这些差异表达的miRNA可能在耐药性方面发挥至关重要的作用。通过差异分析，可以筛选出差异表达显著的miRNA。具体如下：

首先将两组样品的测序结果归一化到同一量级，根据标准化的结果将两组中共同表达的已知miRNA使用log2-ratio比较表达量的差异，结果用差异倍数(Fold Change)及校正后的显著水平(P值)两个水平进行评估，Fold Change＝log2(SD/PR)。

10、统计学分析采用Graphpad Prism7软件进行统计学分析及作图，P<0.05被认为具有统计学差异。计量资料采用平均值±标准差表示，两组间比较采用LSD-t检验。

11、结果

11.1透射电镜鉴定血浆外泌体

试剂盒沉降法所获得的血浆外泌体样品如图1(x80000)所示。图1中白色箭头所指透亮的囊泡状结构为外泌体，背景中深色斑块考虑为试剂盒沉降杂质。

11.2Western Blot

Western Blot法检测血浆分离的外泌体的特异性表面蛋白CD63、CD81的表达结果如图2所示。其中53k Da条带代表CD63，28k Da条带代表CD81，选取2个病人的外泌体进行验证。结果显示，由外泌体沉降试剂盒从病人血浆中分离的外泌体其表面蛋白CD63和CD81均高表达，结合电镜结果，试剂盒所提取的为外泌体相对较为明确。

11.3血浆外泌体miRNA测序结果及分析

化疗前血浆外泌体miRNA的差异表达

为明确在疗效PR及SD的两组患者中差异表达的miRNA，我们通过edge R软件对表达量以log2-ratio进行两两比较，筛选出表达量存在差异的miRNA，利用P值表示miRNA在两组间表达差异的显著程度。

与疗效为PR组的病人相比，SD组中有9个miRNA表达显著上调，13个miRNA表达明显下调。其中miR-4772-3p在SD组中表达上调，Fold change＝log2(SD/PR)为1.262，P value＝0.0075。

实施例2大样本验证差异表达miRNA

1、1.研究对象

1.1纳入标准

研究纳入2014年10月到2016年12月中国医学科学院肿瘤医院接受新辅助化疗的luminal A型乳腺癌住院患者样本作为实验组，共80例，患者均为女性，均由空心针穿刺确诊为乳腺浸润性癌，病理免疫组化结果显示为luminal A型。X线、CT、超声、MRI及全身骨显像等影像学检查证实无远处转移，有局部淋巴结转移。均采用表柔比星+紫杉醇(AT)方案进行5周期的新辅助化疗。其中50例患者疗效为PR，30例患者疗效为SD。

1.2样本和临床资料采集

2、外泌体RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：将10pg-1μg的总RNA模板与2μl 10*缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μlpolyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl 5*缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1h。

4、QPCR反应：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃55s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增miR-4772-3p的正向引物序列为：5’-CCTGCAACTTTGCCTGATCAGA-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物为通用反向引物(购自北京旷博生物技术有限公司)。以snRNA U6作为参照基因，其上游引物序列为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO.2)；下游引物序列为：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO.3)。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

如图3所示，与疗效PR组患者相比，疗效SD组患者的外泌体中miR-4772-3p的表达水平显著升高(P＜0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国医学科学院肿瘤医院

<120> 一种预测乳腺癌患者对AT方案新辅助化疗的反应性的生物标记物

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctgcaactt tgcctgatca ga 22

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims

1.检测样本中miR-4772-3p表达水平的试剂在制备预测乳腺癌患者对AT方案新辅助化疗的反应性的工具中的应用，其特征在于，所述AT方案新辅助化疗是指表柔比星和紫杉醇联合应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测样本中miR-4772-3p表达水平的试剂包括利用反转录聚合酶链式反应方法，实时荧光定量聚合酶链式反应方法，Northern印迹杂交方法，核糖核酸酶保护分析方法，Solexa测序技术，或生物芯片检测miR-4772-3p表达水平时所需的试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台；优选地，所述试剂盒包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针；所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-4772-3p的部分或全部序列；所述试纸包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针；所述高通量测序平台包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针。

4.根据根据权利要求1-3所述的应用，其特征在于，所述样本来源是血液外泌体。

5.根据根据权利要求1-3所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌患者是luminal型乳腺癌患者。

6.一种预测乳腺癌患者对新辅助化疗的反应性的工具，其特征在于，所述工具包括检测miR-4772-3p表达水平的试剂，优选地，所述检测miR-4772-3p表达水平的试剂包括针对miR-4772-3p的引物和/或探针，所述引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物是通用反向引物。

7.miR-4772-3p的抑制剂在制备乳腺癌治疗药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂能够抑制miR-4772-3p的表达、或者能够抑制miR-4772-3p的稳定性、或者能够抑制miR-4772-3p的活性、或者能够缩短miR-4772-3p的作用时间。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂选自以下组：蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体，优选地，所述寡核苷酸是miR-4772-3p的反义寡核苷酸。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌是luminal型乳腺癌。