CN110699459A - 外泌体中microRNA在乳腺癌临床评估中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外泌体中microRNA在乳腺癌临床评估中的应用,特别是一种检测microRNA的产品在制备乳腺癌的诊断、预后判断、疗效观察和复发监测的工具以及筛选治疗乳腺癌的药物中的应用,特别是,其中microRNA为外周血外泌体中的microRNA为miR‑1248和/或miR‑182‑3p。本发明有助于实时动态反映和预测检测患者的疾病状态,为临床医生的诊断提供辅助,及时采取相应的预防和治疗措施,而且检测采样部分仅需采集血液,安全无创,简便易操作,可大大提高受试者的依从性,在乳腺癌的临床治疗中具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种外泌体中microRNA在乳腺癌临床评估中的应用,特别是检测血液外泌体中miR-1248和/或miR-182-3p的产品在制备乳腺癌的诊断、预后判断、疗效观察和复发监测的工具以及筛选治疗乳腺癌的药物中的应用。
背景技术
众所周知,乳腺癌是女性最常见的侵袭性癌症类型,其生存期依赖于其发现和确诊的时间,越早发现的患者会有越有利的预后结果。乳腺癌的进展会受到肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)的变化而发生改变,乳腺癌细胞随着TME的动态变化而自我适应。在TME的各种细胞组份中,信号转导、细胞间通讯、遗传和表观遗传的调节均会在细胞水平上产生肿瘤间和肿瘤内的异质性。外泌体作为一种细胞外囊泡(EVs),体积为30-150nm,是肿瘤微环境中细胞分泌出的一种重要组分,它们包含各种蛋白质、RNA转录本和microRNA。外泌体中包含的miRNA可反映分泌细胞的生理、病理及功能状态。miRNA是一组数量庞大的非编码微小RNA,通过与靶mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)中的互补序列结合,在转录后或翻译水平上抑制了近1/3的人类基因。一些RNA序列已被发现其在乳腺癌中是失调的。但是直接检测血液中的miRNA由于缺乏标准化的试验方法而可能会出现有争议的结果,而包含有miRNA的外泌体可以从各种体液,包括血浆中分离,并且可以通过它们内含的miRNA以反映其来源的乳腺癌细胞。
现有技术中未见有miR-1248和miR-182-3p的表达与乳腺癌相关的报道。
发明内容
本发明提供一种外泌体中microRNA在乳腺癌临床评估中的应用。
具体地,本发明提供一种检测microRNA的产品在制备乳腺癌的诊断、预后判断、疗效观察和复发监测的工具以及筛选治疗乳腺癌的药物中的应用。
在本发明的一个实施例中,上述microRNA为miR-1248(其具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列)。
在本发明的另一个实施例中,上述microRNA为miR-182-3p(其具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列)。
在本发明的一个实施方式中,上述microRNA为miR-1248和miR-182-3的组合。
具体地,上述microRNA为血液外泌体中的microRNA。
具体地,上述血液为外周血。
具体地,上述产品可以为试剂盒、芯片、高通量测序平台等。
具体地,上述产品为检测microRNA的水平的产品。
在本发明的一个实施方式中,上述产品包含扩增microRNA的引物和/或检测microRNA的探针。
具体地,扩增miR-1248的引物包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列;在本发明的一个实施例中,扩增miR-1248的引物包含如SEQ ID NO:3所示的正向引物和通用反向引物。
具体地,检测miR-1248的探针包含与miR-1248部分或全部互补的序列。
具体地,扩增miR-182-3p的引物包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列;在本发明的一个实施例中,扩增miR-182-3p的引物包含如SEQ ID NO:4所示的正向引物和通用反向引物。
具体地,检测miR-182-3p的探针包含与miR-182-3p部分或全部互补的序列。
在本发明的一个实施例中,上述通用反向引物具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中,上述产品包含microRNA的反转录引物。
具体地,上述miR-1248的反转录引物包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
具体地,上述miR-182-3p的反转录引物包含如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中,上述检测microRNA的产品为检测microRNA的试剂盒。
具体地,上述试剂盒可包含用于收集血液的产品,如抗凝管。
具体地,上述试剂盒可包含提取血液外泌体的试剂。
具体地,上述试剂盒可包含提取血液外泌体RNA的试剂。
具体地,上述试剂盒可包含RNA反转录试剂。
具体地,上述试剂盒可包含RNA定量检测试剂,其包含如上所述的扩增microRNA的引物和/或检测microRNA的探针,该microRNA为miR-1248和/或miR-182-3p。
具体地,上述乳腺癌可以为非浸润性癌(如导管内癌、小叶原位癌、乳头湿疹样乳腺癌)或早期浸润性癌(如早期浸润性导管癌、早期浸润性小叶癌)、浸润性特殊癌(如乳头状癌、髓样癌(伴大量淋巴细胞浸润)、小管癌(高分化腺癌)、腺样囊性癌、粘液腺癌、大汗腺样癌、鳞状细胞癌等)、浸润性非特殊癌(如浸润性导管癌、浸润性小叶癌、硬癌、髓样癌(无大量淋巴细胞浸润)、单纯癌、腺癌等)或其他罕见癌;优选为非浸润性癌或早期浸润性癌。
具体地,上述工具可以为试剂盒、芯片、高通量测序平台等。
本发明还提供一种乳腺癌的诊断、预后判断、疗效观察和复发监测的工具,其包含检测microRNA的试剂。
具体地,上述microRNA为miR-1248和/或miR-182-3p。
具体地,上述microRNA为血液外泌体中的microRNA。
具体地,上述血液为外周血。
具体地,上述检测microRNA的试剂包含本发明上述扩增microRNA的引物和/或检测microRNA的探针,该microRNA为miR-1248和/或miR-182-3p。
具体地,上述检测microRNA的试剂可包含:提取血液外泌体的试剂、提取血液外泌体RNA的试剂、RNA反转录试剂和RNA定量检测试剂。
具体地,上述工具可以为试剂盒、芯片、高通量测序平台等。
本发明还提供一种乳腺癌的诊断、预后判断、疗效观察和复发监测方法以及治疗乳腺癌的药物的筛选方法,其包括检测样品中microRNA表达水平的步骤。
具体地,上述microRNA为miR-1248和/或miR-182-3p。
具体地,上述样品血液外泌体。
具体地,上述血液为外周血。
具体地,上述检测microRNA表达水平的步骤可利用本发明上述检测microRNA的产品采用现有技术常规方法(如“黄京书,武华玉,乔木,等.microRNA表达水平检测技术的研究进展.安徽农业科学,2012,40(3):1346-1347”中所描述的方法)进行,本发明对此不作具体限定。
本发明的发明人通过实验发现,与健康人相比,miR-1248和miR-182-3p的表达显著升高,进一步对乳腺癌患者跟进随访发现,外周血外泌体内miR-1248和miR-182-3p表达量更高的患者预后良好且无复发。外周血外泌体内miR-1248和miR-182-3p可作为乳腺癌的诊断、预后判断等的重要标志物,有助于实时动态反映和预测检测患者的疾病状态,为临床医生的诊断提供辅助,及时采取相应的预防和治疗措施,而且,检测采样部分仅需采集血液,无需(例如通过手术、穿刺等复杂且给受试者带来疼痛等不适情况的手段)采集组织样品,安全无创,简便易操作,采样成本较低,可大大提高受试者的依从性。本发明提供了一种检测microRNA的产品在制备乳腺癌的诊断、预后判断、疗效观察和复发监测的工具以及制备或筛选治疗乳腺癌的药物中的应用,在乳腺癌的临床治疗中具有重要的应用价值。
附图说明
图1所示为本发明实施例1分离所得外泌体的分析结果图,其中图1A为外泌体的透射电镜图,图1B为外泌体的颗粒体积结果图。
图2所示为本发明实施例2中研究组与对照组的血清外泌体中miR-1248和miR-182-3p的表达结果。
图3所示为本发明实施例4中miR-1248和miR-182-3p在患者外周血与外泌体中miR-1248和miR-182-3p的表达比值结果。
具体实施方式
除非另有定义,本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
在本发明中,术语“诊断”是指判定受试者的病症及其发展情况的过程在本发明中,对乳腺癌的诊断包括对受试者是否患有乳腺癌的判断、对受试者所患乳腺癌恶性程度的判断,还可以包括对受试者罹患乳腺癌的风险的判断。本发明所述应用中,在本发明的一个实施例中,microRNA为miR-1248和miR-182-3p,所述诊断为对受试者是否患有乳腺癌的判断、对受试者所患乳腺癌恶性程度的判断或对受试者罹患乳腺癌的风险的判断;在本发明的另一个实施例中,microRNA为miR-1248和/或miR-182-3p,所述诊断可包括对受试者是否患有乳腺癌的判断、对受试者所患乳腺癌恶性程度的判断,还可以包括对受试者罹患乳腺癌的风险的判断。
在本发明中,术语“预后”是指对疾病的发展过程及其最终后果进行预测;在本发明中,对乳腺癌的预后包括对乳腺癌病人的病程和/或结局进行预测。
在本发明中,术语“疗效”是指药物或手术等方法治疗疾病的效果;在本发明中,对乳腺癌的疗效观察是指通过例如检测接受药物或手术等治疗手段的受试者外周血外泌体中miR-1248和/或miR-182-3p的表达水平来判断该药物或手术等治疗手段对乳腺癌的疗效(例如,是否有效、疗效水平高低等)。
在本发明中,术语“复发”是指疾病愈后或疾病的缓解阶段,在某些诱因的作用下,引起疾病再度发作或反复发作的一种发病形式;在本发明中,乳腺癌的复发监测是指通过监测手段(例如检测受试者外周血外泌体中miR-1248和/或miR-182-3p的表达水平)及时预测或判断乳腺癌是否复发。
在本发明中,“药物筛选”是指采用适当的方法,对可能作为药物使用的物质进行生物活性、药理作用及药用价值的评估过程;在本发明中,筛选治疗乳腺癌的药物是指通过例如检测miR-1248和/或miR-182-3p的表达水平作为一项参考对可能用于治疗乳腺癌的物质进行生物活性等的评估。
本发明中,术语“受试者”包括哺乳动物,如人、猴、狗等,优选为灵长类动物,特别优选为人类。
在本发明中,术语“治疗”包括在疾病发作之后,根除、移除、逆转、缓解、改变或控制疾病。
在本发明中,术语“疾病”是动物的一种健康状态,其中动物不能保持稳态,如果不改善该疾病,则动物的健康继续恶化;在本发明中,疾病一般是指乳腺癌。
在本发明中,术语“检测microRNA水平”是指本领域通常允许的误差范围内检测样品中microRNA的含量或浓度。
在本发明中,术语“microRNA”包括pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA及其片段或变体中的一种或几种。
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:血浆外泌体的分离
1、研究对象:选取2017年1月至2018年1月深圳市人民医院甲乳科乳腺癌患者和健康人各20例,乳腺癌患者设为研究组,健康人设为对照组。年龄20-70岁,平均(54.4±13.3)岁。均经乳腺X线摄片、B超扫描或细针肿物穿刺检查证实,符合中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2017版)。除外无其它恶性肿瘤、心衰、血液、内分泌、代谢或消化系统疾病,营养不良,严重肺部感染、肝肾功能不全者的其他疾患。
2、血浆收集与保存:分别使用EDTA抗凝管采集两组成员的静脉血5ml,离心后分离血浆,-80℃冻存。
3、血浆外泌体的分离:采用SBI公司的Exoquick试剂盒(System BiosciencesInc.,Mountain View,CA,USA)分离血浆中的外泌体。将保存于-80℃的血浆在冰上融化,3000g离心15min,将上清转移至新的EP管中,加入适量的ExoQuick溶液轻轻颠倒混匀,4℃反应30min,1500*g离心混合液30min(外泌体沉于管下);吸出上清,离心1500*g 5min吸出所有上清(不能震动离心管);用250μl PBS溶解全部沉淀,-80℃保存备用。
4、观察外泌体的形态:用30μl PBS重悬上步所得沉淀,加入等体积的4%w/v多聚甲醛固定。将10μl固定后的外泌体溶液滴到Formvar/carbon-coated镍网上,空气干燥20min。PBS洗涤数次后,用1%w/v的戊二醛固定5min,纯水清洗数次后用4%w/v醋酸铀染色5min,醋酸铀和甲基纤维素混合液体包埋,用滤纸吸去多余液体并空气干燥备用。通过透射电镜(JEM-2100JEOL,Tokyo,Japan)观察外泌体的形态和大小,电镜图如图1A所示。由图1A可知,外泌体大致呈圆形,部分有凹陷,粒径在200nm以下。
5、分析外泌体的粒径和浓度:采用Nanoparticle-tracking analysis(NTA)分析颗粒的数量和粒径分布。将上述沉淀用30μl无颗粒PBS重悬,测试前再稀释1000倍,颗粒体积如图1B所示。由图1B可知,所提取的外泌体颗粒体积在100nm左右,表明成功分离了人血清外泌体。
实施例2:外泌体RNA抽提和定量及实时定量PCR
使用trizol法提取血浆外泌体的总RNA。Bioanalyzer 2000(Agilent,CA)检测所提取RNA的质量和浓度。采用基于poly-A加尾法的miDETECTA TrackTM miRNA qRT-PCR试剂盒(广州锐博)和CFX96PCR仪(Biorad)检测各组外泌体miRNA,各样本重复检测3次。血液外泌体来源的miR-1248和miR-182-3p,其序列分别如下所示:
miR-1248:ACCUUCUUGUAUAAGCACUGUGCUAAA;
miR-182-3p:UGGUUCUAGACUUGCCAACUA
对上述筛选出来的miRNA进行荧光定量PCR检测,具体操作如下:
1.总RNA的提取
(1)加入Trizol,剧烈震荡1min,室温保存10min;
(2)加氯仿0.2ml,剧烈震荡1min,充分混匀,室温下放置3min-5min;
(3)4℃,12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70%)到另一新离心管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质,移入新管,加入等体积异丙醇,1-2μl糖原,充分颠倒混匀,于-20℃保存6小时以上(保持离心管竖直状态);
(4)4℃,12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液;
(5)按1ml/ml Trizol的比例加入75%DEPC冷乙醇洗涤沉淀(-20℃保存),洗涤沉淀物,充分混合均匀,静置10min,4℃,12000rpm高速离心10min,弃掉上清液,重复一遍操作;
(6)室温下放置5min以充分晾干沉淀,加入10μl DEPC水溶解沉淀;
(7)用Nanodrop2000紫外分光光度计测定RNA纯度及浓度,冻存于-80℃或直接进行下游实验。
2.反转录获得cDNA:
(1)提取上述样品的外泌体中的RNA,作为模板,在去RNase的PCR管中加入模板(50-150ng)、RT引物(15-20pmol)和RNA free H2O至总体积12μl;
(2)将上述溶液混匀,65℃孵育5min,以打开RNA二级结构,随后立即置于冰上,防止RNA复性恢复二级结构;
(3)反转录:
反转录过程中,筛选出的miR-1248和miR-182-3p的特异性反转录RT引物序列如表1所示:
表1 miR-1248和miR-182-3p的特异性反转录RT引物序列
(4)向上述反应液中依次加入以下试剂:
(5)混匀后简短离心,42℃孵育60min;
(6)70℃灭活5min,即可获得cDNA。
3、荧光定量PCR
荧光定量PCR中,筛出的miR-1248和miR-182-3p的荧光定量PCR引物序列如表2所示。
表2 miR-1248和miR-182-3p的荧光定量PCR引物序列
(1)按以下反应体系对miR-1248和miR-182-3p分别进行荧光定量PCR:
(2)荧光定量PCR反应条件:
94℃30s,94℃5s,60℃34s读板40循环;溶解曲线分析:温度60℃-95℃。
Q-PCR检测乳腺癌患者与健康对照组血浆外泌体中miR-1248和miR-182-3p的表达,其相对表达水平以如图2所示。根据图2可知,研究组患者miR-1248和miR-182-3p的表达显著升高。因此它们可作为一种乳腺癌早期诊断的标志物。
实施例3
对乳腺癌患者跟进随访,外泌体内特异性miR-1248和miR-182-3p表达量更高的患者预后良好且无复发;miR-1248和miR-182-3p的AUC(area under curve)值分别为0.8533(95%CI:0.7621-0.9824)和0.8629(95%CI:0.7749-0.9785)。因此外泌体内特异性miR-1248和miR-182-3p可作为乳腺癌患者预后判断、疗效观察、复发监测的标志物。
实施例4
参照实施例2方法,采用Q-PCR对研究组患者外周血游离miR-1248和miR-182-3p的表达进行检测,与外泌体内miR-1248和miR-182-3p的表达进行对比,结果如图3所示。由图3结果可知,与检测外周血游离的miR-1248和miR-182-3p相比,外泌体内的miR-1248和miR-182-3p的变化更为灵敏。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 申请人
<120> 外泌体中microRNA在乳腺癌临床评估中的应用
<130> 1
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
accuucuugu auaagcacug ugcuaaa 27
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ugguucuaga cuugccaacu a 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gcgggcacct tcttgtataa gcactgt 27
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcgggctggt tctagacttg c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cagtgcaggg tccgaggtat 20
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccgattt 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgttgat 50
Claims (11)
1.一种检测microRNA的产品在制备乳腺癌的诊断、预后判断、疗效观察或复发监测的工具,或筛选治疗乳腺癌的药物中的应用,其中,所述microRNA为miR-1248和/或miR-182-3p。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述microRNA为血液外泌体中的microRNA。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品为检测microRNA的水平的产品。
4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述产品包含扩增microRNA的引物和/或检测microRNA的探针。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述扩增miR-1248的引物包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述扩增miR-182-3p的引物包含如SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列。
7.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述产品包含microRNA的反转录引物。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述miR-1248的反转录引物包含如SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列。
9.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述miR-182-3p的反转录引物包含如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列。
10.如权利要求1-9任一项所述的应用,其特征在于,所述产品为试剂盒,其包含:提取血液外泌体的试剂、提取血液外泌体RNA的试剂、RNA反转录试剂和RNA定量检测试剂。
11.如权利要求10所述的应用,其特征在于,所述乳腺癌为非浸润性癌或早期浸润性癌。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200117 |
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