CN114457004A - 生物样品中外泌体分离方法、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,包括:所述平衡缓冲液、洗涤液和洗脱液,所述平衡缓冲液中含有基础缓冲液和高价阳离子,所述高价阳离子选自Ca2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Al3+、Mn2+、Cu2+和Zn2+中的任意一种或多种。本发明还公开了一种使用该生物样品中外泌体分离试剂盒进行外泌体分离的方法。本发明还公开了所述生物样品中外泌体分离试剂盒在诊断或区分前列腺疾病、前列腺癌术后评估、前列腺癌预后评估中收集外泌体的应用和制备以外泌体为功能成分的治疗药物中等的应用。本发明还公开了诊断前列腺疾病的试剂盒和前列腺疾病分型试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域,具体涉及一种生物样品中外泌体分离方法、试剂盒及其应用。
背景技术
前列腺是男性生殖系统附属腺体中最大的腺体,在泌尿系统和生殖系统中均发挥重要作用。前列腺疾病主要包括前列腺炎、前列腺增生和前列腺癌,是成年男性泌尿生殖系统常见病,严重影响男性的健康状况和生活质量,已成为新的严重公共卫生问题之一。
目前对前列腺疾病的发病机制、病理生理学改变还不十分明确。在临床诊断、治疗方法及疗效评价等诸多方面尚无明确标准可依。直肠超声(TRUS)、前列腺特异抗原(PSA)、直肠指检(DRE)和穿刺活检是临床早期诊断前列腺疾病的常用手段,但这些方法要么存在侵入性患者可接受度低,要么存在滞后性或准确度低等问题,临床亟待一种快速、有效的检测方法,并能实时准确反映疾病进展状态。在精准医学时代,液态活检以其取样简单、可重复性、无放射性及创伤性等优势,适合应用于疾病的早期筛查与早期诊断。目前研究的比较多的液态活检领域包括循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、小分子RNA(micro RNA,miRNA)和外泌体(exosome)“三驾马车”。其中,外泌体(exosome),是活细胞分泌的大小为30-120nm的微小囊泡,广泛存在于唾液、血液、尿液和母乳等生物体液中,与多种疾病的发生、发展有相关性。其包含多种活性分子,如蛋白质、脂肪和核酸(mRNA、miRNA及其它非编码RNA)等,能作为信号分子传递给靶细胞,从而介导细胞间的物质传递与信息交流。
外泌体的特性:1)传递作用,携带相关分子(如RNA)信号,并具有传递、运输和调节作用;2)保护作用,具有生化稳定性,易于生化分子长期保存。这些优势,使外泌体在疾病诊断领域有显著的优势,为前列腺疾病的无创诊断提供了新的方向。
目前,市场上出现通过检测尿液中PCA3(前列腺癌抗原3)、PSA、ERG及SPDEF等基因的含量,判定是否患有前列腺癌。但存在一些缺陷和不足:1)受尿液个体差异影响较大,结果准确率较低,检出率低复检率较高;2)多个RNA靶标联合检测,增加了成本和操作复杂性;3)只针对前列腺癌和非癌进行区分,对于区分正常和前列腺炎/增生/癌的临床效果没有有效评价。
发明内容
基于此,有必要针对上述问题,提供一种生物样品中外泌体分离方法、试剂盒及其应用,其采用优化体系的阴离子交换层析柱法对生物样品中外泌体提取,可得到高得率和高纯度的外泌体,基于该外泌体进一步检测可用于检测前列腺癌等相关疾病,方法简便,检测准确性和区分度高。
本发明的第一目的在于提供一种生物样品中外泌体分离试剂盒,包括:所述平衡缓冲液、洗涤液和洗脱液,所述平衡缓冲液中含有基础缓冲液和高价阳离子,所述高价阳离子选自Ca2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Al3+、Mn2+、Cu2+和Zn2+中的任意一种或多种。
在一些实施方式中,所述试剂盒还包括分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱及其相关使用试剂,所述分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱中具有多孔结构填料,所述填料的孔结构的内表面修饰有正电荷。
在一些实施方式中,所述生物样品中外泌体分离试剂盒用于在诊断或区分前列腺疾病过程中收集生物样品中的外泌体。
在一些实施方式中,所述生物样品中外泌体分离试剂盒用在前列腺癌术后评估过程中收集生物样品中的外泌体。
在一些实施方式中,所述生物样品中外泌体分离试剂盒用在前列腺癌预后评估过程中收集生物样品中的外泌体。
本发明的第二目的在于提供所述的生物样品中外泌体分离试剂盒分离得到的外泌体在制备以外泌体为功能成分的治疗药物中的应用、作为靶向治疗载药载体中的应用、用于疾病诊断的标志物检测来源的应用、作为细胞间的信号分子的应用或者作为调节细胞间交流机制的活性因子的应用。
本发明的第三目的在于提供一种诊断前列腺疾病的试剂盒,包括PSA检测试剂和所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述前列腺疾病包括前列腺炎、前列腺增生和前列腺癌。
本发明的第四目的在于提供一种前列腺疾病分型试剂盒,包括PSA检测试剂和所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述试剂盒的检测结果能够区分前列腺炎和前列腺增生。
本发明的第五目的在于提供一种前列腺疾病分型试剂盒,包括PSA检测试剂和所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述试剂盒的检测结果能够区分前列腺炎和前列腺癌。
本发明的第六目的在于提供一种前列腺疾病分型试剂盒,包括PSA检测试剂和所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述试剂盒的检测结果能够区分前列腺增生和前列腺癌。
本发明的第七目的在于提供一种生物样品中外泌体分离方法,包括如下步骤:
使用所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡;
将生物样品加入平衡后的阴离子交换层析柱中进行吸附;
使用所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述洗涤液对吸附后的阴离子交换层析柱进行清洗;
使用所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述洗脱液对清洗后的阴离子交换层析柱进行洗脱并收集洗脱液。
本发明的第八目的在于提供一种PSA的检测试剂在制备诊断前列腺疾病的试剂盒、区分前列腺炎和前列腺增生的试剂盒、区分前列腺炎和前列腺癌的试剂盒或区分前列腺增生和前列腺癌的试剂盒中的应用。
本发明采用使用阴离子交换层析柱法对生物样品中的外泌体进行提取分离,包括对阴离子交换柱的平衡、加样、洗涤和洗脱,实现生物样品中的外泌体的分离。相对于常规的离子交换体系,本发明对阴离子交换层析的平衡缓冲液的组分进行优化,在平衡缓冲液中添加高价阳离子,能够明显提高外泌体提取的得率和纯度。
进一步的,使用本发明优化的体系进行阴离子交换层析柱法粗提外泌体后再使用分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱纯化,得率和纯度进一步明显提高。
本发明富集的外泌体可通过对其进一步的核酸分子检测、蛋白检测和粒径检测,用于疾病的诊断。本发明方法富集的外泌体的完整性好,可用于流式分选。富集的外泌体具有完好的生物活性,可用于制备以外泌体为功能成分的治疗药物等下游应用。由于本发明富集的外泌体的得率高、纯度高,从而基于该外泌体的检测结果准确度高。采用本发明方法富集尿液外泌体检测PSA,可用于区分健康/前列腺炎/增生和前列腺癌等前列腺疾病,其区分能力优于尿液直接检测PSA的区分能力以及其他来源,如血浆来源的外泌体检测PSA进行区分的能力。采用本发明方法富集前列腺癌样本的外泌体进行进一步的检测,可用于评估治疗方案的效果,例如手术治疗效果或者预后效果。
附图说明
图1为本发明一实施例的尿液外泌体富集流段效果对比PCR结果图;
图2为本发明一实施例的不同浓度洗脱液缓冲液体系富集尿液外泌体效果对比PCR结果图;
图3为本发明一实施例的不同方法富集尿液外泌体效果对比PCR结果图;
图4为本发明一实施例的尿液外泌体富集和检测流程图;
图5为本发明一实施例的不同方法纯化外泌体后外泌体标志物检测效果对比图;
图6为本发明一实施例的不同方法纯化外泌体后去IgG蛋白干扰检测效果对比图;
图7为本发明一实施例富集的外泌体的流式检测图;
图8为本发明一实施例富集的外泌体的MTT试验图;
图9为本发明一实施例的尿液外泌体检测PSA区分健康/前列腺疾病(增生和炎症和癌)效果图;
图10为本发明一实施例尿液外泌体检测PSA区分健康/前列腺良性疾病(炎症和增生)效果图;
图11为本发明一实施例的尿液外泌体检测PSA区分癌/前列腺良性疾病(增生和炎症)效果图;
图12为本发明一实施例的尿液外泌体检测PSA区分前列腺增生/炎症效果图;
图13为本发明一实施例的尿液外泌体检测PSA区分前列腺增生/癌效果图;
图14为本发明一实施例的术前术后PSA检测图;
图15为本发明一实施例的治疗前后PSA检测图;
图16为本发明一实施例的尿液外泌体PSA表达水平与患者PFS关系图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
第一方面,本发明提供一种生物样品中外泌体分离试剂盒,包括:所述平衡缓冲液、洗涤液和洗脱液,所述平衡缓冲液中含有基础缓冲液和高价阳离子,所述高价阳离子选自Ca2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Al3+、Mn2+、Cu2+和Zn2+中的任意一种或多种。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如,包装或容器),试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
在一些实施方式中,该生物样品中外泌体分离试剂盒至少用于进行阴离子交换层析反应,该试剂盒还包括阴离子交换层析柱和固定相。
本发明采用使用阴离子交换层析柱法对生物样品中的外泌体进行提取分离,包括对阴离子交换柱的平衡、加样、洗涤和洗脱,实现生物样品中的外泌体的分离。相对于常规的离子交换体系,本发明对阴离子交换层析的平衡缓冲液的组分进行优化,在平衡缓冲液中添加高价阳离子,能够明显提高外泌体提取的得率和纯度。
离子交换层析法的基本原理如下所示:离子交换层析的固定相是离子交换剂,它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质(固定相)、电荷基团和平衡离子(即本文所使用的平衡缓冲液)。电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子,它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应,就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。
阴离子交换剂的电荷基团带正电,装柱平衡后,与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后,负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应,而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液,如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加,洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换,而将各种负电基团置换出来,随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来,而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来,这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来,从而达到分离目的。
本发明使用的离子交换层析柱,经平衡缓冲液对层析柱洗涤后,固定相上带正电荷基团与平衡缓冲液中的带负电离子结合,达到柱平衡,然后可将生物样品中的外泌体结合在阴离子交换柱的固定相上,经洗脱液,可将结合的外泌体洗脱下来进行富集。
本文所涉及的所述生物样品可选自尿液、血液、血浆、细胞培养液、胸腹水和灌洗液中的至少一种。
在一些实施方式中,所述高价阳离子以其氯盐形式存在于所述平衡缓冲液中。例如CaCl2、MgCl2、FeCl3、FeCl2、AlCl3、Mn Cl2、CuCl2和ZnCl2。
在一些实施方式中,所述基础缓冲液可选自NaCl缓冲液、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液和磷酸盐缓冲液中的至少一种。
在一些实施方式中,所述洗脱液中含有氯化钠和磷酸钠。
在一些实施方式中,所述洗涤液中含有氯化钠和磷酸钠。
优选地,所述试剂盒还包括分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱及其相关使用试剂,所述分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱中具有多孔结构填料,所述填料的孔结构的内表面修饰有正电荷。用于对生物样品在阴离子交换柱中经平衡缓冲液、加样、洗涤液洗涤和洗脱液洗脱收集得到的洗脱液进行纯化。该分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱使得收集得到的洗脱液中的外泌体从所述分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱中洗脱下来,而所述收集得到的洗脱液中的带负电荷的杂质截留在所述分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱的所述多孔结构填料中。
使用本发明优化的体系进行阴离子交换层析柱法粗提外泌体后再使用分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱纯化,得率和纯度进一步明显提高。
本发明优化的体系进行阴离子交换层析柱法粗提外泌体后再使用分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱纯化的方法,富集的外泌体可通过对其进一步的核酸分子检测、蛋白检测和粒径检测,用于疾病的诊断。本发明方法富集的外泌体的完整性好,可用于流式分选。富集的外泌体具有完好的生物活性,可用于制备以外泌体为功能成分的治疗药物等下游应用。由于本发明富集的外泌体的得率高、纯度高,从而基于该外泌体的检测结果准确度高。采用本发明方法富集尿液外泌体检测PSA,可用于区分健康/前列腺炎/增生和前列腺癌等前列腺疾病,其区分能力优于尿液直接检测PSA的区分能力以及其他来源,如血浆来源的外泌体检测PSA进行区分的能力。采用本发明方法富集前列腺癌样本的外泌体进行进一步的检测,可用于评估治疗方案的效果,例如手术治疗效果或者预后效果。
在一些实施方式中,所述生物样品中外泌体分离试剂盒用于在诊断或区分前列腺疾病过程中收集生物样品中的外泌体。
基于所述的生物样品中外泌体分离试剂盒富集得到的外泌体,通过进一步的核酸或者蛋白质检测,可用于区分健康和前列腺疾病,还可用于区分为何种前列腺疾病。
本发明证实,相对于其他类型的生物样品,采用本发明试剂盒富集的尿液样品中的外泌体在诊断或区分前列腺疾病上的区分度和灵敏度更高。
在一些实施方式中,所述生物样品中外泌体分离试剂盒用在前列腺癌术后评估过程中收集生物样品中的外泌体。
在一些实施方式中,所述生物样品中外泌体分离试剂盒用在前列腺癌预后评估过程中收集生物样品中的外泌体。
第二方面,本发明实施例提供所述的生物样品中外泌体分离试剂盒在制备以外泌体为功能成分的治疗药物中的应用、作为靶向治疗载药载体中的应用、用于疾病诊断的标志物检测来源的应用、作为细胞间的信号分子的应用(用于细胞间交流)或者作为调节细胞间交流机制的活性因子的应用(从而调节细胞活性)。基于所述的生物样品中外泌体分离试剂盒富集得到的外泌体完整性好,活性高,可用于治疗等对外泌体活性要求高的下游应用,例如用具有抗性的外泌体抑制肿瘤增殖。
第三方面,本发明实施例提供一种诊断前列腺疾病的试剂盒,包括PSA检测试剂和所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述前列腺疾病包括前列腺炎、前列腺增生和前列腺癌。
第四方面,本发明实施例提供一种前列腺疾病分型试剂盒,包括PSA检测试剂和所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述试剂盒的检测结果能够区分前列腺炎和前列腺增生。
第五方面,本发明实施例提供一种前列腺疾病分型试剂盒,包括PSA检测试剂和所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述试剂盒的检测结果能够区分前列腺炎和前列腺癌。
第六方面,本发明实施例提供一种前列腺疾病分型试剂盒,包括PSA检测试剂和所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述试剂盒的检测结果能够区分前列腺增生和前列腺癌。
PSA检测试剂可以为核酸检测试剂或者蛋白检测试剂。
第七方面,本发明实施例提供一种生物样品中外泌体分离方法,包括如下步骤:
使用所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡;
将生物样品加入平衡后的阴离子交换层析柱中进行吸附;
使用所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述洗涤液对吸附后的阴离子交换层析柱进行清洗;
使用所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述洗脱液对清洗后的阴离子交换层析柱进行洗脱并收集洗脱液。
在一些实施方式中,所述Ca2+在所述平衡缓冲液中的浓度为0.5mmol/L~2mmol/L。具体可以为0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1.0mmol/L、1.1mmol/L、1.2mmol/L、1.3mmol/L、1.4mmol/L、1.5mmol/L、1.6mmol/L、1.7mmol/L、1.8mmol/L、1.9mmol/L、2.0mmol/L。
在一些实施方式中,所述Mg2+在所述平衡缓冲液中的浓度为0.1mmol/L~1mmol/L。具体可以为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1.0mmol/L。
在一些实施方式中,所述Fe3+在所述平衡缓冲液中的浓度为0.1mmol/L~1mmol/L。具体可以为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1.0mmol/L。
在一些实施方式中,所述Fe2+在所述平衡缓冲液中的浓度为0.1mmol/L~1mmol/L。具体可以为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1.0mmol/L。
在一些实施方式中,所述Zn2+在所述平衡缓冲液中的浓度为0.5mmol/L~1.5mmol/L。具体可以为0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1.0mmol/L、1.1mmol/L、1.2mmol/L、1.3mmol/L、1.4mmol/L、1.5mmol/L。
在一些实施方式中,所述Al3+在所述平衡缓冲液中的浓度为0.5mmol/L~2mmol/L。具体可以为0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1.0mmol/L、1.1mmol/L、1.2mmol/L、1.3mmol/L、1.4mmol/L、1.5mmol/L、1.6mmol/L、1.7mmol/L、1.8mmol/L、1.9mmol/L、2.0mmol/L。
在一些实施方式中,所述Cu2+在所述平衡缓冲液中的浓度为0.5mmol/L~3mmol/L。具体可以为0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1.0mmol/L、1.1mmol/L、1.2mmol/L、1.3mmol/L、1.4mmol/L、1.5mmol/L、1.6mmol/L、1.7mmol/L、1.8mmol/L、1.9mmol/L、2.0mmol/L、2.1mmol/L、2.2mmol/L、2.3mmol/L、2.4mmol/L、2.5mmol/L、2.6mmol/L、2.7mmol/L、2.8mmol/L、2.9mmol/L、3.0mmol/L。
在一些实施方式中,所述Mn2+在所述平衡缓冲液中的浓度为1.5mmol/L~3mmol/L。具体可以为1.5mmol/L、1.6mmol/L、1.7mmol/L、1.8mmol/L、1.9mmol/L、2.0mmol/L、2.1mmol/L、2.2mmol/L、2.3mmol/L、2.4mmol/L、2.5mmol/L、2.6mmol/L、2.7mmol/L、2.8mmol/L、2.9mmol/L、3.0mmol/L。
在一些实施方式中,所述基础缓冲液为NaCl缓冲液,NaCl缓冲液的浓度为(0.01~0.2)mol/L,pH为7.0~8.0。
在一些实施方式中,所述基础缓冲液为Tris-HCl缓冲液,所述Tris-HCl缓冲液的浓度为(0.02~0.2)mol/L,pH为7.0~9.0。
在一些实施方式中,所述基础缓冲液为PBS缓冲液,所述PBS缓冲液的浓度为(0.01~0.1)mol/L,pH为7.0~8.0。
在一些实施方式中,所述基础缓冲液为磷酸盐缓冲液,所述磷酸盐缓冲液的浓度为(0.01~0.1)mol/L,pH为7.0~8.0。在一些实施方式中,所述洗脱液中的氯化钠的浓度为200mmol/L~1000mmol/L。具体可以为200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L、500mmol/L、600mmol/L、700mmol/L、800mmol/L、900mmol/L、1000mmol/L。
在一些实施方式中,所述洗脱液中的磷酸钠的浓度为30mmol/L~100mmol/L。具体可以为30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L。
在一些实施方式中,生物样品中外泌体分离方法还包括对收集得到的洗脱液进行外泌体纯化,纯化的方法可以包括常规的PEG沉淀法、超速离心法和普通分子凝胶排阻法。优选的,本发明采用分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱法进行纯化。采用上述实施例的优化的阴离子交换层析柱体系进行粗提后,再结合特殊的分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱法进行纯化,相互配合,能够进一步提高外泌体的得率和纯度。
优选地,所述纯化包括步骤:
将收集得到的洗脱液加入分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱进行洗脱,所述分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱中具有多孔结构填料,所述填料的孔结构的内表面修饰有正电荷,使得所述收集得到的洗脱液中的外泌体从所述分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱中洗脱下来,而所述收集得到的洗脱液中的带负电荷的杂质截留在所述分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱的所述多孔结构填料中。
第八方面,提供一种PSA的检测试剂在制备诊断前列腺疾病的试剂盒、区分前列腺炎和前列腺增生的试剂盒、区分前列腺炎和前列腺癌的试剂盒或区分前列腺增生和前列腺癌的试剂盒中的应用。
PSA的检测试剂包括核酸分子(PCR)检测试剂、蛋白检测试剂(化学发光/WB/BCA等)和NTA粒径检测试剂中的一种或多种。
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1尿液总外泌体富集与纯化方法
1.1尿液总外泌体富集-阴离子交换层析柱富集总外泌体
阴离子交换层析柱富集总外泌体步骤为:
在阴离子交换柱中加入8-20ml平衡缓冲液清洗柱达到平衡;
倒掉流出液,加入尿液样本(多批次),弃掉流出液;
加入20-50ml洗涤液,清洗柱子蛋白和杂质,弃掉流出液;
然后用5mL洗脱液洗脱结合的物质,收集流出液;
然后用2mL洗脱液洗脱结合的物质,收集流出液,即为尿液总外泌体。
对照组一:PEG沉淀法富集总外泌体
尿液与PEG20000沉淀剂1:1混合;上下颠倒5次混匀后,在4-8℃静置过夜;然后13000rpm离心2分钟,吸弃上清留沉淀,加入500-1000μL PBS重悬混匀,即得到总外泌体。
对照组二:超速离心法富集总外泌体
尿液样本,采用超速离心法(4℃,120000g离心4h)富集,沉淀用500-1000μLPBS重悬混匀,即得到总外泌体。
1.2富集的总外泌体纯化
利用分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱进行纯化,步骤为:
在分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱中加入5ml PBS清洗柱达到平衡;
倒掉流出液,加入步骤2.1中阴离子交换层析柱富集的总外泌体(0.5-5ml),收集流出液;
然后再500g离心3min,收集流出液,即为高纯度的尿液总外泌体。
1.3尿液外泌体mRNA靶向捕获
(技术方法同专利《CN103849683B前列腺癌尿液检测试剂盒及其应用》)。
1.4尿液外泌体mRNA一步法检测
采用一步法RT-qPCR检测尿液外泌体mRNA(技术方法同专利《CN103849683B前列腺癌尿液检测试剂盒及其应用》)。
实施例2离子交换富集的平衡缓冲液优化
分别对比了表1所示以下4种缓冲液体系:在阴离子交换柱平衡过程,体系1、体系2和体系3选用常规磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液;体系4是在常规缓冲液(Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液或磷酸盐缓冲液)中加入高价阳离子,用以结合离子交换柱释放的阴离子,从而使离子交换柱产生更多的正电荷用以与外泌体结合。
表1
1)样本预处理:混合总尿液2000ml,收集在无菌容器中,4℃,14000g,离心10min并用0.22um过滤以除细胞和细胞碎片。然后100ml/管,分装15份。
2)分别采用阴离子交换层析柱富集总外泌体方法,采用表1各体系,富集尿液总外泌体,洗脱过程2ml/管分段收集(2-10ml)。
阴离子交换层析柱富集总外泌体步骤为:
在阴离子交换柱中加入8-20ml平衡缓冲液清洗柱达到平衡;
倒掉流出液,加入尿液样本(多批次),弃掉流出液;
加入20-50ml洗涤液,清洗柱子蛋白和杂质,弃掉流出液;
然后用5mL洗脱液洗脱结合的物质,收集流出液;
然后用2mL洗脱液洗脱结合的物质,收集流出液,即为尿液总外泌体。
3)采用化学发光法检测获得的外泌体蛋白标志物(CD-63)含量。
化学发光法蛋白定量检测步骤:
a.包板
化学发光板100μl/孔4℃过夜包板;
洗板机1×PBST洗板1次,拍干;
酶标板稳定剂Ⅰ200μl/孔,37℃,2h;
甩去酶标板稳定剂Ⅰ,拍干,37℃烘干,30min,铝箔袋封装。
b.检测
标曲、待检样本100μl/孔,37℃,1h;
洗板机1×PBST洗板3次,拍干;
抗体100μl/孔,37℃,1h;
洗板机1×PBST洗板3次,拍干;
化学发光A、B液1:1混合,100μl/孔,Lumo上机检测。
4)采用NTA粒径分析检测获得的总外泌体含量。
5)采用RT-PCR检测获得的外泌体内参标志物miR-16表达量;
检测miR-16所用的引物序列如下表2所示:
表2miR-16检测的引物/探针序列
引物名称 | 引物序列(5'--3') |
miR-16RT-primer | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA |
miR-16F-primer | CGCGCTAGCAGCACGTAAAT |
miR-16R-primer | GTGCAGGGTCCGAGGT |
miR-16Probe | FAM-TGGATACGACAACTATAC-MGB |
反转录:采用如下表3反转录体系,和反转录程序:冰上,5min;PCR仪上:42℃,30min;85℃,5min;反转录产物cDNA稀释10倍后上机进行qPCR验证。
表3反转录体系
采用如下表4所示的qPCR检测体系:
表4qPCR检测体系
采用如下表5所示热循环程序进行qPCR检测:
表5热循环程序
结果如表6和7所示:
表6不同缓冲液体系富集尿液外泌体效果对比NTA和外泌体内参miR-16(PCR)检测
表7不同pH缓冲液体系富集尿液外泌体效果对比
表6、7的结果表明:从外泌体NTA、蛋白CD63检测和外泌体miRNA检测结果看,1)常规平衡缓冲液(氯化钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液或磷酸盐缓冲液)对于外泌体得率无明显差异(表6)。2)PBS缓冲液中加入高价阳离子可以显著提高富集外泌体效率(表6)。3)缓冲液在不同pH(7.0~8.0)条件下外加高价阳离子均可有效提高外泌体富集得率(表7)。同样验证了(氯化钠缓冲液(pH 7.0~9.0)、Tris-HCl缓冲液(pH 7.0~9.0)、或其他磷酸盐缓冲液(pH 7.0~8.0)加入高价阳离子后也可同样提高富集外泌体效率(表7)。综合分析,体系4(常规缓冲液外加高价阳离子)富集外泌体效能较优。
实施例3离子交换富集的洗脱条件优化
采用离子交换色谱法,对尿液外泌体富集条件进行优化,以达到简便的操作流程和较好的富集效果。分别对比了表8所示不同馏段和不同洗脱液浓度效果。该实施例使用的平衡缓冲液为PBS缓冲液0.02mol/L(pH 7.4)。洗涤液为100mM氯化钠缓冲液和50mM磷酸钠缓冲液。
表8
具体步骤为:
1)样本预处理:混合总尿液2000ml,收集在无菌容器中,4℃,14000g/离心10min并用0.22um过滤以除细胞和细胞碎片。然后100ml/管,分装15份。
2)分别采用离子交换层析方法(方法同实施例2),富集尿液总外泌体,洗脱过程2ml/管分段收集(2-10ml)。
3)采用化学发光法检测获得的外泌体蛋白标志物(CD-63)含量:
化学发光法蛋白定量检测步骤(方法同实施例2)
4)采用RT-PCR检测获得的外泌体内参标志物miR-16表达量(方法同实施例2)。
结果如图1~2和表9所示。
表9不同浓度洗脱液体系富集尿液外泌体效果对比结果
结果表明:以浓度>1E+08particles/ml、miRNA的CP值在25-30之间、外泌体蛋白CD63含量>100pg/mL作为有效富集外泌体的评价指标。结果如图1~2、表9所示:1)外泌体出峰主要集中在第6ml,外泌体得率明显高于其他馏段。2)从洗脱液优化效果看,随着洗脱液浓度增高CD-63蛋白检测值也增加,miRNA表达量也呈现升高趋势。但洗脱液浓度过高(1000mM以上)时,外泌体得率没有显著提高,而杂质(沉淀蛋白、疏水蛋白、脂类物质等)也会随之洗脱下来,不仅影响外泌体纯度,高盐对后续PCR检测也有一定抑制作用。综合分析,本实施例优化方案(洗脱液氯化钠浓度200mM~1000mM之间)可更好富集外泌体。
实施例4总尿液外泌体富集技术对比
考虑到尿液样本体积大,外泌体含量低等因素影响,先将总尿液进行浓缩,初步富集得到尿液总外泌体,则会提高检测效率。所以选择可用于大体积样本富集的3种技术方法(阴离子交换层析柱、PEG沉淀法和超速离心法)进行对比验证。
验证方法与步骤如下:
1)样本预处理:总尿液400ml/例,收集在无菌容器中,4℃,14000g/离心10min并用0.22um过滤以除细胞和细胞碎片。然后100ml/管,分装3份。
2)分别采用各总外泌体富集方法(实施例2的阴离子交换层析柱、PEG沉淀法和超速离心法),富集尿液总外泌体。
阴离子交换层析柱使用的体系如表1,其中,平衡缓冲液为PBS缓冲液0.02mol/L(pH 7.4)含1mmol/LCaCl2和0.5mmol/L MgCl2;洗涤液为100mM氯化钠缓冲液和50mM磷酸钠缓冲液,洗脱液为氯化钠Buffer1000mM和50mM磷酸钠Buffer。
对照组一:PEG沉淀法富集总外泌体
尿液与PEG20000沉淀剂1:1混合;上下颠倒5次混匀后,在4-8℃静置过夜;然后13000rpm离心2分钟,吸弃上清留沉淀,加入500-1000μL PBS重悬混匀,即得到总外泌体。
对照组二:超速离心法富集总外泌体
尿液样本,采用超速离心法(4℃,120000g离心4h)富集,沉淀用500-1000μLPBS重悬混匀,即得到总外泌体。
3)采用NTA粒径分析检测获得的总外泌体含量。
4)采用化学发光法检测获得的外泌体蛋白标志物(CD-63)。
表10不同方法富集尿液外泌体效果对比结果(外泌体蛋白CD63)
结果如图3和表10所示:相对于其他富集方法,通过本实施例的优化的离子交换技术获得的尿液总外泌体量最高,粒径大小在80~150nm,且重复性和稳定性较好。
实施例5富集的总尿液外泌体纯化
基于离子交换技术粗提尿液总外泌体,总体上起到对大体积尿液的浓缩作用,同时也会存在一些同样带负电荷杂质(蛋白、核酸和大囊泡等)的干扰,尤其是游离核酸,对下游mRNA检测会有一定影响。所以,本实施例进一步对实施例4的阴离子交换层析柱法富集的总外泌体进行纯化。
(一)、本实施例利用分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱进行纯化。分别对比了不同方法(分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱法、PEG沉淀法、超速离心法、普通分子凝胶排阻法)纯化外泌体的效果区别。
分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱筛选要求如表11所示。
表11
具体步骤为:
1)样本预处理:总尿液外泌体,1ml/管,分装3份。
2)分别采用不同方法(分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱法、PEG沉淀法、超速离心法、普通分子凝胶排阻法),纯化总外泌体。分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱与普通离子交换层析的原理对比如图4所示。
利用分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱进行纯化,步骤为:
在分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱中加入5ml PBS清洗柱达到平衡;
倒掉流出液,加入步骤2.1中阴离子交换层析柱富集的总外泌体(0.5-5ml),收集流出液;
然后再500g离心3min,收集流出液,即为高纯度的尿液总外泌体。
3)采用NTA粒径分析检测获得的总外泌体含量。
4)采用BCA技术测得总蛋白含量,操作步骤如下:
1.按照加样模板,在96孔板中加入稀释的标准品与样本,25μL/孔;
2.向每个孔中加入200μLBCA工作液;
3.震荡30秒以充分混合。将微孔板密封,37℃下孵育30分钟;
4.微孔板冷却到室温后,用酶标仪测量562nm或该波长附近的吸光值(540-590nm范围内均可);
5.绘制标准曲线,计算蛋白样本的浓度:
将各个标准品和待测蛋白质样本在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值;
将BSA标准品在562nm处经过空白校正的平均吸光值对其浓度(μg/mL)作图,绘制标准曲线;
6.使用该标准曲线确定每个待测蛋白质样品的蛋白质浓度
采用WB方法测定外泌体标志物和杂蛋白含量。
结果如图5~6和表12所示。
图5~6中,M:Protein Marker,1和2:分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱法,3和4:PEG沉淀法,5和6:超速离心法,7和8:普通分子凝胶排阻法。
表12不同复合型层析介质富集纯化外泌体效果对比
如图如图5~6和表11所示,分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱法中,外泌体蛋白标志物(Alix)检测比普通分子凝胶排阻法和超速离心法要好,并且能去除大部分IgG蛋白干扰。PGE沉淀法虽然外泌体蛋白标志物(Alix)检测含量较高,但IgG蛋白干扰较为严重,纯度较差。综合分析,对总外泌体纯化,分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱法较优。
(二)、采用(一)中的分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱法条件去除游离核酸和杂蛋白干扰效果评价
1)通过对血浆样本和蛋白模拟样本纯化前后,A280检测总蛋白含量对比,计算拦截杂蛋白效率。
2)通过在样本中外投核酸(miRNA和mRNA),PCR检测纯化前后核酸量变化,计算拦截游离核酸效率。
结果如表13-1、13-2和14-1、14-2、14-3所示。
表13-1复合层析色谱柱法对血浆样本中蛋白的去除效率
表13-2复合层析色谱柱法对蛋白模拟样本中蛋白的去除效率
表14-1复合层析色谱柱法对样本中游离核酸的去除效率
表14-2
表14-3
表13-1、13-2和14-1、14-2、14-3所示结果表明:复合层析色谱柱法纯化的外泌体,对样本中蛋白的拦截效率>90%。对于游离核酸的拦截效果>99%。可有效对上述采用离子交换技术粗提的总尿液外泌体进行纯化,进一步获得高纯度、高含量的尿液外泌体。
实施例6粗提+纯化组合富集外泌体效果评价。
注:本实施例的粗提+纯化组合技术为使用实施例4的阴离子交换层析柱法粗提总外泌体再使用实施例5的分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱法对粗提总外泌体进行纯化。
参考文献使用的常规离子交换技术的平衡缓冲液为50mM氯化钠Buffer和50mM磷酸钠Buffer。洗涤液为100mM氯化钠Buffer和50mM磷酸钠Buffer。洗脱液为500mM氯化钠Buffer和50mM磷酸钠Buffer。
6.1对比外泌体富集技术(粗提+纯化组合)优化前后外泌体富集效果。
1)采用NTA粒径分析检测获得的总外泌体含量;
2)采用BCA技术测得总蛋白含量。
表15
结果如表15所示:使用本发明优化的体系进行阴离子交换层析柱法粗提再使用分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱纯化,比优化前得率和纯度明显提高5-10倍。
6.2对比(粗提+纯化组合)技术富集外泌体完整性验证。
将粗提+纯化组合技术富集的外泌体采用RNase消化和Triton X-100(0.3%)处理,检测外泌体破损以及RNA释放情况,验证外泌体完整性,如表16所示。
表16
实验编号 | 实验组 | 处理 |
1 | 外泌体(对照) | 不加RNase及Triton其余操作同下 |
2 | 外泌体(实验组1) | 直接加RNase消化处理 |
3 | 外泌体(实验组2) | 加Triton-破膜处理后再加RNase消化 |
采用RT-PCR检测获得的外泌体内参标志物miR-16表达量(方法同上)。
表17外泌体完整性
实验编号 | 实验组 | 处理 | miR-16(Cp值) |
1 | 外泌体(对照) | 不加RNase及Triton其余操作同下 | 27.69 |
2 | 外泌体(实验组1) | 直接加RNase消化处理 | 27.76 |
3 | 外泌体(实验组2) | 加Triton-破膜处理后再加RNase消化 | 40.22 |
结果如表17所示:1)外泌体直接加RNase消化处理未处理对照组相比,miR-16检测值无明显差异。2)外泌体加Triton-破膜处理后释放后再加RNase消化后,基本检测不到miR-16。综合对比说明,(粗提+纯化组合)技术富集的外泌体基本没有游离核酸干扰,检测到的miR-16全部来自外泌体囊泡内包含,从而进一步说明该技术方法富集的外泌体具有良好的完整性。
6.3(粗提+纯化组合)技术富集不同样本类型外泌体
验证方法如下:
1)采用(粗提+纯化组合)技术富集不同类型(血清/血浆、细胞上清培养液、胸腹水、肺泡灌洗液等)样本,同时对比金标准(超速离心)和商业化试剂盒的富集效果。
2)采用化学发光法检测获得的外泌体蛋白标志物(CD-63)含量。
化学发光法蛋白定量检测步骤(方法同5.1)。
3)采用NTA粒径分析检测获得的总外泌体含量。
表18不同样本类型外泌体富集
结果如表18所示:1)不同样本类型中外泌体含量有很大差异,主要与不同样本中外泌体丰度有关。但本实施例用的(粗提+纯化组合)技术均可富集到外泌体。2)粗提+纯化组合方法在不同样本类型外泌体富集效果方面(外泌体颗粒数和蛋白量)均优于金标准超速离心法。3)与(SBI)商业化试剂盒相比:血液样本(血清血浆)中外泌体富集,本实施例的粗提+纯化组合方法和商业化试剂盒在外泌体蛋白含量方面无显著差异,但NTA检测方面商业试剂盒明显要高,主要原因是商业化试剂盒(PEG沉淀法)富集外泌体含有杂质较多,纯度差。而,对于细胞培养液、胸腹水和灌洗液等大体积样本,本实施例的粗提+纯化组合方法富集外泌体明显优于商业试剂盒。说明该技术方法可用于不同样本类型的外泌体富集及纯化,并且对比金标准和商业化试剂盒均具有一定优势。
6.4(粗提+纯化组合)技术富集外泌体用于其他下游分析检测
(粗提+纯化组合)技术富集外泌体上述已验证可用于下游核酸分子(PCR)检测、蛋白检测(化学发光/WB/BCA等)和NTA检测,再验证其他下游应用可行性。
验证方法如下:
荧光流式分析
①将粗提+纯化组合技术富集的外泌体采用EpCAM免疫磁珠捕获,形成磁珠-外泌体复合体;
②磁珠-外泌体复合体加PBS(含1%BSA)至100ul,加入5ul anti-CD63-APC,4℃,1h;
③磁分离,弃上清,PBS(含1%BSA)洗两遍,重悬至500ul,流式分析磁珠表面荧光强度。
2)采用MTT技术验证外泌体活性
采用MTT技术,将A549细胞上清富集的外泌体与THP-1细胞共培养,通过细胞增殖情况验证捕获到的TTF-1阳性外泌体活性。
MTT试验步骤:
①铺板:胰酶消化对数期细胞,细胞计数调整浓度至5x104/ml,将混合好的细胞悬液分装到6孔板中,每孔加2ml。试验分为三组:空白组,孔中加入2ml完全培养基;对照组,孔中加入细胞悬液;试验组,孔中加入细胞悬液和外泌体,共3块6孔板。
②细胞培养:将6孔板放入co2恒温培养箱培养。
③分别在8h,16h,24h对6孔板进行处理,每孔加入200ul MTT(5mg/ml)溶液,继续培养4-6h。
④弃培养基,加入150ul DMSO,至于摇床低速震荡10min,溶解沉淀。
⑤在酶标仪检测490nm波长处各个处理组的OD值。
如图7显示:(粗提+纯化组合)技术富集的外泌体可用于流式分选,可以检测到EpCAM和CD63双阳性外泌体,阳性率>90%。如图8显示:随着时间增加,实验组出现明显的细胞抑制增殖情况,说明(粗提+纯化组合)技术富集的肺癌外泌体具有完好的生物活性,可用于治疗等对外泌体活性要求高的下游应用。
实施例7不同方法富集的尿液外泌体mRNA(PSA)检测用于前列腺疾病诊断效能评价。
注:本实施例的粗提+纯化组合技术为使用实施例4的阴离子交换层析柱法粗提总外泌体再使用实施例5的分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱法对粗提总外泌体进行纯化。
使用的常规离子交换技术的平衡缓冲液为常规缓冲液:Tris-HCl缓冲液0.02mol/L(pH 7.4)加MgCl2浓度浓度0.5mmol/L。洗涤液为100mM氯化钠Buffer和50mM磷酸钠Buffer。洗脱液为1000mM氯化钠Buffer和50mM磷酸钠Buffer。
7.1总尿液外泌体mRNA检测效果评价
1)样本预处理:总尿液收集在无菌容器中,4℃,14000g/离心10min并用0.22μm过滤以除细胞和细胞碎片。
2)取相同体积尿液分别采用总外泌体富集方法(常规离子交换技术和(粗提+纯化)组合),富集尿液总外泌体。
3)采用相同体积全尿液直接检测尿液mRNA(技术方法同专利《CN103849683B前列腺癌尿液检测试剂盒及其应用》)
4)采用尿液外泌体靶标(PSA)和内参(SPDEF、GAPDH)捕获及定量RT-PCR检测获得的外泌体mRNA标志物PSA相对表达量;
检测PSA所用的引物序列如下表19所示:
表19PSA检测的引物/探针序列
表20总尿液外泌体mRNA检测效果评价对比
结果如表20所示:在同等尿液量条件下,1)尿液直接检测PSA表达量更高,但重复性较差,主要原因PSA(包括胞外囊泡、细胞及碎片、游离RNA和RNA-蛋白复合体等)来源比较复杂。2)经过尿液外泌体富集后,重复性明显变好,并且(粗提+纯化)组合后富集尿液外泌体PSA表达量明显高于优化前离子交换法。另外,可通过扩大尿液样本量(粗提+纯化)组合富集纯化外泌体后检测,PSA表达量远远高于尿液直接检测(表19),而无法通过扩大尿液量直接检测。总和分析,通过扩大样本量并利用(粗提+纯化)组合法富集纯化外泌体后检测PSA,其重复性和表达量可达到理想效果。
7.2总尿液外泌体mRNA检测用于前列腺疾病诊断效果评价
分别入组了健康人21例、前列腺炎18例、前列腺增生19例和前列腺癌21例检测评价,同时获取晨尿并抽取血液富集血清。其中尿液和部分血清富集外泌体检测PSA和内参;另取部分血清采用试剂盒定量检测血清总t-PSA(以0~2μg/L和0~4μg/L为参考值范围)。
1)样本预处理:尿液收集在无菌容器中,4℃,14000g/离心10min并用0.22μm过滤以除细胞和细胞碎片。同时抽取空腹静脉血5ml,3000r/min离心10min,分离血清后放-20℃冰箱保存。所有样本一周内完成检测。
2)分别采用(粗提+纯化)组合法,富集尿液总外泌体。
3)采用尿液外泌体PSA(靶标)和内参基因捕获及定量RT-PCR技术检测获得的外泌体mRNA标志物PSA表达量。对检测结果采用SPSS20进行t检测分析P<0.05。
4)尿液外泌体检测结果与尿液PSA、血清PSA和血清外泌体PSA直接检测效果对比。
表21总尿液外泌体mRNA检测用于前列腺疾病诊断效果
结果如图9~13所示:1)大体积全尿外泌体粗提加二次纯化后对PSA特异捕获并定量PCR检测,对于前列腺疾病诊断有良好的区分效果,不仅可有效区分健康/前列腺疾病(增生和炎症和癌)(图9),而且对健康与良性疾病(图10)、癌与良性疾病(图11)、增生和炎症(图12)、增生和癌(图13)均有一定区分作用。2)而尿液PSA(mRNA)直接检测,除了对健康/前列腺疾病(增生和炎症和癌)有一定区分效果外,对具体疾病区分没有显著差异(表21)。3)血清外泌体检测对于前列腺疾病检测也有一定区分度,但总体效果不如尿液外泌体检测,且对增生和炎症无区分效果(表21)。4)血清总PSA(mRNA)检测对于前列腺疾病检测区分效果较差(表21)。5)总体分析:尿液外泌体PSA检测,用于区分健康/前列腺炎/增生和前列腺癌等前列腺疾病能力,优于尿液PSA直接检测、血清外泌体PSA检测以及血清PSA直接检测(表21)。
7.3总尿液外泌体mRNA检测用于术前术后效果评价
入组了初诊高级别前列腺癌患者13例,分别收集术前和术后(尿液、血清)样本(方法同7.2)。尿液外泌体PSA检测结果与尿液PSA、血清外泌体PSA直接检测效果对比。
结果如图14所示,外泌体PSA的表达量在术前和术后之间差异有统计学意义(P<0.05),尿液外泌体中PSA在术后下降效果比血清外泌体更显著。而尿液中PSA直接检测在术前和术后无显著性差异(P>0.05)。说明尿液和血液外泌体PSA的表达量有可能成为前列腺癌术后检测的生化标志物。
7.4总尿液外泌体mRNA检测用于预后评估
入组无其他全身重大疾病的初诊侵袭性前列腺癌患者共18例,收集尿液样本进行检测。样本纳入标准为:能够按预定方案完成化疗。可从化疗前后收集体液,通过病理诊断将样本分为10例治疗有效组,8例治疗无效组。检测PSA的表达水平。
结果如图15所示,尿液外泌体PSA的表达量与疗效显著性相关(AUC=0.887,P<0.05),Kaplan-Meier曲线显示,尿液外泌体PSA表达水平与患者PFS密切相关,F<cutoff组的患者PFS更长(图16)(P<0.05)。而尿液中PSA直接检测在治疗前后无显著性差异(P>0.05)。说明尿液外泌体PSA的表达量可用于前列腺预后评估和复发监控。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,便于具体和详细地理解本发明的技术方案,但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准,说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (25)
1.一种生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,包括:平衡缓冲液、洗涤液和洗脱液,所述平衡缓冲液中含有基础缓冲液和高价阳离子,所述高价阳离子选自Ca2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Al3+、Mn2+、Cu2+和Zn2+中的任意一种或多种,所述试剂盒用于离子交换层析中,所述平衡缓冲液用于对离子交换层析柱进行柱平衡。
2.根据权利要求1所述的生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,所述高价阳离子以其氯盐形式存在于所述平衡缓冲液中。
3.根据权利要求1所述的生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,所述基础缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液和磷酸盐缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,所述洗脱液中含有氯化钠和磷酸钠。
5.根据权利要求1所述的生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,所述洗涤液中含有氯化钠和磷酸钠。
6.根据权利要求1~5任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,还包括分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱,所述分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱中具有多孔结构填料,所述填料的孔结构的内表面修饰有正电荷。
7.根据权利要求1~5任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,所述生物样品选自尿液、血液、血浆、细胞培养液、胸腹水和灌洗液中的至少一种。
8.根据权利要求1~5任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,所述生物样品中外泌体分离试剂盒用于在诊断或区分前列腺疾病过程中收集生物样品中的外泌体。
9.根据权利要求8所述的生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,所述前列腺疾病包括前列腺炎、前列腺增生和前列腺癌。
10.根据权利要求8所述的生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,所述诊断或区分前列腺疾病过程中采用的生物样品选自尿液。
11.根据权利要求1~5任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,所述生物样品中外泌体分离试剂盒用在前列腺癌术后评估过程中收集生物样品中的外泌体。
12.根据权利要求1~5任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒,其特征在于,所述生物样品中外泌体分离试剂盒用在前列腺癌预后评估过程中收集生物样品中的外泌体。
13.权利要求1~7任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒分离得到的外泌体在制备以外泌体为功能成分的治疗药物中的应用、作为靶向治疗载药载体中的应用、用于疾病诊断的标志物检测来源的应用、作为细胞间的信号分子的应用或者作为调节细胞间交流机制的活性因子的应用。
14.一种诊断前列腺疾病的试剂盒,其特征在于,包括PSA检测试剂和权利要求1~7任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述前列腺疾病包括前列腺炎、前列腺增生和前列腺癌。
15.一种前列腺疾病分型试剂盒,其特征在于,包括PSA检测试剂和权利要求1~7任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述试剂盒的检测结果能够区分前列腺炎和前列腺增生。
16.一种前列腺疾病分型试剂盒,其特征在于,包括PSA检测试剂和权利要求1~7任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述试剂盒的检测结果能够区分前列腺炎和前列腺癌。
17.一种前列腺疾病分型试剂盒,其特征在于,包括PSA检测试剂和权利要求1~7任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述平衡缓冲液、所述洗涤液和所述洗脱液,所述试剂盒的检测结果能够区分前列腺增生和前列腺癌。
18.一种生物样品中外泌体分离方法,其特征在于,包括如下步骤:
使用权利要求1~7任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡;
将生物样品加入平衡后的阴离子交换层析柱中进行吸附;
使用权利要求1~7任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述洗涤液对吸附后的阴离子交换层析柱进行清洗;
使用权利要求1~7任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒中所限定的所述洗脱液对清洗后的阴离子交换层析柱进行洗脱并收集洗脱液。
19.根据权利要求18所述的生物样品中外泌体分离方法,其特征在于,所述Ca2+在所述平衡缓冲液中的使用浓度为0.5mmol/L~2mmol/L;和/或,所述Mg2+在所述平衡缓冲液中的使用浓度为0.1mmol/L~1mmol/L;和/或,所述Fe3+在所述平衡缓冲液中的使用浓度为0.1mmol/L~1mmol/L;和/或,所述Fe2+在所述平衡缓冲液中的使用浓度为0.1mmol/L~1mmol/L;和/或,所述Zn2+在所述平衡缓冲液中的使用浓度为0.5mmol/L~1.5mmol/L;和/或,所述Al3+在所述平衡缓冲液中的使用浓度为0.5mmol/L~2mmol/L;和/或,所述Cu2+在所述平衡缓冲液中的使用浓度为0.5mmol/L~3mmol/L;和/或,所述Mn2+在所述平衡缓冲液中的使用浓度为1.5mmol/L~3mmol/L。
20.根据权利要求18所述的生物样品中外泌体分离方法,其特征在于,所述基础缓冲液选自NaCl缓冲液、Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液和磷酸盐缓冲液中的至少一种,所述NaCl缓冲液的浓度为(0.01~0.2)mol/L,pH为7.0~8.0;所述Tris-HCl缓冲液的浓度为(0.02~0.2)mol/L,pH为7.0~9.0;和/或,所述PBS缓冲液的浓度为(0.01~0.1)mol/L,pH为7.0~8.0;和/或,所述磷酸盐缓冲液的浓度为(0.01~0.1)mol/L,pH为7.0~8.0。
21.根据权利要求18所述的生物样品中外泌体分离方法,其特征在于,所述洗脱液中的氯化钠的浓度为200mmol/L~1000mmol/L。
22.根据权利要求18所述的生物样品中外泌体分离方法,其特征在于,所述洗脱液中的磷酸钠的浓度为30mmol/L~100mmol/L。
23.根据权利要求18~22任一项所述的生物样品中外泌体分离方法,其特征在于,还包括对收集得到的洗脱液进行外泌体纯化,所述纯化包括步骤:
将收集得到的洗脱液加入分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱进行洗脱,所述分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱中具有多孔结构填料,所述填料的孔结构的内表面修饰有正电荷,使得收集得到的洗脱液中的外泌体从所述分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱中洗脱下来,而收集得到的洗脱液中的带负电荷的杂质截留在所述分子凝胶排阻和阴离子交换复合层析色谱柱的所述多孔结构填料中。
24.PSA的检测试剂在制备诊断前列腺疾病的试剂盒、区分前列腺炎和前列腺增生的试剂盒、区分前列腺炎和前列腺癌的试剂盒或区分前列腺增生和前列腺癌的试剂盒中的应用。
25.根据权利要求24所述的应用,所述PSA源自权利要求1~7任一项所述的生物样品中外泌体分离试剂盒分离得到的外泌体中的PSA。
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