KR20220000144A - 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법 및 이의 응용 - Google Patents

엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1차 분리된 엑소좀 군집 내에서 정전기적 인력 특성으로 구분되고 생리활성이 서로 다른 엑소좀 아집단을 이온 교환 크로마토그래피를 통해 구분된 분획으로 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명의 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법은 임상적으로 유용한 생리활성, 예를 들어 항염 효능이 강화된 엑소좀 아집단을 구분하여 생산하는데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법 및 이의 응용 {Method for isolating subpopulations of exosomes from population of exosomes and its application}
본 발명은 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 엑소좀 군집 내에서 정전기적 인력 특성으로 구분되는 엑소좀 아집단을 분리하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 엑소좀 아집단 중 생리활성이 강화된 엑소좀 아집단을 분리하는 방법 및 이러한 분리방법에 의해 수득된 생리활성이 강화된 엑소좀 아집단의 응용에 관한 것이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 엑소좀(exosome) 또는 세포외 소포체(extracellular vesicle)가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 엑소좀을 분리하는 종래 기술로는 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 접선흐름여과법(Tangential Flow Filtration; TFF), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등이 있다.
그러나, 전술한 바와 같이 다양한 엑소좀 분리방법이 제안되고 있음에도 불구하고 다른 기술분야와 마찬가지로 엑소좀의 생산과 관련한 기술분야에서도 끊임없는 개선이 이루어질 수 있는 것이다.
본 발명자들은 엑소좀의 분리방법에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 엑소좀 군집 내에 정전기적 인력 특성으로 구분되고 생리활성이 서로 다른 엑소좀 아집단이 존재하며, 이온 교환 크로마토그래피를 통해 독특한 엑소좀 아집단의 분획을 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
대한민국 등록특허공보 제10-1943119호 (2019.01.28)
본 발명의 목적은 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법을 제공하는 것으로서, 보다 구체적으로는 엑소좀 군집 내에서 정전기적 인력 특성으로 구분되는 엑소좀 아집단을 분리하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 엑소좀 아집단 중 생리활성이 강화된 엑소좀 아집단을 분리하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 분리방법에 의해 수득된 생리활성이 강화된 엑소좀 아집단의 다양한 응용을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1차 분리된 엑소좀 군집 내에서 정전기적 인력 특성으로 구분되고 생리활성이 서로 다른 엑소좀 아집단을 이온 교환 크로마토그래피를 통해 구분된 분획으로 분리하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)"는 통상 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다. 분리 환경, 조건 및 방법 등에 따라 세포외 소포체는 엑소좀과 동일한 의미를 가질 수도 있고 엑소좀과 크기는 동일 내지는 유사하지만 엑소좀의 조성을 갖지 않는 나노베지클까지 포함하는 의미를 가질 수도 있다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 동물 유래 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 엑소좀이 유래하는 동물 유래 세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 줄기세포 또는 면역세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 성체줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 면역세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 수지상 세포 또는 대식 세포일 수 있다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포 또는 상기 면역세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간 유래 줄기세포 또는 인간 유래 면역세포일 수 있다.
그러나 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 동물세포를 사용할 수 있음은 물론이다. 예를 들어, HEK 293 세포나 HEK 293T 세포의 사용도 가능하다. 따라서, 후술하는 실시예들에서 사용된 지방줄기세포는 본 발명에서 사용될 수 있는 동물세포의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어, "이온 교환 크로마토그래피"는 이온 교환체와 관심 물질 중의 이온 사이에 작용하는 정전기적 상호 작용을 이용하여 관심 물질을 분리하는 방법이다. 일반적으로, 이온 교환 크로마토그래피에서는 관심 물질의 하전된 부분이 이온 교환체에 부착된 반대 전하에 의해 끌려가 이온 교환체에 결합되고 나머지 물질은 통액 및 세척 과정에 의해 제거된다. 그리고 나서, 완충용액의 염 농도(이온 농도)를 점진적으로 증가시키는 농도 구배를 이용하여 관심 물질을 용출시켜 관심 물질의 분획을 수득한다. 이 경우, 완충용액의 이온은 이온 교환체에 대한 정전기적 인력이 유사한 관심 물질과 경합하여 이온 교환체에 결합된 관심 물질을 이탈시키게 되고 이탈된 관심 물질은 유동하는 완충용액에 섞여 용출되어 관심 물질 분획으로 수득된다.
본 명세서에서 용어, "항염"이란 염증을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 것을 의미하고, 염증성 질환으로는 본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 곰팡이 감염으로 인한 염증, 화상, 화상으로 인한 염증, 상처, 상처로 인한 염증, 궤양성 대장염, 관절염, 류머티스성 관절염, 간염, 신장염 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "창상(wound)"은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄한다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서 창상은 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상, 절상, 결출상(avulsion), 욕창, 와창, 방사선 조사에 의한 조직의 파괴, 관통상(penetrated wound), 총상(gun shot wound), 화상, 동상, 수술상, 성형수술 후 봉합 부위, 화학적 창상 등을 포함하며 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명은 동물 유래 세포 배양액으로부터 엑소좀 군집을 분리하는 단계와, 상기 분리된 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 이온 교환 크로마토그래피를 통해 구분된 분획으로 분리하는 단계를 포함하는, 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법은, (a) 동물 유래 세포 배양액으로부터 엑소좀 군집(exosome population)을 분리하는 단계와, (b) 상기 엑소좀 군집을 이온 교환 크로마토그래피의 컬럼에 적용하는 단계와, (c) 상기 컬럼에 염 농도가 단계적으로 증가하는 완충용액을 통과시키는 단계와, (d) 약 200 mM NaCl 내지 약 500 mM NaCl의 염 농도 구간에서 상기 컬럼으로부터 용출된 분획을 엑소좀 아집단(exosome subpopulation)으로 구분하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법에 있어서, (c) 단계에서 상기 완충용액의 염 농도는 약 100 mM부터 약 1,000 mM까지 단계적으로 증가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법에 있어서, (c) 단계에서 상기 완충용액의 염 농도는 약 100 mM 단위로 증가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법에 있어서, 상기 엑소좀 군집을 분리하는 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명에서 엑소좀 군집을 분리하는 방법은 TFF에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀 분리방법을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예에서 사용된 엑소좀 군집의 분리방법은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀 분리방법의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법은, 생리활성이 강화된 엑소좀 아집단을 분리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법에 있어서, 상기 생리활성이 강화된 엑소좀 아집단은 약 300 mM NaCl의 염 농도에서 상기 컬럼으로부터 용출된 분획인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법에 있어서, 상기 생리활성은 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능일 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법에 의해 수득된 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능이 강화된 엑소좀 아집단을 유효성분으로 포함하는, 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 본 발명의 일 구체예의 조성물은 주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 투여 또는 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물은 약학 조성물, 의약외품, 피부 외용제 또는 기능성 화장료 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형일 수 있고, 상기 의약외품 또는 상기 피부외용제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제일 수 있다. 또한, 상기 기능성 화장료 조성물은, 예를 들어, 로션이나 크림일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물이 약학 조성물로 사용되는 경우 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 관절 내 투여, 관절강 내 투여, 활액낭 내(intrasynovial) 투여, 흉골 내 투여, 수강 내(intrathecal) 투여, 병변 내 및 두개 내(intracranial) 투여, 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 림프 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 항염, 상처 치유, 및/또는 상처 치유 촉진 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 조성물이 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 의약 외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물은 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능이 강화된 엑소좀 아집단 이외에, 그 작용(예를 들어, 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 항염제, 소염제, 창상 치료제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능이 강화된 엑소좀 아집단을 유효성분으로 포함하는 조성물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 기능성 화장료 조성물은 항염, 창상 치료 촉진, 및/또는 창상 개선 등의 목적으로 사용될 수 있으며, 기능성 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물은 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능이 강화된 엑소좀 아집단을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하거나, 창상을 치료하거나, 또는 창상 치료를 촉진(accelerating wound healing)하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 방법은, 상기 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하거나, 상기 조성물을 포유동물의 염증 부위 및/또는 상처 부위에 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 조성물은 주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 포유동물에 투여 또는 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 방법은, 상기 조성물이 처리된 포유동물의 염증 부위 및/또는 상처 부위에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 이온토포레시스를 수행하는 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 염증 부위 및/또는 상처 부위에 접촉 또는 부착시켜 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
본 발명에 따르면, 동물 유래 세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀 군집 내에서 정전기적 인력 특성으로 구분되고 생리활성이 서로 다른 엑소좀 아집단을 이온 교환 크로마토그래피를 통해 구분된 분획으로 분리할 수 있다. 따라서, 본 발명의 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법은 임상적으로 유용한 생리활성, 예를 들어 항염 효능이 강화된 엑소좀 아집단을 구분하여 생산하는데 유용하게 활용할 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 1차 분리된 엑소좀 용액에 대해 이온 교환 크로마토그래피를 수행한결과를 나타내는 그래프로서, 완충용액의 NaCl 농도를 점진적으로 증가시키는 농도구배에 대한 전도도 및 UV280 흡광도를 나타내고 있다.
도 2는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 구분된 각 분획의 입자수 및 단백질 농도를 나타내는 그래프로서, 각 분획의 입자수와 단백질 농도가 서로 다른 것을 나타내고 있다.
도 3은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 구분된 각 분획의 엑소좀 마커(CD63 및 CD81)의 정량값을 나타내는 그래프로서, 각 분획의 CD63 및 CD81의 정량값이 다르고 이에 따라 엑소좀은 특정 분획에 집중적으로 존재하는 것을 나타낸다.
도 4는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 구분된 각 엑소좀 분획의 항염 효능 분석 결과를 도시한 그래프로서, F3 분획의 엑소좀을 RAW 264.7 세포에 대해 처리한 경우 이온 교환 크로마토그래피에 의해 구분되기 전 엑소좀("Input"으로 표시)을 처리한 경우와 비교하여 LPS에 의해 유도되는 IL-6이 현저하게 감소하는 것을 나타낸다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양 및 배양액의 생산
인간 지방 유래 줄기세포를 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS), 100유닛(Units)/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 α-MEM 배양 배지에 현탁시킨 후, 셀팩토리(Cell Factory) 플라스크에 6,000 세포/cm2 밀도로 접종하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 80% 이상의 세포 밀집도(confluency)에 도달하면, 배양배지를 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 α-MEM 배지 (이하, "Serum-free media" 또는 "SFM"이라 함)로 교체해 주었다. SFM 배지로 교체한 후 24시간 배양하고 배지를 수거하였다. 회수한 배양액은 세포 및 세포 잔해물(debirs)을 제거하기 위하여 0.2 μm 필터로 여과하였다.
실시예 2: 엑소좀의 1차 분리 및 정제
실시예 1에서 0.2 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명hollow fiber filter; GE Healthcare 또는 Spectrum Labs에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm 크기의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환 (diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다.
한편, 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법으로는 전술한 바와 같은 분리방법 외에도 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 엑소좀의 분리를 위해, 초미세여과법(ultrafiltration), 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등 공지의 분리방법을 사용할 수 있다. 그러나 엑소좀의 분리방법은 전술한 바와 같은 방법들에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 분리 방법이 채택가능한 것임은 물론이다.
실시예 3: 이온 교환 크로마토그래피를 이용한 엑소좀의 2차 분리 및 정제
실시예 2에서 분리된 엑소좀에 대한 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography; IEC)를 수행하여 정전기적 인력(electrostatic attraction)을 이용한 엑소좀 분획을 얻었다. IEC 방법을 위한 컬럼으로는 CIMmultus™ EV-1 어드밴스드 컴포지트 컬럼(CIMmultus™ EV-1 Advanced composite column)(BIAsperations에서 구입)을 사용하였다. 실시예 2에서 준비한 엑소좀 용액을 시료로서 준비하고, 준비된 시료를 상기 컬럼에 적용한 후 완충용액의 염 농도를 점진적으로 증가시키는 방식(100 mM NaCl 농도부터 1000 mM NaCl 농도까지의 농도 구배를 이용하는 방식)으로 상기 컬럼 내에서 완충용액을 유동시켰다. 완충용액의 이온은 상기 컬럼 내의 음이온 교환 수지(anion exchange resin)에 대한 정전기적 인력이 유사한 엑소좀과 경합하여 음이온 교환 수지에 결합된 엑소좀을 이탈시키게 되고 이탈된 엑소좀은 유동하는 완충용액에 섞여서 용출되어 엑소좀 분획으로 수득된다.
구체적으로, 상기 시료를 상기 컬럼 내에 주입하여 상기 컬럼 내의 음이온 교환 수지와 반응시킨 후, 상기 컬럼 내의 음이온 교환 수지에 결합하지 못한 물질은 상기 시료의 컬럼 주입 과정에서 통액(flow-through)에 포함시켜 제거하였고, 또한 20 CV (Column volume)의 완충용액 A (20 mM NaCl 및 50 mM HEPES 함유 완충용액, pH 7.0)를 이용한 세척을 통해 제거하였다. 이후, 완충용액의 이온과 정전기적 인력이 유사한 엑소좀을 구분하여 획득하기 위하여 컬럼 내 염 농도를 점진적으로 증가시켰다. 컬럼 내 염 농도의 증가는 컬럼에 주입하는 완충용액 B (100 mM NaCl 및 50 mM HEPES 함유 완충용액, pH 7.0)와 완충용액 C (1,000 mM NaCl 및 50 mM HEPES 함유 완충용액, pH 7.0)의 혼합 비율을 조절하여 NaCl 농도가 100 mM부터 1,000 mM까지 100 mM 단위로 증가하는 단계적 농도구배법(stepwise gradient elution)을 통해 이루어졌다(도 1 참조). 이온 교환 크로마토그래피 과정 중 농도구배의 변화를 확인하기 위해 전도도(conductivity)를 측정하였고, 단백질량 변화를 확인하기 위해 UV280 흡광도를 측정하였다.
완충용액의 NaCl 농도 구배에 따라 획득한 분획은 F1 분획 (100 mM NaCl 농도에서 용출된 분획), F2 분획 (200 mM NaCl 농도에서 용출된 분획), F3 분획 (300 mM NaCl 농도에서 용출된 분획), F4 분획 (400 mM NaCl 농도에서 용출된 분획), F5 분획 (500 mM NaCl 농도에서 용출된 분획), F6 분획 (600 mM NaCl 농도에서 용출된 분획), F7 분획 (700 mM NaCl 농도에서 용출된 분획), F8 분획 (800 mM NaCl 농도에서 용출된 분획), F9 분획 (900 mM NaCl 농도에서 용출된 분획) 및 F10 분획 (1,000 mM NaCl 농도에서 용출된 분획)으로 구분하여 명명하였다. 그리고, 상기 각각의 분획은 이후의 분석을 위해 아미콘 10K(Amicon 10 K) 제품으로 탈염과정을 거친 후 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline; PBS)에 재현탁하여 사용하였다.
한편, IEC 컬럼은 앞서 예시한 컬럼 외에도 당업계에서 알려진 다양한 음이온 교환체(anion exchanger), 예를 들어 Q 세파로즈(Q Sepharose)를 사용하는 IEC 컬럼들이 사용될 수 있음은 물론이다.
실시예 4: 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 구분된 각 분획에 대한 입자수 및 단백질 함량 분석
실시예 3에서 준비된 엑소좀 분획은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였으며, 마이크로 BCA 어세이 키트(Micro BCA assay kit)(ThermoFisher에서 구입)로도 총 단백질량을 측정하였다. 실시예 2의 엑소좀의 1차 분리방법 및 실시예 3의 엑소좀 2차 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 NTA 및 단백질 분석 결과는 입자수와 단백질 함량으로 표시하여 도 2에 도시하였다.
NTA 결과로부터, 대부분의 나노입자들은 F2 분획부터 F6 분획에 걸쳐 존재하는 것으로 확인되었고, 일부가 F10 분획에서 확인되었다(도 2 참조). 또한, BCA 어세이 결과로부터, 대부분의 단백질들은 F2 분획부터 F4 분획에 걸쳐 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
상기 결과들로부터, 컬럼으로부터 용출된 분획 중 초기 분획에는 대부분의 단백질이 존재하며, F2 분획부터 F6 분획(약 200 mM NaCl부터 600 mM NaCl까지의 염 농도 구간)에 나노입자들이 존재하는 것을 알 수 있다.
실시예 5: 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 구분된 각 분획에 대한 엑소좀의 마커 분석
실시예 3에서 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 구분된 F1 분획부터 F10 분획에 대해 엑소좀 특이적 표지인자인 CD63 및 CD81의 함량을 비교 평가하였다. F1 분획부터 F10 분획에 존재하는 CD63 및 CD81의 정량을 위해 F1 분획부터 F10 분획 각각과 엑소좀-휴먼 CD63/CD81 플로우 검출 시약(Exosome-Human CD63/CD81 Flow Detection Reagent)(Invitrogen™)을 하룻밤 동안(overnight) 혼합 후 각각의 플로우 검출시약에 대응하는 PE 마우스 항-인간 CD63/CD81 (Mouse anti-Human CD9/CD63/CD81)(BD Pharmigen™) 항체와 각각 반응시켰다. 반응 완료 후 유세포분석(flow cytometry)을 이용하여 PE 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity; MFI)를 측정하여, 각 분획에 포함된 CD63 및 CD81 함량을 비교 평가하였다. 한편, CD63 및 CD81은 엑소좀의 대표적인 포지티브 마커이므로 CD63 및 CD81의 함량과 엑소좀의 함량은 서로 선형성을 갖고 CD63 및 CD81 함량의 증가는 엑소좀 함량의 비례적인 증가를 의미한다.
각 분획에 포함된 CD63 및 CD81 함량을 비교 평가한 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, CD63은 F2 분획부터 F5 분획에 걸쳐 존재함이 확인되었으며, CD81은 F3 분획부터 F5 분획에 걸쳐 존재함이 확인되었다. 실시예 4에서 나노입자가 검출되었던 F6 분획 및 F10 분획은 CD63 또는 CD81과 같은 엑소좀 표면 마커가 검출되지 않음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
따라서, 실시예 4의 결과와 CD63 및 CD81 함량 측정 결과를 종합하면, F2 분획부터 F5 분획(약 200 mM NaCl부터 500 mM NaCl까지의 염 농도 구간에 해당)에 엑소좀이 존재하는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 구분된 각 엑소좀 분획의 항염 효능 평가
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서, 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 구분된 각 엑소좀 분획의 항염 효과와 이온 교환 크로마토그래피를 수행하지 않은 1차 분리된 엑소좀의 항염 효과를 다음과 같이 확인하였다. 이를 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다:
(1) 음성 대조군(control): RAW 264.7 세포에 LPS가 처리되지 않은 실험군;
(2) LPS: RAW 264.7 세포에 LPS만 처리된 실험군;
(3) 양성대조군: RAW 264.7 세포에 LPS가 처리되기 전에 덱사메타손이 처리된 실험군 (도 4에서 "DEX"로 표시);
(4) 1차 분리된 엑소좀 처리군: RAW 264.7 세포에 LPS가 처리되기 전에 1차 분리된 엑소좀(실시예 2에서 분리된 엑소좀)이 1.5×1010 입자/mL의 농도로 처리된 실험군 (도 4에서 "Input"으로 표시);
(5) F3 분획의 엑소좀 처리군: RAW 264.7 세포에 LPS가 처리되기 전에 F3 분획의 엑소좀이 1.5×1010 입자/mL의 농도로 처리된 실험군 (도 4에서 "F3"로 표시);
(6) F4 분획의 엑소좀 처리군: RAW 264.7 세포에 LPS가 처리되기 전에 F4 분획의 엑소좀이 1.5×1010 입자/mL의 농도로 처리된 실험군 (도 4에서 "F4"로 표시);
(7) F5 분획의 엑소좀 처리군: RAW 264.7 세포에 LPS가 처리되기 전에 F5 분획의 엑소좀이 1.5×1010 입자/mL의 농도로 처리된 실험군 (도 4에서 "F5"로 표시).
RAW 264.7 세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium; ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 96웰 플레이트에 2.5×104 세포/웰의 밀도로 접종하였고, 상기 실험군 (1)~(7) 각각의 조건에 따라 RAW 264.7 세포를 처리한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 100 ng/mL의 LPS(Sigma에서 구입)를 처리하였고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하여 RAW 264.7 세포의 활성화를 유도하였다.
배양이 끝난 RAW 264.7 세포의 배양 상등액(culture supernatant)을 수거하였고, 배양 상등액 내의 IL-6의 생성량을 LEGENDplexTM 비드-기반 면역 측정법(bead-based immnnoassay)을 위한 마우스 염증 패널(mouse inflammation panel)(Biolegend에서 구입)과, 노보사이트 유세포 분석기(NovoCyte Flow Cytometer)(ACEA에서 구입)를 이용하여 측정하여 항염증 효과를 확인하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 염증성 사이토카인 분석 결과, RAW 264.7 세포에 대한 LPS 처리 전에 F3 분획의 엑소좀을 RAW 264.7 세포에 미리 처리한 실험군 (5)의 경우 이온 교환 크로마토그래피를 수행하지 않은 1차 분리된 엑소좀을 처리한 실험군 (4)에 비해 LPS에 의해 유도되는 IL-6 생성량을 현저하게 감소시킨 것을 확인하였다. 또한, F4 분획의 엑소좀을 처리한 실험군 (6) 및 F5 분획의 엑소좀을 처리한 실험군 (7)은 IL-6의 생성량을 감소시키지 못하거나, 이온 교환 크로마토그래피를 수행하지 않은 1차 분리된 엑소좀을 처리한 실험군 (4) 보다도 IL-6의 생성량 감소 정도가 낮은 것을 확인하였다.
이러한 결과는 엑소좀 군집 내에 정전기적 인력 특성으로 구분되고 생리활성이 서로 다른 엑소좀 아집단이 존재하며, 본 발명에 따라 이온 교환 크로마토그래피를 통해 서로 다른 아집단의 분획을 얻을 수 있음을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법은 임상적으로 유용한 생리활성, 예를 들어 항염 효능이 강화된 엑소좀 아집단을 구분하여 생산하는데 유용하게 활용할 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (21)

  1. (a) 동물 유래 세포 배양액으로부터 엑소좀 군집(exosome population)을 분리하는 단계와, (b) 상기 엑소좀 군집을 이온 교환 크로마토그래피의 컬럼에 적용하는 단계와, (c) 상기 컬럼에 염 농도가 단계적으로 증가하는 완충용액을 통과시키는 단계와, (d) 200 mM NaCl 내지 500 mM NaCl의 염 농도 구간에서 상기 컬럼으로부터 용출된 분획을 엑소좀 아집단(exosome subpopulation)으로 구분하는 단계를 포함하는, 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (c) 단계에서 상기 완충용액의 염 농도는 100 mM부터 1,000 mM까지 단계적으로 증가하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    (c) 단계에서 상기 완충용액의 염 농도는 100 mM 단위로 증가하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀 군집을 분리하는 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 수행되는, 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    생리활성이 강화된 엑소좀 아집단을 분리하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 생리활성이 강화된 엑소좀 아집단은 300 mM NaCl의 염 농도에서 상기 컬럼으로부터 용출된 분획인 것을 특징으로 하는, 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 생리활성은 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능인, 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법.
  8. 청구항 제7항에 기재된 엑소좀 군집 내에서 엑소좀 아집단을 분리하는 방법에 따라 수득된 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능이 강화된 엑소좀 아집단을 유효성분으로 포함하는, 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 투여 또는 처리되는, 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    약학 조성물, 의약외품, 피부 외용제 또는 기능성 화장료 조성물인, 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인 것을 특징으로 하는, 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 의약외품 또는 상기 피부외용제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제인 것을 특징으로 하는, 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 기능성 화장료 조성물은 로션이나 크림인, 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  14. 청구항 제8항에 기재된 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하거나, 상기 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물을 포유동물의 염증 부위 또는 상처 부위 중 적어도 하나의 부위에 처리하는 단계를 포함하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하거나, 창상을 치료하거나, 또는 창상 치료를 촉진하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물은 주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 포유동물의 염증 부위 또는 상처 부위 중 적어도 하나의 부위에 투여 또는 처리되는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하거나, 창상을 치료하거나, 또는 창상 치료를 촉진하는 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물은 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하거나, 창상을 치료하거나, 또는 창상 치료를 촉진하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물은 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적되는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하거나, 창상을 치료하거나, 또는 창상 치료를 촉진하는 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물이 처리된 포유동물의 염증 부위 또는 상처 부위 중 적어도 하나의 부위에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하거나, 창상을 치료하거나, 또는 창상 치료를 촉진하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 이온토포레시스를 수행하는 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 염증 부위 또는 상처 부위 중 적어도 하나의 부위에 접촉 또는 부착시켜 수행되는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하거나, 창상을 치료하거나, 또는 창상 치료를 촉진하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하거나, 창상을 치료하거나, 또는 창상 치료를 촉진하는 방법.
  21. 제14항에 있어서,
    상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하거나, 창상을 치료하거나, 또는 창상 치료를 촉진하는 방법.
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