CN101210927A

CN101210927A - 一种诊断前列腺癌的试剂盒

Info

Publication number: CN101210927A
Application number: CNA2006101487335A
Authority: CN
Inventors: 孙兵; 黄超锋; 蔡兴锋; 朱静燕; 季永庸
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science
Priority date: 2006-12-30
Filing date: 2006-12-30
Publication date: 2008-07-02
Anticipated expiration: 2026-12-30
Also published as: CN101210927B

Abstract

本发明公开了一种检测f－PSA的试剂盒，所述的试剂盒选用针对游离的前列腺特异抗原PSA(f－PSA)不同表位的高特异性单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体。本发明的试剂盒灵敏度和准确性非常高。且可以极其快速地检测出血液中的f－PSA，对于临床快速且准确地诊断早期前列腺癌以及区分前列腺癌和良性增生具有重要意义。

Description

一种诊断前列腺癌的试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及检测血清中游离形式前列腺特异抗原的试剂盒及其用途。

背景技术

前列腺癌是中老年男性的常见多发病。据统计，在男性癌症患者中，前列腺癌发病率最高，是除肺癌和大肠癌外的第三大死因。前列腺特异抗原PSA，分子量34KD的糖蛋白，具有高度的组织特异性，分布于正常的前列腺组织、前列腺增生组织、前列腺恶性组织和转移癌及前列腺分泌液、精浆中。虽然近来发现其它癌组织如乳腺癌中存在少量PSA，但其目前仍是前列腺癌诊断中最为重要，应用最为广泛的前列腺癌标志物。

测量血清中的前列腺特异抗原PSA可以用于筛选和早期诊断前列腺癌。血清内PSA有多种存在形式，大部分具有酶活性的PSA与a1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)和a₂巨球蛋白(a₂M)以复合物的形式存在，少量的无酶活性的PSA以游离形式存在。一般对于正常健康和非前列腺癌病变的男性病人来说，血清的PSA含量低于4.0ng/ml。前列腺癌(PCa)、前列腺增生(BPH)、前列腺炎症患者血清内PSA浓度会升高，大多数前列腺癌患者血清PSA升高显著，高于10ng/ml。在4.0-10ng/ml的灰色区域，单独检测总PSA无法区分癌症和良性增生，检测血清中游离PSA与总PSA的比例可显著提高前列腺癌和前列腺增生的辨别。比例越高，前列腺癌风险越低，分界比例通常认为是15％。

游离的PSA可提供更好的生化指标，用于区分PSA 4-10ng/ml的前列腺癌和良性增生。血清PSA在2.5-4ng/ml的男性中，仍有部分人患有前列腺癌，检测血清内其它游离形式的PSA水平也可以帮助区分癌症患者。

目前用于血清PSA检测的试剂盒有RIA、ELISA、化学发光等试剂盒，检测游离PSA的试剂盒比较少，曾经有人制备过酶联免疫ELISA试剂盒，但是现有技术中游离PSA的酶标试剂盒用于测定时，不仅测定步骤多、时间长、使用不便，而且灵敏度低，准确性参差不齐，这些因素大大限制了酶免试剂盒的推广和应用。

因此，本领域迫切需要开发更快速、更方便的游离PSA检测试剂盒，以满足临床需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测游离PSA的试剂盒及其用途。所述的试剂盒灵敏度高、检测时间短且使用方便。

本发明的另一目的在于提供一种体外检测f-PSA方法。

在本发明的第一方面，提供一种检测f-PSA的试剂盒，所述的试剂盒含有：

一固相载体，所述的固相载体上包被有第一单克隆抗体，所述的第一单克隆抗体选自：由保藏号为CCTCC-C200620的杂交瘤产生的抗体，由保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤产生的抗体，或由保藏号为CCTCC-C200622的杂交瘤产生的抗体；和

容器a，所述的容器a中装有第二单克隆抗体，所述的第二单克隆抗体选自：由保藏号为CCTCC-C200620的杂交瘤产生的抗体，由保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤产生的抗体，或由保藏号为CCTCC-C200622的杂交瘤产生的抗体；且所述的第二单克隆抗体携带一标记物；

其中，所述的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体不相同，且可同时结合于f-PSA。

在本发明的一个优选例中，所述的第一单克隆抗体是：由保藏号为CCTCC-C200622的杂交瘤产生的抗体；且所述的第二单克隆抗体是：由保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤产生的抗体。

在本发明的另一优选例中，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒中还包含：

(a)容器b，所述的容器b中装有f-PSA的标准品；和/或

(b)容器c，所述的容器c中装有f-PSA的质控品。

在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒中还包含：

(c)容器d，所述的容器d中装有与标记物相对应的底物；

(d)容器e，所述的容器e中装有显色剂；

(e)容器f，所述的容器f中装有洗涤液；和/或

(f)容器g，所述的容器g中装有终止液。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含：

(h)容器h，所述的容器h中装有增敏剂，所述的增敏剂的配方按照重量比为：PEG 6000 4％、甘油1％、蔗糖1％、明胶1％，余量为PBS。

在本发明的另一优选例中，所述的容器b-容器h可以是一个容器；也可以是多个容器，多个容器中装有不同浓度的所述的试剂。

在本发明的另一优选例中，所述的固相载体选自：微量滴定板、或微球。

在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒的线性范围值为0.5-50ng/ml。

在本发明的第二方面，提供一种体外检测f-PSA方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有第一单克隆抗体的固相载体，从而使待测样品中的f-PSA与固相载体上的第一单克隆抗体结合，形成带有“f-PSA-第一单克隆抗体”二元复合物的固相载体；

(b)将第二单克隆抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二单克隆抗体-f-PSA-第一单克隆抗体”三元复合物的固相载体；且所述的第二单克隆抗体携带一标记物；

(c)检测三元复合物中的标记物，从而确定待检测样品中f-PSA的存在与否以及存在的量。

附加条件是，步骤(a)和步骤(b)可依次进行或同时进行。

在本发明的另一优选例中，所述的第一单克隆抗体是：由保藏号为CCTCC-C200622的杂交瘤产生的抗体；且所述的第二单克隆抗体是：由保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤产生的抗体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了f-PSA标准品浓度参考曲线。

图2显示了f-PSA标准品溶在阴性血清内的标准曲线。

图3显示了f-PSA诊断试剂线性范围及灵敏度测定。

图4显示了本发明试剂盒和商品化试剂盒检测血清f-PSA结果比对。

图5显示了本发明试剂盒和商品化试剂盒检测血清f-PSA结果相关分析。

图6显示了f-PSA单抗配对效果比较试验的结果。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究和试验，找到了针对游离的前列腺特异抗原PSA(f-PSA)不同表位的三种高特异性单克隆抗体，选择所述三种抗体中的任意两种，根据双抗夹心法原理，可制备出方便、快速且准确地诊断早期前列腺癌以及区分前列腺癌和良性增生的试剂盒。本发明的试剂盒解决的技术问题一：灵敏检测血清内游离前列腺特异抗原，准确鉴别前列腺癌和非癌患者；本发明的试剂盒解决的技术问题二：快速检测，大大缩短检测时间，方便快捷。在此基础上完成了本发明。

本领域技术人员均了解，一种抗原可能含有多个表位(抗原决定簇)，因此，针对同一个抗原可以获得不止一个抗体，这些抗体对抗原的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。因此，针对同一个抗原，本领域人员还需要进行比较和筛选，才能找到适合于特异性结合的单抗。本发明人作了大量的工作，同时开发了多种针对f-PSA的单克隆抗体(参见CN200610026505.0)，从中挑选出对f-PSA特异性高的单克隆抗体用于本发明。

前列腺特异抗原(PSA)有总前列腺特异抗原(t-PSA)、结合前列腺特异抗原(c-PSA)、游离前列腺特异抗原(f-PSA)之分，且t-PSA＝c-PSA+f-PSA。由于需要检测的是f-PSA抗原，一般的抗f-PSA抗体在用于检测时易于受到同时结合c-PSA的干扰，导致特异性差，结果偏差大。通常情况下，若是采用一种抗体来结合f-PSA，可能在测定过程中不可避免地发生非特异性结合；而本发明基于双抗夹心法原理来制备所述的试剂盒，采用的是结合于f-PSA抗原不同表位的双抗体，这种情况下出现非特异性结合的几率是非常低的，因此结果的准确性和精密度会大大提高。

并且，采用两种特异性非常高的抗体来将目标抗原f-PSA吸附及定位，其定位和放大效果更好，从而使得特异性和精密度更高。且测定时仅需要很少的样品量即可。

此外，由于所述的单克隆抗体对于f-PSA具有极其优异的结合特性，因此，待测样品与第一单克隆抗体和第二单克隆抗体的混合可同时进行(更优选地，可采用增敏剂改进抗原抗体动力学过程)。这就大大降低检测所需的时间，所需时间由约数个小时减少到约30分钟；且大大简化了操作步骤。

如本文所用，所述的“捕获抗体”、“包被抗体”、“第一单克隆抗体”、“第一抗体”、与“一抗”可互换使用，都是指用于固定于固相载体上的、特异性抗f-PSA的抗体。

如本文所用，所述的“检测抗体”、“第二单克隆抗体”、“第二抗体”、“酶标(记)抗体”与“二抗”可互换使用，都是指特异性地抗f-PSA且对应于所述试剂盒中相应的第一抗体的抗体。对于抗原f-PSA而言，相应的第一抗体和第二抗体是不同的，并且可同时结合于所述的f-PSA的不同表位(抗原决定簇)。

如本文所用，所述的“标记物”是指位于第二单克隆抗体上的，用于确定待检测样品中游离PSA的存在与否以及存在的量的标志物。优选的，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

如本文所用，所述的“与标记物相对应的底物”是指可被第二单克隆抗体的标记物所催化显色，用于显示第二抗体与f-PSA发生结合的识别信号。所述的底物比如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。

基本原理

本发明的基本原理是双抗夹心法。常规的做法是将一抗固定于载体，然后一抗与抗原反应，洗涤后再与带标记的二抗反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。

双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。

游离的前列腺特异抗原PSA

游离的前列腺特异抗原PSA(f-PSA)是一种已知的蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列都是本领域已知的。例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

生产f-PSA的方法也是已知的。例如，通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用f-PSA的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的f-PSA蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用编码人f-PSA蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；和

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

上述获得的重组f-PSA蛋白可被加工成具有一定纯度的蛋白，用于配制标准品。

此外，所述的f-PSA蛋白也可分离自人体。例如，可从人精液内提取和纯化f-PSA。

抗f-PSA蛋白的单克隆抗体

制备抗f-PSA蛋白的抗体的技术是本领域中众所周知的。用于本发明的抗体是对人f-PSA具有特异性的单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人f-PSA蛋白或其片段。更特别地，指那些能与人f-PSA蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

本发明利用针对游离的前列腺特异抗原PSA(f-PSA)不同表位的高特异性单克隆抗体，根据双抗夹心法原理，制备了可方便、快速且准确地诊断早期前列腺癌以及区分前列腺癌和良性增生的试剂盒。本发明中涉及的三种高特异性单克隆抗体的获得及其优异特性在本申请人的在先申请CN200610026505.0中进行了详细的描述。

三种抗体的代号以及保藏号对应如下：

杂交瘤细胞系S-115-8，保藏号为：CCTCC-C200620；

杂交瘤细胞系S-191-5，保藏号为：CCTCC-C200621；

杂交瘤细胞系S-44-10，保藏号为：CCTCC-C200622。

上述的单克隆抗体的抗体亚型均为IgG1，κ。

本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas，Elsevier，N.Y.1981)。本发明的单克隆抗体可以利用人f-PSA基因产物或片段或功能区，通过常规免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。

本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以采用多种方法方便地获得所述的抗体。

在本发明的一个实例中，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法所制备，所述方法包括步骤：(1)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。作为一种优选方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，用经硫酸铵、辛酸沉淀，接着用Protein G预装层析柱纯化，获得高纯度的PSA单克隆抗体。

此外，也可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。

试剂盒

本发明提供一种检测f-PSA的试剂盒，所述的试剂盒可用于前列腺癌和良性增生的鉴别诊断，特别是早期病人的筛查，也可用于前列腺癌术后化疗的监测及预后评估等。

所述的试剂盒含有：

一固相载体，所述的固相载体上包被有第一单克隆抗体，所述的第一单克隆抗体选自：由保藏号为CCTCC-C200620的杂交瘤产生的抗体，由保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤产生的抗体，或由保藏号为CCTCC-C200622的杂交瘤产生的抗体；

容器a，该容器a中装有第二单克隆抗体，所述的第二单克隆抗体选自：由保藏号为CCTCC-C200620的杂交瘤产生的抗体，由保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤产生的抗体，或由保藏号为CCTCC-C200622的杂交瘤产生的抗体；且所述的第二单克隆抗体携带一标记物；

作为一个必要的条件，所述的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体不相同，且可同时结合于f-PSA。

作为本发明的一个最佳的方式，所述的第一单克隆抗体是：由保藏号为CCTCC-C200622的杂交瘤(S-44-10)产生的抗体；且所述的第二单克隆抗体是：由保藏号为CCTCC-C200621(S-191-5的杂交瘤产生的抗体。本发明人出乎意料地发现，将由CCTCC-C200622的杂交瘤产生的抗体作为包被抗体，而将由保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤产生的抗体作为检测抗体，这样的一种组合能够产生最好的f-PSA检测效果，其检测灵敏度约为0.5ng/ml。

在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和检测抗体后，可以采用本领域常规可用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中f-PSA的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。例如，所述的标记物可以选自(但不限于)：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。所述的底物例如(但不限于)：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)。

为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置质控(对照)。在本发明的一个实例中，所述的质控品采用f-PSA标准品、正常女性血清经稀释而制备。

此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个f-PSA的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。

在本发明的优选方式中，标准品的设置如下：

标准品I：0ng/ml纯化的f-PSA；

标准品II：1ng/ml纯化的f-PSA；

标准品III：2.5ng/ml纯化的f-PSA；

标准品IV：5ng/ml纯化的f-PSA；

标准品V：10ng/ml纯化的f-PSA；和

标准品VI：25ng/ml纯化的f-PSA。

利用所述的标准品，标准曲线如下设置：用标准品的OD值检测结果为纵坐标(Y轴)，标准品浓度为横坐标(X轴)绘制成f-PSA试剂盒的定量标准曲线。从而，根据待测样品检测获得的OD值，利用标准曲线可计算出待测样品中f-PSA的浓度。

在本发明的一个实例中，用于制备所述的标准品的f-PSA纯品是从人精浆里纯化获取的。按照常规的纯化方法，制备出f-PSA，SDS-PAGE验证纯度，溶在PBS中，加入50％甘油，即得到成品。

此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是双抗夹心法中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于)：显色剂、洗涤液、终止液，增敏稀释液。

作为本发明的一种特别优选的方式，所述的试剂盒中还包含一种增敏剂，所述的增敏剂的配方为(按照重量比)：PEG 6000 4％、甘油1％、蔗糖1％、明胶1％，余量为PBS。在采用所述的增敏剂后，本发明的试剂盒中的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体对于f-PSA的识别和结合将更加敏感，并且本发明的试剂盒的检测时间进一步缩短。

所述的第一单克隆抗体被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与第一单克隆抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体选自：微量滴定板、或微球。

在本发明的一个实例中，采用的固相载体是微量滴定板(酶标板)，所述的微量滴定板是一种聚苯乙烯板，规格是12×8可拆卸条板。

作为本发明的一种优选方式，所述试剂盒中一些组分的制备方法如下：

(1)制备包被有包被抗体的固相载体

a)制备单克隆抗体：利用专利(参见专利：CN200610026505.0)中制备筛选到的单克隆抗体细胞株，将上述杂交瘤细胞株按照常规动物细胞培养方法进行体外培养扩增或者注射小鼠腹腔制备腹水，收集腹水经硫酸铵、辛酸沉淀、Protein G预装层析柱纯化后，即获得高纯度的PSA单克隆抗体。

b)包被：将上述的单克隆抗体用50mM、pH9.6碳酸盐缓冲液稀释后加入酶标板各孔，100μL/孔，4℃包被过夜。用吐温磷酸盐缓冲液洗板。

c)封闭：用封闭液封闭后，洗涤，甩干，干燥低温保存。

(2)制备酶标的检测抗体

所述酶标的检测抗体采用辣根过氧化物酶(HRP)标记检测抗体而制备。抗体标记的方法在本领域是公知的，例如用简易过碘酸钠法或者戊二醛二步法进行HRP标记抗体。

(3)制备质控品

采用混合人血清，按照标准曲线范围要求进行稀释而制备的。一种质控品制备方法步骤如下：

a)收集正常女性血清，-20℃保存；

b)将累积的各份血清混合，加入f-PSA标准品用ELISA方法测定浓度，并按标准曲线要求进行适当的调整，制备f-PSA的浓度范围分别在2±0.5ng/ml(低值)和10±1ng/ml的两种血清(高值)；

c)将步骤b)所获得的两种血清按试剂盒需要量分装，即制备成低、高值质控品。

(4)制备其它辅助试剂

所述的辅助试剂包括底物液，显色液，反应终止液，20×洗涤液。一种配制辅助试剂的方法如下：

a)底物溶液：磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；

b)显色液：四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；

c)反应终止液：2M硫酸；

d)洗涤液(20×)：PB(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。

检测游离PSA方法

本发明提供一种体外检测f-PSA的方法，包括以下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有第一单克隆抗体的固相载体，从而使待测样品中的f-PSA固相载体上的第一单克隆抗体结合，形成带有“f-PSA-第一单克隆抗体”二元复合物的固相载体；

由于本发明的试剂盒采用的单克隆抗体对于f-PSA具有极其优异的结合特性(高特异性)，因此，步骤(a)和(b)可同时进行(即：同时进行待测样品与第一单克隆抗体和第二单克隆抗体的混合)。将步骤(a)和步骤(b)同时操作，将大大降低检测所需的时间(由约数个小时减少到约30分钟)。当然，步骤(a)和(b)也可分别进行。

作为本发明的一种优选方式，定量检测f-PSA的方法具体如下：

(i)抗原抗体反应：在试剂盒提供的抗体包被板的微孔内分别加入100μL不同浓度的标准品、质控品，或待测血清样品；

(ii)酶联反应：同时将HRP-单克隆抗体溶液加入各孔，100μL/孔，再加入100μL增敏剂，放入温控摇床内，37℃振荡、孵育30min。洗涤液(1×)重复洗板3次；

(iii)显色反应：每孔加入底物溶液、显色液各50μL，37℃孵育15min，每孔加入100μL反应终止液，结束反应；

(iv)比色：以空白对照孔的吸光值调零，酶标仪在450nm测定OD值并打印结果。

(v)结果计算：

A)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算曲线回归系数R²，当R²＞0.98时本次测验有效；

B)评判质控品浓度：根据质控品的OD值，从标准曲线上读出相应的浓度值；质控品测定浓度值处于给定范围时，该次测定有效；

C)计算待测血清样品浓度：当标准曲线和质控品均被判定有效时，根据待测样本的OD值从标准曲线计算出待测血清样品的f-PSA浓度。

本发明的主要优点在于：

(1)由于本发明的试剂盒采用对f-PSA具有高亲和力，且高特异性识别f-PSA不同表位的单克隆抗体，灵敏度和准确性非常高。其线性范围值为0.5-50ng/ml，准确性为94.0％。

(2)由于采用的单克隆抗体对于f-PSA具有极其优异的结合特性，因此本发明的试剂盒可以极其快速地检测出血液中f-PSA，将现有技术中需数小时才能获得检测结果缩短到30分钟左右，比普通的同类ELISA试剂盒更为快速。这对于临床快速且准确地诊断早期前列腺癌以及区分前列腺癌和良性增生而言具有极其重大的意义。

(3)本发明试剂盒还具有简便、稳定等特点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1 f-PSA酶免试剂盒的制作

一、从人精液内提取纯化f-PSA

收集人的精液，10 000×g 离心20min，上清PBS透析，再次离心一次，0.22μm滤膜过滤，收集滤液。

将上述获得的滤液上疏水层析柱(Thioiphilic gel chromatography)，峰内收集到的目的产物。

将目的产物上凝胶过滤层析柱(分离范围：5-70KD)，收集f-PSA所在的峰，得到f-PSA纯品。

采用SDS-PAGE验证纯度，Western Blot、ELISA验证特异性，获得经检测合格的纯化f-PSA。

二、制备纯化包被抗体

使用经典的单克隆抗体生产方法获得S-44-10、S-191-5或S-115-8阳性杂交瘤细胞株(参见专利CN200610026505.0)：在经过佐剂预处理的小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞，使之分泌单克隆抗体；抽取腹水；经常规的硫酸铵、辛酸沉淀，Protein G亲和层析，收集抗体峰，PBS透析得单克隆抗体纯品。

SDS-PAGE验证纯度＞98％，效价12万。

三、酶标记抗体制备

采用常规的过碘酸钠法，在酸性条件下，将抗f-PSA抗体S-191-5、S-115-8或S-44-10与辣根过氧化物酶偶联，用PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃保存。

经测定，效价＞10000。

四、f-PSA标准品制备

将前述“一”制备获得的纯化f-PSA溶解在PBS中，加入适量的50％甘油，分装成f-PSA浓度分别是0、1、2.5、5、10、25ng/ml的溶液共6支，作为f-PSA标准品。

上述制备的f-PSA标准品的浓度参考曲线如图1所示。

五、包被抗体和酶标记抗体工作浓度选定

采用常规的方阵滴定法，选择对应的抗体包被浓度和酶标记抗体浓度。包被抗体从5μg/ml倍增稀释，包被酶标板，加梯度稀释的酶标抗体测定，以确定应用浓度。

经过反复验证，选择的较佳工作浓度为：10μg/ml-1∶10000。

六、预包被抗体板的制备

(1)包被

包被液----0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液500ml；

Na₂CO₃ 0.6g；

NaHCO₃ 1.58g；

将上述溶液调整PH9.6，定容至500ml；接着，加入适量的包被单抗，稀释至10μg/ml，加入微孔板各孔中，封口膜加盖，4℃过夜甩干。

(2)洗涤

洗涤液----1M/L Tris 20ml；

Hcl 16.8ml；

Tween20 0.5ml；

调整PH至7.2，用H₂O定容至1L。洗涤液加入各孔内，静置3min后甩干，上述操作重复3次，以除去游离抗体。

(3)封闭

BSA 3g；

明胶 1.1g；

0.15M PBS定容100ml

水浴加温至呈透明溶液，冷却至室温

注入酶标板各孔中，封口加盖，37℃温育2小时

吸水纸拍干，重复一次，待干燥后放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃，备用。

七、质控血清制备

收集正常女性血清，-20℃保存。将累积的各份血清混合，加入f-PSA标准品用ELISA方法测定浓度，并按标准曲线要求，将两份混合血清浓度调至2±0.5ng/ml、10±2ng/ml范围。

f-PSA标准品溶在血清内的标准曲线如图2所示。

将所获得的两份血清按试剂盒需要量分装，即制备成低、高值质控品。

八、酶标单抗稀释液

BSA 0.5g；

Tween-20 1％；

0.15M PBS调PH7.2，定容至100ml。

将抗体标记物按工作浓度稀释，-20℃冻存备用。

九、底物缓冲液

Na₂HPO₄·12H₂O 1.7g；

柠檬酸·H₂O 0.5g；

3％H₂O₂ 200μl；

ddH₂O 100ml；调节PH至5.0。

十、显色液

Na₂HPO₄·12H₂O 1.7g；

柠檬酸·H₂O 0.5g；

ddH₂O 100ml；

调整PH至5.0后，加入10ml DMSO含60mgTMB的溶液25μl。

十一、反应终止液

浓硫酸 10ml；

ddH₂O 80ml。

十二、洗涤液(10×)

1M/L Tris 200ml；

Hcl 168ml；

Tween20 5ml；

调整PH至7.2，H₂O定容至1L。

十三、增敏剂

PEG 6000 4g；

甘油 1g；

蔗糖 1g；

明胶 1g；

PBS 100ml。

十四、半成品及成品的组装

将前述所得试剂分别装入容器(如小瓶或离心管)中，将容器装入试剂盒中，将获得的预包被抗体板也装入盒内，备用。

此外，也可在试剂盒中装入所述的试剂盒的使用说明书。

实施例2 f-PSA酶免试剂盒的操作

1.抗原抗体反应

在试剂盒提供的抗体包被板的微孔内分别加入100μL不同浓度的标准品、质控品，或待测血清样品。

2.酶联反应

同时将HRP-单克隆抗体溶液加入各孔，100μL/孔，再加入100μL增敏剂，放入温控摇床内，37℃振荡、孵育30min。

采用洗涤液(1×)重复洗板3次。

3.显色反应

每孔加入底物溶液、显色液各50μL，37℃孵育15min，每孔加入100μL反应终止液，结束反应。

4.比色

以空白对照孔的吸光值调零，酶标仪在450nm测定OD值并打印结果。

5.结果计算

A)制作标准曲线

以标准品浓度为横坐标，标准品测定OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算曲线回归系数R²，当R²＞0.98时本次测验有效。

B)评判质控品浓度

根据质控品的OD值，从标准曲线上读出相应的浓度值；质控品测定浓度值处于给定范围时，此次测定有效。

C)计算待测血清样品浓度

当标准曲线和质控品均被判定有效时，根据待测样本的OD值从标准曲线计算出待测血清样品的f-PSA浓度。

实施例3 f-PSA酶免试剂盒的质量检测

以前述的单克隆抗体S-44-10作为包被抗体，以前述的单克隆抗体S-191-5作为检测抗体，其它试剂同实施例1，制备f-PSA酶免试剂盒。对该试剂盒进行质量检测如下：

1)线性范围

将实施例1中制备的f-PSA纯品稀释成梯度浓度：100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0ng/ml。按照前述实施例2操作步骤进行测定。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制曲线。所获得的曲线见图3。

结果显示，线性范围内最高检测上限值为50ng/ml，最低检测下限值为0.5ng/ml。试剂盒线性范围为0.5-50ng/ml。

2)检测灵敏度

根据上述线性范围测定结果(图3)，本发明上述制备的试剂盒的检测灵敏度为0.5ng/ml。

3)准确性

取三份待测正常女性血清，混合后分为三份混合血清标本，分别加入f-PSA纯品，配成浓度为0、2、10ng/ml，制成回收试验血清标本1#、2#、3#。按前述实施例2操作步骤进行测定并计算结果。然后计算回收率。

结果，2#、3#标本的回收率分别为104.9％和107.2％，平均回收率106.0％，即试剂盒的比例偏差为6.0％，准确性为94.0％。

4)精密度

抽取10份前述制备的相同类型的试剂盒，用同一份待测样本前述实施例2操作步骤进行重复测定。计算本次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。

精密度试验结果显示，“变异系数CV＝5.09％”；批间CV＜15％。

5)稳定性

为了验证试剂盒的稳定性，本发明人将试剂盒各组分置37℃，保存1周，然后用于检测，结果发现检测的准确性及精密度没有显著变化。

实施例4 f-PSA酶免试剂盒测定国家参照品f-PSA

以前述的单克隆抗体S-44-10作为包被抗体，以前述的单克隆抗体S-191-5作为检测抗体，其它试剂同实施例1，制备f-PSA酶免试剂盒。用于测定国家参照品f-PSA。

将国家参照品(购自中国药品生物制品检定所)稀释成一系列浓度梯度：25、10、5、2.5、1、0ng/ml。使用本发明的试剂盒，按照前述的操作步骤，测定其吸光度值(OD450)，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制曲线。

结果发现，国家参照品和对应浓度吸光度值成线性关系，相关系数R²＝0.998。说明本发明试剂盒具有极其优异的准确性。

表1检测国家f-PSA参考品

实施例5 f-PSA酶免试剂盒测定正常人血清f-PSA含量

一、临床血清的获得

从临床取得健康体检者血清11份，其中6份女性血清，5份男性血清。血清的制备采用临床检验科常规方法，肘静脉取血，血液置于室温下1h，凝固后，置4℃，过夜(切勿冰冻)析出血清，离心，4000rpm，10min。在无菌条件，吸出血清，分装(0.05～0.2ml)，贮于低温冰箱。

二、使用实本发明的试剂盒测定正常血清

以前述的单克隆抗体S-44-10作为包被抗体，以前述的单克隆抗体S-191-5作为检测抗体，其它试剂同实施例1，制备f-PSA酶免试剂盒。用于测定正常血清。

按照前述实施例2操作步骤，测得各血清吸光度值，参照标准曲线，计算出血清内f-PSA的含量。

结果显示，5份正常男性血清样本中有一份的f-PSA含量为0.52ng/ml，其余均在检测限下，男性平均水平为0.27ng/ml；而6份女性血清f-PSA水平均在检测限下。

表2 用本发明的试剂盒检测正常人血清f-PSA含量

实施例6定量法f-PSA酶免试剂盒测定临床阳性血清f-PSA含量

一、临床血清的获得

从长征医院获得8份临床阳性血清。血清的制备方法同实施例4中所述方法。经Abbott化学法光法自动检测仪检测T-PSA均＞4 ng/ml。

二、使用本发明的试剂盒测定临床阳性血清

以前述的单克隆抗体S-44-10作为包被抗体，以前述的单克隆抗体S-191-5作为检测抗体，其它试剂同实施例1，制备f-PSA酶免试剂盒。用于测定临床阳性血清。

按照前述实施例2操作步骤，测得各血清吸光度值，参照标准曲线，计算出血清内f-PSA的含量。本次检测中参考曲线中f-PSA参考品浓度和吸光度值OD450成线性关系，R²＝0.9859。

计算得到的临床血清f-PSA浓度值占T-PSA的比例，6#在15％以上，提示前列腺癌的可能性较小，其它血清的比例均在15％以下，提示前列腺癌的可能性较大。

表3检测临床阳性血清f-PSA含量

实施例7定量法f-PSA酶免试剂盒和商品化试剂盒的比对

一.临床血清来源

从健康体检者处获得5份正常血清；从长征医院获得6份临床阳性血清。血清的制备方法同实施例4中所述方法。经Abbott化学发光法自动检测仪检测T-PSA均＞4 ng/ml。

二.本发明试剂盒和商品化试剂盒检测血清结果比对

以前述的单克隆抗体S-44-10作为包被抗体，以前述的单克隆抗体S-191-5作为检测抗体，其它试剂同实施例1，制备f-PSA酶免试剂盒。按照前述实施例2操作，检测血清f-PSA含量。

购买BioCheck f-PSA检测试剂盒(BioCheck公司，Lot N0：RN-25907)按照其附带说明书操作，所得结果分别用各自的标准曲线计算F-PSA的浓度，比对两份结果，进行统计学处理。

表4 血清f-PSA含量检测结果比较

本发明试剂盒和商品化试剂盒检测血清f-PSA结果比对见图4和表4。本发明试剂盒和商品化试剂盒检测血清f-PSA结果相关分析一线性回归结果见图5。结果表明，两种检测方法的检测结果具有非常显著的相关性，从而证明本发明的试剂盒的检测结果是非常可信的。

三.灵敏度和耗时的比较

为了进一步地比较前述的试剂盒和商品化试剂盒，本发明人检测了两者在0-1ng/ml范围内，对于f-PSA标准品测定的吸光度。

将纯化制备的f-PSA标准品用样品稀释液，稀释成25、10、5、2．5、1、0ng/ml，分别按照本试剂盒和BioCheck试剂盒的说明书操作，测定在450nm的吸光度，并比较两种试剂盒的测定结果。

表5测定f-PSA的吸光度的比较

本发明试剂盒；商品化试剂盒；

吸光度吸光度

f-PSA浓度(ng/ml) f-PSA浓度(ng/ml)

0 0.054 O O.053

1 0.226 1 0.110

2.5 0.522 2.5 0.198

5 0.91 6 5 0.453

10 1.556 10 0.816

25 2.985 25 1.958

灵敏度

由表5可见：在0-1ng/ml范围内，本发明的试剂盒1ng吸光度是阴性值的4.2倍。而商品化试剂盒1ng的吸光度是阴性值的2.1倍，这就显示本试剂盒信噪比显著更优。

此外，以“CUT off值＝平均值+3×标准差” 公式计算所的的结果也显示，本发明的试剂盒的灵敏度显著高于对照商品化试剂盒。

反应时间

上述商品化试剂盒在操作上要求样品孵育和酶标物孵育时间分别为60分钟，显色时间为15分钟，加上其它洗涤操作的时间共150分钟。

本发明的试剂盒可采取样品孵育和酶免反应同时进行的操作，操作时间共30分钟，显色为10分钟，完全可在50分钟内可以完成实验测定。

实施例8 f-PSA单抗配对效果比较

将所述的单克隆抗体分成两组来制备检测试剂盒：组I：包被抗体S-44-10抗体，检测抗体S-191-5，采用的其它试剂如实施例1所制备；组II：包被抗体S-191-5抗体，检测抗体S-44-10，采用的其它试剂如实施例1所制备。

配对检测时，将f-PSA标准品用稀释液稀释成1000、100、10、1、0ng/ml，用上述组I和组II制备而成的两种试剂盒，按照实施例2中的操作步骤，分别检测这五种1000、100、10、1、0ng/ml稀释度的f-PSA标准品，将比较组I和组II的试剂盒的检测效果。

结果见图6，组II的检测配对检测容易出现HD-HOOK效应，即在f-PSA的浓度增加时，吸光度值反而下降的现象，主要由于抗原抗体反应的动力学决定，和抗体特性相关，且f-PSA在10-100ng/ml其吸光度值小于组I配对的检测结果。在检测更多的f-PSA稀释度(100-0ng/ml)时，组II配对的检测结果也小于组I配对的检测结果。可见，组I的两种抗体配对检测f-PSA效果更优于组II的两种抗体配对检测效果。所以最优选的情况是选择S-44-10抗体作为包被抗体、S-191-5作为检测抗体这一配对组合。

菌种保藏

杂交瘤细胞系S-115-8、杂交瘤细胞系S-191-5和杂交瘤细胞系S-44-10保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，保藏号分别为：CCTCC-C200620、CCTCC-C200621和CCTCC-C200622，保藏日均为2006年4月29日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种诊断前列腺癌的试剂盒

<130>067628

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>261

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly

1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu

20 25 30

Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala

35 40 45

Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala

50 55 60

His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu

65 70 75 80

Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe

85 90 95

Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg

100 105 110

Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu

115 120 125

Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln

130 135 140

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile

145 150 155 160

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu

165 170 175

His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val

180 185 190

Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr

195 200 205

Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln

210 215 220

Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro

225 230 235 240

Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr

245 250 255

Ile Val Ala Asn Pro

260

Claims

1.一种检测f-PSA的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有：

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的第一单克隆抗体是：由保藏号为CCTCC-C200622的杂交瘤产生的抗体；且所述的第二单克隆抗体是：由保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤产生的抗体。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含：

(a)容器b，所述的容器b中装有f-PSA的标准品；和/或

(b)容器c，所述的容器c中装有f-PSA的质控品。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含：

(c)容器d，所述的容器d中装有与标记物相对应的底物；

(d)容器e，所述的容器e中装有显色剂；

(e)容器f，所述的容器f中装有洗涤液；和/或

(f)容器g，所述的容器g中装有终止液。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的固相载体选自：微量滴定板、或微球。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的线性范围值为0.5-50ng/ml。

9.一种体外检测f-PSA方法，其特征在于，包括以下步骤：

附加条件是，步骤(a)和步骤(b)可依次进行或同时进行。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的第一单克隆抗体是：由保藏号为CCTCC-C200622的杂交瘤产生的抗体；且所述的第二单克隆抗体是：由保藏号为CCTCC-C200621的杂交瘤产生的抗体。