CN109030823A - 一种检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条及其制备方法和应用，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其特征在于：所述反应膜上具有包被有青枯病菌捕获抗体的检测线和包被有羊抗鼠二抗的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有青枯病菌检测抗体‑胶体金标记物。本发明还提供一种应用上述试纸条检测样品中青枯病菌的方法。本发明提供的试纸条和检测方法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的优点，能够实现对大批量的青枯病菌样品进行快速检测和现场监控。

Description

一种检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及青枯病菌的检测，具体是一种用于检测青枯病菌的胶体金试纸条，其特别适用于烟叶中青枯病菌的检测。

背景技术

烟草青枯病又称“烟瘟”，是由青枯假单孢杆菌引起的一种重要的维管束病害，近年来在我国主要产烟区呈加重发生趋势，对烟叶产量和质量造成无法挽回的巨大损失，是制约我国烟草生产最具威胁的病害之一。

目前青枯病菌的检测方法主要有常规检测法，血清学方法如酶联免疫吸附法（ELISA），分子生物学检测方法如核酸分子杂交、PCR扩增，胶体金法等。常规测定法的优点在于简便易行，其缺点是检测周期长初学者误判率高，难以达到“快速、准确、经济”的要求；分子生物学检测方法比如定量PCR检测能够准确获得烟叶中青枯病的数量，但是过程较为复杂，技术难度高，对操作者要求比较高；胶体金法能对烟草中青枯病菌进行定性分析，操作简单，检测时间较短。在生产中有必要建立简便有效、操作性强的烟草青枯病早期检测方法，以满足基层技术人员及田间工作实际需要，为烟草青枯病防治工作提供准确及时的依据。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的检测青枯病菌的方法存在的对设备依赖性高，并且不能够实现对大批量样品的快速检测的特点，提供一种操作简单、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的胶体金试纸条及其制备方法和应用，以实现对大批量的青枯病菌样品进行快速检测和现场监控。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其中，所述反应膜上具有包被有青枯病菌捕获抗体的检测线和包被有羊抗鼠二抗的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有青枯病菌检测抗体-胶体金标记物，所述青枯病菌捕获抗体及青枯病菌检测抗体是由青枯病菌或青枯病菌外泌蛋白为免疫原制备获得具有不同表位的单克隆抗体。

所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，且结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。所述底板为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

所述青枯病菌外泌蛋白是通过构建质粒，利用大肠杆菌表达体系表达、纯化制备获得

制备青枯病抗体的免疫原为青枯病菌时，是指青枯病亚洲分支（演化型Ⅰ）序列变种13、15、17和34，是通过平板培养纯化所得。

制备青枯病抗体的免疫原为外泌蛋白时，是指多聚半乳糖醛酸内切酶、果胶酶、外多聚半乳糖醛酸酶、海藻酸裂解酶、鞭毛蛋白，是通过构建质粒，利用大肠杆菌表达体系表达、纯化制备获得。

一种制备上述试纸条的方法，包括以下步骤：

1）制备喷涂有青枯病菌检测抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备包被青枯病菌捕获抗体的检测线和包被羊抗鼠二抗的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

2）将制备的青枯病菌检测抗体加入到制备的胶体金中，得到青枯病菌检测抗体-胶体金标记物；

3）将青枯病菌检测抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1 h后取出，置于干燥环境中保存备用；

4）分别将青枯病菌捕获抗体和羊抗鼠二抗包被于反应膜的检测线（T）和质控线（C）上；

5）将样品吸收垫用含0.1~0.5%牛血清白蛋白（质量分数）、pH 7.4的0.01~0.05 mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2 h，37℃下烘干2 h；

6）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖。最后切成4 mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4~30℃条件下可保存12个月。结合物释放垫的1/3被样品吸收垫覆盖可以延长检测结果观察时间，可使样品吸收垫将检测液体充分吸收并与金标抗体充分反应，从而减少误差。

应用上述胶体金试纸条检测样品中青枯病菌的方法，包括如下步骤：

（1）对样品进行前处理；

（2）用胶体金试纸条进行检测；

（3）分析检测结果。

本发明的检测青枯病菌的试纸条采用高灵敏、高特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将青枯病菌检测抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的青枯病菌在流动过程中，与结合物释放垫上的青枯病菌单克隆检测抗体-胶体金标记物结合，形成青枯病菌-抗体-胶体金标记物。青枯病菌-抗体-胶体金标记物与反应膜检测线上的青枯病菌捕获抗体结合，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有青枯病菌。

检测时，样品经处理后滴入样品吸收垫，当青枯病菌在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆检测抗体-胶体金标记物在层析过程中不会与固定在反应膜上的青枯病菌捕获抗体结合，在质控线（C）处出现一条红色条带，而检测线（T）不显色；如果青枯病菌在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆检测抗体-胶体金标记物会与青枯病菌结合后，再与捕获抗体结合，检测线（T）和质控线（C）同时显色，菌含量越高，T线越亮，如图2所示。

阳性：当质控线（C）显示出红色条带，检测线（T）同时也显示出红色条带，判为阴性。

阴性：当质控线（C）显示出红色条带，而检测线（T）不显色时，判为阴性。

无效：当质控线（C）不显示出红色条带，则无论检测线（T）显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、不受检测设备限制、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测青枯病菌的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为试纸条剖面结构示意图，

图中：1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、底板；6、检测线；7、质控线；

图2为试纸条检测结果判定图；

图3为青枯病菌的培养及PCR鉴定；

图4为所表达的示例外泌蛋白SDS-Page，

图4中： 1、蛋白marker；2、PglA；3、FliA。

具体实施方式

本发明以下结合实施例（附图）做进一步描述：

这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入发明的保护范围。

实施例1 检测青枯病菌的胶体金试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1）制备喷涂有青枯病菌检测抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备包被青枯病菌捕获抗体的检测线和包被羊抗鼠二抗的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、青枯病菌的分离及鉴定

使用牛肉膏蛋白胨琼脂对青枯病菌进行增菌培养，结果如图3所示。图3A为青枯病在平板上的生长状态，表明菌落比较单一，没有杂菌，对培养的青枯病菌进行了PCR鉴定，结果如图3B所示，在200 bp-300 bp之间有清晰的单一DNA条带，表明菌落为青枯病病菌，即权利要求4中所述是指青枯病亚洲分支（演化型Ⅰ）序列变种13、15、17和34。

2、青枯病分泌蛋白iTRAQ分析

在青枯病菌液体培养基中，使用红花大金元，云南87和K326的烟沫进行刺激培养，以未加烟叶刺激青枯病菌培养组为参考，使用iTRAQ技术对液体培养基上清液中的分泌蛋白进行分析。iTRAQ分析在培养基上清液中共鉴定到727个蛋白，按照up_regulate≥1.5和down_regulate≤0.67，P_value≤0.05的规则进行筛选，红花大金元，云南87和K326烟沫刺激组相比较参考组分别有60，59和62个蛋白被显著差异表达，其中有22个蛋白在三种烟叶刺激后均被差别表达，结果如表1所示。

表1. 两两样品间蛋白显著差异数量

类型	Hongda/CK	Yun87/CK	K326/CK
				总定量数	727	727	727
上调蛋白数量	26	31	20
				下调蛋白数量	34	28	42
总差异数量	60	59	62

3、外泌靶标蛋白的确定

针对鉴定出的所有蛋白进行GO功能注释分析，分别描述分子功能和参与的生物过程。结合GO的分析结果，从22种均被显著差异表达的蛋白中，按照表达的丰度以及种间的特异性，挑选出被上调表达的外泌蛋白，以结构蛋白鞭毛蛋白（Flagellin protein, FliA）和青枯病侵染过程关键蛋白果胶酶蛋白（Endopolygalacturonase, PglA）为例，根据PglA和FliA的氨基酸序列及上游基因序列，设计质粒转染大肠杆菌表达，使用SDS-Page对纯化后的表达蛋白进行表征，结果如图4所示，PglA的分子量在56 kDa附近，FliA在34 kDa附近，蛋白纯度较高。

4、青枯病菌单克隆捕获和检测抗体的制备

（1）杂交瘤细胞的获得

1）首次免疫：将青枯病亚洲分支（演化型Ⅰ）序列变种13、15、17和34以及外泌蛋白多聚半乳糖醛酸内切酶、果胶酶、外多聚半乳糖醛酸酶、海藻酸裂解酶、鞭毛蛋白（免疫抗原）与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，剂量50ug（抗原）/只；

2）加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；

3）最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1 mL，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；

4）以青枯病亚洲分支（演化型Ⅰ）序列变种13、15、17和34以及外泌蛋白多聚半乳糖醛酸内切酶、果胶酶、外多聚半乳糖醛酸酶、海藻酸裂解酶、鞭毛蛋白为包被原，以1ug/ml的浓度包被，4℃过夜包，抗血清用PBS以1:1000,1:2000,1:4000,1:8000,1:16000等稀释度稀释，添加商品化羊抗鼠二抗后筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌青枯病菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。

（2）单克隆抗体的制备

1）细胞复苏：取出青枯病菌单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；

2）制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5 mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用ProteinA亲和层析柱进行纯化，用间接ELISA法测定抗体的效价为1:(100000~200000)，得到青枯病菌单克隆抗体溶液（-20℃保存）。

3）制备的青枯病菌单克隆抗体含有多种效价和表位的抗体，后续将开展表位测定和配对，以确定捕获抗体和检测抗体。

5、表位测定及抗体配对

（1）检测抗体生物素标记

将待标记物用PBS稀释液稀释为1mg/ml，体积200μL~500μL。将生物素溶于二甲亚砜（DMSO）浓度中，终浓度为10mg/ml，按照蛋白：生物素摩尔比=1：10将生物素加入青枯病菌抗体溶液中混匀，37℃摇床温育，反应产物用聚丙烯酰胺纯化柱纯化。

（2）抗体配对

将步骤4中制备的多种青枯病菌抗体按照2ug/ml浓度进行包被，37℃2h或者4℃过夜，用2%BSA或者5%的脱脂牛奶按照200μL/孔的剂量，37℃1小时或4℃过夜封闭,PBST洗4遍，将青枯病菌按照100μL/孔添加到96孔中37℃条件下反应2小时，标记有生物素的检测抗体按照1：4000稀释后每孔添加100μL，37℃条件下反应2小时后加入Avitin-HRP， 37℃反应1小时后进行测定，根据测定的吸光度值确定捕获抗体，并与检测抗体配对用于试纸条的开发。

6、青枯病菌单克隆抗体-胶体金标记物的制备

（1）胶体金的制备

用双蒸去离子水将质量分数为1%的氯金酸溶液稀释成0.01%，取100 mL置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.5 mL质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的酒红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备良好的胶体金用肉眼观察是清亮透明的，没有混浊，液体表面无漂浮物，在日光下观察胶体金的颜色为酒红色。

（2）青枯病菌单克隆检测抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2 mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH至7.2（不同抗体的pH标记范围在7~8之间，可以变化），按每毫升胶体金溶液中加入20~50 μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述青枯病菌单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置10 min，加入10% BSA使其在胶体金溶液中的终质量分数为1%，静置10 min。12000 r/min，4℃离心40 min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含BSA的质量分数为0.1%~0.3%、吐温-80的质量分数为0.05%~0.2%、pH7.2的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液。

7、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含0.05% BSA（质量分数）、pH 7.4的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1 h，37℃烘3 h备用。用喷膜仪将制备好的青枯病菌单克隆检测抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1 cm结合物释放垫喷涂8 μL青枯病菌单克隆检测抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中干燥60 min后取出备用。

8、反应膜的制备

将青枯病菌捕获抗体包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠二抗包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将青枯病菌捕获稀释到0.2 mg/mL，用划线仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T），包被量为1.0 μL/cm；用0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠二抗稀释到200 μg/mL，用划线仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C），包被量为1.0 μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2 h，备用。

8、试纸条的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线（T）和质控线（C）均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3 mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4~30℃条件下可保存12个月。

实施例2 烟叶样本中青枯病菌的检测

1、样本的前处理

（1）检测前样本应恢复至室温20-25℃；

（2）称取0.5±0.05 g粉碎的样本至聚苯乙烯离心管中；

（3）加入500 μL提取缓冲溶液中，使用捣棒上下捣10-15次捣碎；

2、用试纸条进行检测

用一次性吸管吸取待检样本溶液2~3滴垂直滴于加样孔中，液体流动时开始计时，反应10 min，判定结果。

3、分析检测结果

阴性（-）：C线处显红色，T线处不显，表示组织样本中青枯病菌数量低于检测限。

阳性（+）：C线和T线处同时显红色，表示组织样本中青枯病菌数量等于或者高于检测限。

无效：未出现C线处未显红色，表明不正确的操作过程或试纸条已失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

实施例3 交叉反应率

为了考察试纸条的交叉反应率，我们使用亚洲分支（演化型Ⅰ）序列变种13、15、17和34、烟草花叶病毒CMV, TMV, PVY、烟草黑胫病菌、烟草野火病菌、烟草赤星病菌、大肠杆菌等9种烟草常见病害菌或者病毒上样胶体金试纸条，结果表明我们制备的抗体可以有效识别亚洲分支（演化型Ⅰ）序列变种13、15、17和34，与其余7种病毒或者病毒无交叉反应。

Claims (7)

1.一种检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其特征在于，所述反应膜上具有包被有青枯病菌捕获抗体的检测线和包被有羊抗鼠二抗的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有青枯病菌检测抗体-胶体金标记物，所述青枯病菌捕获抗体及青枯病菌检测抗体是由青枯病菌或青枯病菌外泌蛋白为免疫原制备获得具有不同表位的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条，其特征在于：所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，且结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。

3.根据权利要求1所述的检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条，其特征在于：所述青枯病菌外泌蛋白是通过构建质粒，利用大肠杆菌表达体系表达、纯化制备获得。

4.根据权利要求1所述的检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条，其特征在于：制备青枯病抗体的免疫原为青枯病菌时，是指青枯病亚洲分支（演化型Ⅰ）序列变种13、15、17和34，是通过平板培养纯化所得。

5.根据权利要求1所述的检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条，其特征在于：制备青枯病抗体的免疫原为外泌蛋白时，是指多聚半乳糖醛酸内切酶、果胶酶、外多聚半乳糖醛酸酶、海藻酸裂解酶、鞭毛蛋白，是通过权利要求3所述方法制备所得。

6.一种制备权利要求1-5任一项所述胶体金试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备喷涂有青枯病菌检测抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备包被青枯病菌捕获抗体的检测线和包被羊抗鼠二抗的质控线反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

7.一种应用权利要求1-5任一项所述试纸条检测烟叶及植烟土壤样品中青枯病菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）对样品进行前处理；

2）用所述的试纸条进行检测；

3）分析检测结果。