CN113189331A - 一种烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条及其制备方法和应用，属于生物检测技术领域。所述试纸条包含抗烟草青枯病菌单克隆抗体，其中，所述抗烟草青枯病菌单克隆抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明通过对现有检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条进行改良优化，从而成功制备得到一种具有特异性强、灵敏度高、操作简便、反应快速等优点的烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性青枯病是一种毁灭性土传病害。除了侵染茄科作物，R.solanacearum还可以侵染50多个科的200多种植物，是烟草、番茄、辣椒、茄子、生姜、马铃薯、花生、草莓和香蕉等农作物产量和品质的重要限制因素。由于其寄主范围广且防治困难，因此被称为植物的“癌症”。由于缺乏有效的防治药剂，在我国农用硫酸链霉素一直被用来青枯病的防治，而随着我国停止使用农用硫酸链霉素，植物青枯病的防治面临巨大挑战。
对烟草青枯病菌的准确、快速检测是对烟草青枯病执行防控措施的重要前提。目前，对该病原菌的检测主要是在基因分子水平对病原菌进行检测，包括PCR等。基因分子水平检测技术具有准确、灵敏的优势，但需要较为严格的实验条件、措施及操作，不能完全满足现存快速检验检疫的需求。因此，建立对烟草青枯病菌现场快速、准确的轻简型检测方法对严格执行防控措施具有极大的现实意义。
胶体金免疫层析试纸条由于其快速便捷、操作简单、成本低、性能稳定等特点而备受关注。以胶体金颗粒为标记物，利用抗原-抗体的特异性反应，通过裸眼可见的颜色反应来检测目标分析物。因此，胶体金免疫层析试纸条对病原物的现场快速检测具有重要意义。发明人发现，现有技术中已经有检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条，然而，其普遍存在检测灵敏度低、特异性差、检测时间长等缺陷，从而影响其实际应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条及其制备方法和应用。本发明通过对现有检测烟草青枯病菌的胶体金试纸条进行改良优化，从而成功制备得到一种具有特异性强、灵敏度高、操作简便、反应快速等优点的烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条，因此具有良好的实际应用之价值。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条，所述试纸条按照常规胶体金试纸条设置，所述试纸条包含抗烟草青枯病菌单克隆抗体，其中，所述抗烟草青枯病菌单克隆抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
具体的，所述抗烟草青枯病菌单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列具有与SEQID NO.1相比至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。
所述抗烟草青枯病菌单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID NO.1相比至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。
本发明的又一具体实施方式中，所述烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条包括：底板，所述底板上依次设置有吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接。
其中，
所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置质控线和检测线，所述检测线上包被有抗烟草青枯病菌多克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗小鼠IgG；
其中，所述多克隆抗体可通过常规多克隆抗体制备方法获得，其免疫原为烟草青枯病菌，免疫动物可以为兔子，如新西兰大白兔。
所述金标垫上喷涂有纳米金标记的上述抗烟草青枯病菌单克隆抗体。
所述吸水垫可以为吸水板，所述底板可采用纸板。
所述烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条其规格可按照常规方式设置，在本发明的一个具体实施方式中，所述吸水垫长度控制为15-20mm，宽度控制为3-5mm；检测垫长度控制为20-25mm，宽度控制为3-5mm；金标垫长度控制为3-7mm，宽度控制为3-5mm；样品垫长度控制为20-25mm，宽度控制为3-5mm，相邻各垫的交叠长度控制为3-6mm；
本发明的又一具体实施方式中，所述检测垫上的质控线与检测线的间距控制为3-6mm，检测线与硝酸纤维素膜上沿之间的间距为13-18mm。通过控制各构件的长宽和距离等，从而使得制备得到的烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条规格更加适宜，既便于携带使用，同时也有利于提高检测效率。
本发明的又一具体实施方式中，所述金标垫中所用的纳米金粒径控制为30-50nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗烟草青枯病菌单克隆抗体的用量为80-120ng；检测垫检测线上每厘米喷涂长度所需的抗烟草青枯病菌多克隆抗体的用量为80-120ng。通过控制纳米金颗粒大小及单克隆抗体及多克隆抗体用量，从而能够有效提高检测灵敏度及特异性。
本发明的第二个方面，提供上述烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条的制备方法，所述制备方法包括：将抗烟草青枯病菌单克隆抗体加入到纳米金中，获得纳米金标记的抗烟草青枯病菌单克隆抗体，并喷涂至金标垫上；
所述制备方法还包括：在底板上按顺序粘贴上吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，组装形成试纸条；
其中，检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置质控线和检测线，所述检测线上包被有抗烟草青枯病菌多克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗小鼠IgG。
本发明的第三个方面，提供上述试纸条在烟草青枯病菌检测中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种快速检测烟草青枯病菌的方法，所述方法包括：采用上述试纸条对待测样品进行检测，分析检测结果。
本发明的又一具体实施方式中，所述待测样品仅需通过简单预处理即可，具体的，将待测植物样品经研磨后加入样品缓冲液即得待测样品，将其滴加至样品垫上，待5-10分钟后，利用如下依据进行结果判定：
(1)质控线(C)显色，检测线(T)出现红色条带为阳性；
(2)C线显色，T线不出现红色条带为阴性；
(3)若C线不显色或只有T线显色，说明不正确的操作过程或试纸条失效。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
(1)上述技术方案中提供的烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条，其廉价易得，极大的降低了田间烟草青枯病的快速筛查成本；同时该试纸条检测时间短，5-10分钟可完成检测，大大提高了烟草青枯病菌的快速筛查效率；其使用的单克隆抗体的亚型为IgG2b,大大提高了产品批次间的稳定性，降低了生产成本。
(2)上述技术方案中提供的烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条，灵敏度高，试纸条对烟草青枯病菌检测限为1×104cfu/mL；稳定性好，试纸条在室温下可保存18个月；田间检测对采样量要求低，单次检测只需10mm*10mm大小的叶片，降低了田间采样量。
(3)上述技术方案中提供的烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条特异性强，检测广谱性强，对云南、贵州、四川、重庆、湖南、湖北、河南、山东等全国主要植烟省份采集的烟草青枯病菌株均能够识别，对其它常见细菌如大肠杆菌、芽孢杆菌、假单胞菌等无交叉反应，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明的烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条灵敏度测试，图中自左往右依次为：108，107，106，105，104，0cfu/mL。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条，所述试纸条包括底板，底板的一面从上到下依次黏贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置质控线和检测线，所述检测线位于质控线下方，检测线上包被有抗烟草青枯病菌多克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗小鼠IgG；所述金标垫上喷涂有纳米金标记的抗烟草青枯病菌单克隆抗体；所述的抗烟草青枯病菌单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌产生。
本发明的又一具体实施方式中，所述抗烟草青枯病菌单克隆抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明的又一具体实施方式中，所述抗烟草青枯病菌单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID NO.1相比至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。
本发明的又一具体实施方式中，所述抗烟草青枯病菌单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID NO.1相比至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。
本发明的又一具体实施方式中，所述的烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条，其吸水垫长18mm，宽4mm；检测垫长25mm，宽4mm；金标垫长5mm，宽4mm；样品垫长22mm，宽4mm，相邻各垫的交叠长度为5mm；所述的吸水垫为吸水板；所述的底板为纸板。
本发明的又一具体实施方式中，所述检测垫上质控线于检测线的间距为5mm，检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15mm。
本发明的又一具体实施方式中，所述金标垫中所用的纳米金粒径为40nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗烟草青枯病菌单克隆抗体的用量为100ng；检测垫检测线上每厘米喷涂长度所需的抗烟草青枯病菌多克隆抗体的用量为100ng。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条的制备方法，所述制备方法包括：将抗烟草青枯病菌单克隆抗体加入到纳米金中，获得纳米金标记的抗烟草青枯病菌单克隆抗体，并喷涂至金标垫上；
所述制备方法还包括：在底板上按顺序粘贴上吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，组装形成试纸条；
其中，检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置质控线和检测线，所述检测线上包被有抗烟草青枯病菌多克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗小鼠IgG。
本发明的又一具体实施方式中，制备上述抗烟草青枯病菌单克隆抗体可采用常规单克隆抗体制备方法进行，在本发明的一个具体实施方式中，所述制备方法包括：动物免疫、细胞融合、细胞株筛选和杂交瘤细胞分泌抗体亚型的鉴定。
其中，所述动物免疫中免疫原为烟草青枯病菌，免疫动物为小鼠，如BALB/C小鼠。
所述杂交瘤细胞分泌抗体亚型的鉴定中，所述抗体为IgG2b抗体，经试验证明，本发明获得的上述单克隆抗体不仅能够与抗烟草青枯病菌多克隆抗体0334配对，同时其稳定性高(从而延长试纸条保质期)，且具备检测广谱性和高灵敏度，因此非常适合对烟草青枯病菌的快速检测。
所述制备方法还包括抗烟草青枯病菌多克隆抗体的制备，所述抗烟草青枯病菌多克隆抗体采用常规多克隆抗体制备方法获得，其免疫原为烟草青枯病菌，免疫动物可以为兔子，如新西兰大白兔。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述试纸条在烟草青枯病菌检测中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种快速检测烟草青枯病菌的方法，所述方法包括：采用上述试纸条上对待测样品进行检测，分析检测结果。
本发明的又一具体实施方式中，所述检测方法包括：剪取适量植物样品于研磨袋中，将单面研磨袋的磨砂面沿中间对折，样品置于对折曲面中充分研磨，加入样品缓冲液2mL，混匀得到待测样品溶液；塑料滴管吸取待测液，滴入检测条加样端，平放，反应5-10分钟，根据检测线和质控线颜色判定结果。
本发明的又一具体实施方式中，所述的适量植物样品，是指在病健交接处剪取约10mm*10mm大小的样品。
本发明的又一具体实施方式中，所述的待测样品溶液的用量为150μL，检测时间为5-10分钟。
经实验证明，本发明制备得到的试纸条特异性强，检测广谱性强，对云南、贵州、四川、重庆、湖南、湖北、河南、山东等全国主要植烟省份采集的烟草青枯病菌株均能够识别，对其它常见细菌如大肠杆菌、芽孢杆菌、假单胞菌等无交叉反应；试纸条灵敏度可达1×104cfu/mL。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是，下面实施例中使用的烟草青枯病菌RS-10实际在专利CN108624543B中已经公开(即其具体方式实施例1中的烟草青枯病(Ralstonia solanacearum))，该菌种公众可从中国农业科学院烟草研究所获得。
实施例1：抗烟草青枯病菌单克隆抗体的筛选
1、动物免疫
选择烟草青枯病菌RS-10，于LB平板划线，放入28℃培养箱培养24-72h；挑取LB平板中长势较好的烟草青枯病菌单菌落，置于LB液体培养基中，后放入28℃，200r/min摇床培养约10-12h,测菌液OD,若OD值＞1.0，转接；若未，继续培养至＞1.0；转接的培养基放入28℃，200r/min摇床培养继续培养约5-6h，待1.0＜OD＜2.0时，得到菌悬液；菌悬液在4℃，6000rpm/min，10min条件下离心，弃上清；利用0.9％灭菌处理的生理盐水悬浮，4℃条件下，6000rpm/min，10min离心弃上清；重复该步骤一次；用灭菌的0.9％生理盐水悬浮，制备成OD＝1.0的菌悬液；将菌悬液装入预先处理的透析袋中，在2％戊二醛溶液中处理4h，后在0.9％NaCl溶液中透析处理72h，每6h换一次透析液。将透析后的菌悬液分装，1ml一管，-20℃保存。
购买6周龄雌性BALB/C小鼠10只，免疫上述菌悬液。第一次免疫将菌悬液与等量福氏完全佐剂混合乳化，然后小鼠腹腔注射。第二次免疫于首免3周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积菌悬液混合乳化，小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔时间2周，免疫方式及剂量与第二次相同，第四次免疫于第三次免疫2周后进行，方法与剂量与第二次免疫相同，每次免疫剂量为每鼠200μl。第三次面以后，每次免疫1周后，尾部静脉采血，菜用间接ELISA法监测小鼠血清效价。当效价不在上升时，选择效价较高的血清对应的小鼠进行加强免疫，免疫剂量为200μl菌悬液。
2、细胞融合
加强免疫后3天，无菌条件下采集小鼠脾脏，将获得的脾脏细胞悬液转移至50ml灭菌离心管中，定容至35ml，与获得的SP2/0细胞离心，1000rpm，10min。弃去上清，若沉淀中仍有较多脂肪，可重新悬浮洗涤一次。
将SP2/0细胞和脾细胞按照一定的比例，此次实验中是按照1：5的比例混合，离心管定容至35ml，1000rpm，10min，弃去上清；离心管倾斜约45°左右，轻轻且连续敲击超净台台面直至细胞团完全松散，然后将离心管置于超净台内37℃水浴锅温浴；吸取1ml 37℃预热,50％PEG1500，在1min内将1mLPEG完全滴加入细胞团中，前15s匀速加入100μl，15s匀速加入200μl，15s匀速加入300μl，最后15s匀速加入400μl，边加边转动离心管，加完静置一分钟；弯头滴管补加预热的DMEM培养液，目的是为了终止PEG反应，前1min，3s/滴；1min，2s/滴；1min，1s/滴；最后一分钟定容至30ml，加完静置10min；800rpm,8min，弃上清，6mL完培悬起离心管底部细胞，切记不可用力吹打，否则融合细胞易散开，均分至两个50mL离心管，各定容至35mL,用弯头滴管滴加入含有饲养细胞的96孔细胞板中，2滴/孔，封边；37℃，5％C02培养箱培养；24h后，每孔补加两滴37℃预热的HAT培养液；
3、细胞株的筛选
对融合细胞的筛选主要是利用HAT培养基筛选作用，筛选出能够分泌抗体的阳性克隆。在HAT培养基的作用下，只有分泌预定特异性抗体杂交瘤细胞能够生长，而其他的融合细胞无法生长。细胞融合7-8后，取细胞的培养上清作为一抗，采用间接ELISA法进行第一次的检测，10-11天后，进行第二次的检测，若两次检测结果均呈现阳性，则表明该孔有可以分泌抗体的杂交瘤细胞，可进行第二步的单克隆化筛选。若只有一次检测显色，则需要继续监控细胞的生长状况，视情况是否对这些孔进行第三次间接ELISA检测。
经过HAT培养基筛选后，一般阳性细胞孔是能够分泌抗体的细胞，但是这些阳性细胞孔不能保证一个孔内只有一个克隆，要将这些多克隆细胞分开就需要细胞的单克隆化，常用的方法是有限稀释法。
(1)将两次ELISA检测均呈阳性的孔用移液枪吹起悬浮转移至24孔板，记该孔为A孔，原始孔补加HAT培养液，A孔补加2mLHAT培养液，标记B、C、D孔，均加入2mLHAT培养液；
(2)用移液枪将A孔细胞轻轻吹打均匀，吸取200μl加入B孔，C、D、做同样的稀释处理；
(3)3-4天后，贴壁细胞计数，悬浮起约100个杂交瘤细胞，转移至50mL灭菌的离心管中，HAT培养液定容至30mL，均匀铺到96孔板，封边，标记日期和标号，37℃，5％CO2培养箱中培养；
(4)6-9天，出现肉眼可见的克隆细胞即可取细胞上清进行间接ELISA法检测，在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的阳性孔，再次重复上述操作；
(5)重复3-5次，直至阳性率100％。
4、杂交瘤细胞分泌抗体亚型的鉴定
(1)包被：将制备的烟草青枯病菌包被检测原与包被缓冲液按照1：8-10倍稀释，加入到96孔酶标板，100μl/孔，37℃孵育2h；
(2)洗板：用配置好的洗涤液PBST洗涤五-六次，并用吸水纸拍干，减小实验误差；
(3)封闭：配置浓度为1％明胶封闭溶液，200μl/孔，室温震荡1.5h，洗板；
(4)加一抗：阳性杂交瘤细胞的培养上清可作为一抗加入，100μl/孔，室温震荡1h，洗板；
(5)加二抗：将HRP标记的羊抗小鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM用0.15M PBS(pH＝7.4)按照1:500比例稀释，100μl/孔，室温震荡1h，洗板；
(6)配显色液：显色主要是由ABTS溶液、PH＝4的柠檬酸溶液、30％H2O2按照200μl：10mL：10μl的比例配置而成；
其中ABTS是粉末，称取15mg粉末溶解于1.0mL三蒸水即可，4℃避光保存；pH＝4的柠檬酸溶液，称取525mg柠檬酸粉末溶解于50.0mL三蒸水搅拌，调pH＝4；
(7)显色：加入配好的显色液，100μl/孔；抗体在对应的亚型孔会呈现淡绿色或墨绿色，其他孔则无色；
(8)测定吸光度：用酶标仪测定在波长为450nm条件下各孔的吸光值大小。
实施例2：抗烟草青枯病菌单克隆抗体可变区序列测定
1.阳性单克隆杂交瘤细胞株总RNA提取
使用天根总RNA提取试剂盒进行实验，待细胞培养瓶中的单克隆细胞生长至对数期后，弃培养液，加入1×PBS清洗一次，再加入PBS吹打并收集细胞悬浮液；将细胞悬浮液8000rpm，5min离心、弃上清。根据细胞数量，104-106个细胞可加入250μl RNA-easy进行消化、裂解。枪尖反复吹打混匀至无颗粒样存在；加入2/5RNA-easy体积的RNase-free ddH2O，剧烈震荡15s，室温静置5min；12000rpm，15min离心，将上清液转移至干净离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置1h；12000rpm，10min离心，通常可见白色胶状沉淀，弃上清，保留沉淀；加入500μl的75％乙醇(使用RNase-free ddH2O配制)，上下颠倒数次，充分洗涤，使沉淀悬浮；8000rpm，3min离心，重复上一步骤，将上清弃干净；加入70μl RNase-free ddH2O溶解沉淀，枪尖反复吹打混匀将悬浮液转移至干净离心管中获得RNA溶液；将得到的RNA溶液用Nano Drop TM2000分光光度计测定A280值，检测RNA的纯度和浓度，保存至-20℃备用。
2.总RNA鉴定
准备样品：取1μg RNA用RNase-free ddH2O稀释至8μl于PCR管中，再加入1μl RNALoading Buffer，混匀；准备电泳槽：将核酸胶电泳槽用自来水冲洗干净，用1×TAE溶液润洗2-3次，倒入1×TAE电泳缓冲液；点样跑胶：取出凝胶放入电泳槽，缓冲液液面完全淹没凝胶，用移液器将样品加入上样孔，设置参数150V，12min；分析结果：跑胶结束后，关掉电源，取出凝胶，曝光拍照。
3.RNA逆转录cDNA
使用TaKaRa逆转录试剂盒进行实验。去除基因组DNA：以获得的RNA为模板4μl、RNase-free ddH2O 8μl、4×gDNA wiper Mix 4μl配制成混合液于PCR管中，42℃水浴、2min；逆转录反应体系PCR扩增：在水浴后的混合液中加入4μl 5×HiScriptⅢqRTSuperMix并混匀。设置程序37℃、15min，85℃、5sec进行扩增；获得扩增产物c DNA，检测浓度，作为下一步PCR扩增测序的模板，分装保存至-20℃。
利用PCR克隆可变区基因，并送至公司进行测序，获得可变区序列。
实施例3：抗烟草青枯病菌多克隆抗体制备
利用实施例1中的免疫原，免疫新西兰大白兔，6月龄以上，2.5kg左右，每次免疫免疫原用量在200μl。乳化后，对大白兔进行背颈部多点皮下注射免疫。
初免与二免间隔2周，其余两次免疫之间间隔3-4周，三免之后1周测血清效价。根据血清效价结果，5免后采集大白兔全血，并制备血清，获得抗烟草青枯病菌多克隆抗体，命名为抗烟草青枯病菌多克隆抗体0334。
实施例4：筛选单克隆抗体的特性对比
经实施例1的方法，筛选到抗烟草青枯病菌单克隆抗体10株，其中3株亚型为IgM，7株为IgG2b。经与抗烟草青枯病菌多克隆抗体0334配对后，其中2株IgM和5株IgG2b单克隆抗体可配对为夹心式免疫检测试纸条方法。
1、稳定性测试
将上述可配对7株单克隆抗体与0334组合为用于检测烟草青枯病菌夹心式免疫检测试纸条，对试纸条进行真空、干燥、室温下保存，待7天、14天、30天、60天后进行稳定性测试。发现IgM抗体配对的试纸条在14天后出现了不同程度的显色下降；由IgG2b抗体配对的试纸条60天后仍然保持稳定的显色效果。该现象预计是由于相对于IgM抗体而言，IgG2b抗体稳定性更高；且IgM抗体分子量大，更不易操作等原因造成。
2、检测广谱性测试
对通过稳定性测试的5种夹心式免疫检测试纸条对从全国各地采集的烟草青枯病菌进行检测广谱性测试。共采集来自全国各地的15个青枯病菌进行检测，发现单克隆抗体3H3(其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)与0334配对的试纸条可对15株病菌全部识别。其余4种试纸条不能全部识别。3H3与0334配对的试纸条对烟草青枯病菌广谱性测试相关内容见实施例5。
实施例5:烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条广谱性测试
1、利用基因分子技术(PCR)对供试菌株鉴定
从全国各地的有疑似症状的作物上采集到供测菌株共90株，选用青枯菌特异性检测引物Rsol_fliC(Rsol_fliC-F:5’-GAACGCCAACGGTGCGAACT-3’,SEQ ID NO.3；Rsol_fliC-R:5’-GGCGGCCTTCAGGGAGGTC-3’,SEQ ID NO.4)对90株菌进行PCR扩增。25μL的PCR体系中包含5×PCR缓冲液5.0μL，DNA模板(100ngμL-1)1.0μL，dNTPs(10mM)0.75μL，正向引物(10μM)0.75μL，反向引物(10μM)0.75μL，MgCl2(25mM)2.5μL，Taq DNA聚合酶(5UμL-1Promega)0.25μL，其余部分ddH2O补齐，以标准烟草青枯菌株为模板作为阳性对照。
PCR反应条件：在PCR仪中，95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸30s，30个循环，保温72℃10min,保存4℃。
将扩增产物在1％琼脂糖凝胶(1×TAE Buffer)中电泳15min(电压220V)，取出凝胶放进数字图象分析仪分析(结果见表1)。
2、烟草青枯菌株快速免疫检测试纸条对供试菌株的测定
取供测菌株90株，在NA平板培养基上划线后，置于28℃恒温培养箱培养。待培养1-3天长出菌落后，挑取单菌落接种于NA培养基中，置于摇床(28℃，200转/分钟)培养。待菌体生长至OD为0.3时，取培养好的菌液4℃、6000r/min离心5min，用试纸条层析液离心洗涤两次后悬起，配制成108cfu/mL的菌悬液，待用。
取150μl菌悬液滴入烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条的样品垫，待层析5-10分钟后，利用如下依据进行结果判定，判定结果见表1。
(1)质控线(C)显色，检测线(T)出现红色条带为阳性；
(2)C线显色，T线不出现红色条带为阴性；
(3)若C线不显色或只有T线显色,说明不正确的操作过程或试纸条失效。
表1烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条特异性测试汇总表
Figure BDA0003022727450000131
实施例6:烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条对田间样品的测试
田间采样及处理
田间采集烟草疑似症状的发病组织，撕取约10mm×10mm的样本(病健交界处)置于单面磨砂研磨袋中，将研磨袋的磨砂面沿中间对折，样品置于对折曲面中充分研磨，加入样品缓冲液2mL,混匀待测。
利用塑料滴管吸取100-200μL待测液，滴入试纸条的样品区，反应5-10分钟，根据如下规则判定结果。
(1)质控线(C)显色，检测线(T)出现红色条带为阳性；
(2)C线显色，T线不出现红色条带为阴性；
(3)若C线不显色或只有T线显色，说明不正确的操作过程或试纸条失效。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院烟草研究所
<120> 一种烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条及其制备方法和应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Leu Pro Phe Tyr Phe Ser Ala Trp Ser Gln His Arg Thr Phe Glu Glu
1 5 10 15
Cys Tyr Asn Val Ala Asp Arg Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln Pro Ala
20 25 30
His Cys Asn Trp Leu Glu Glu Asn Leu Ser Gln Ile His Cys Leu Gln
35 40 45
Ser Asp Gln Gly Pro Gln Ile Pro Asn Trp Met Gln
50 55 60
<210> 2
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ser Ile Pro Glu Val Asn Glu Thr Val Leu Val Ser Ala Gly Thr Arg
1 5 10 15
Pro Asn Ser Ser Phe Asp Cys Tyr Tyr Leu Lys Gly Ser Asp Trp Thr
20 25 30
Cys Ser Ser Asn Asn Pro Ser Val Leu Leu Thr Asn Pro Gly Arg Met
35 40 45
Glu Thr Gly Glu Leu Gln Cys Gln
50 55
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaacgccaac ggtgcgaact 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggcggccttc agggaggtc 19

Claims (10)

1.一种烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条，其特征在于，所述试纸条包含抗烟草青枯病菌单克隆抗体，其中，所述抗烟草青枯病菌单克隆抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条包括：底板，所述底板上依次设置有吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接。
3.如权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置质控线和检测线，所述检测线上包被有抗烟草青枯病菌多克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗小鼠IgG；
所述金标垫上喷涂有纳米金标记的抗烟草青枯病菌单克隆抗体。
4.如权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述吸水垫长度控制为15-20mm，宽度控制为3-5mm；检测垫长度控制为20-25mm，宽度控制为3-5mm；金标垫长度控制为3-7mm，宽度控制为3-5mm；样品垫长度控制为20-25mm，宽度控制为3-5mm，相邻各垫的交叠长度控制为3-6mm；或，
所述检测垫上的质控线与检测线的间距控制为3-6mm，检测线与硝酸纤维素膜上沿之间的间距为13-18mm。
5.如权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述金标垫中所用的纳米金粒径控制为30-50nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗烟草青枯病菌单克隆抗体的用量为80-120ng；检测垫检测线上每厘米喷涂长度所需的抗烟草青枯病菌多克隆抗体的用量为80-120ng。
6.权利要求1-5任一项所述烟草青枯病菌快速免疫检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将抗烟草青枯病菌单克隆抗体加入到纳米金中，获得纳米金标记的抗烟草青枯病菌单克隆抗体，并喷涂至金标垫上。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：在底板上按顺序粘贴上吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，组装形成试纸条。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置质控线和检测线，所述检测线上包被有抗烟草青枯病菌多克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗小鼠IgG。
9.权利要求1-5任一项所述试纸条在烟草青枯病菌检测中的应用。
10.一种快速检测烟草青枯病菌的方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求1-5任一项所述试纸条对待测样品进行检测，分析检测结果。
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