CN107449912A - 抗h7n9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗原表位及其筛选方法和应用 - Google Patents

抗h7n9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗原表位及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗原表位及其筛选方法和应用，属于免疫检测技术领域。所述筛选方法是将野生型H7N9亚型禽流感病毒液与具有中和特性的相应单克隆抗体混合孵育，接种至SPF鸡胚，得到血凝效价为阳性的尿囊液；将所述阳性尿囊液进行梯度稀释，再次与单克隆抗体混合孵育接种至SPF鸡胚中，选择血凝效价为阳性的尿囊液为抗原测定单克隆抗体的血凝抑制效价，当所述尿囊液测定的血凝抑制效价比野生型病毒测定的血凝抑制效价低8log2时，判定为H7N9亚型禽流感病毒突变逃逸株，测定其HA基因序列，确定单克隆抗体所识别的抗原表位。所述方法明确筛选出针对特定抗原表位，方法简单准确，筛选周期短。

Description

抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗原表位及其筛选方法和 应用
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆 抗体抗原表位及其筛选方法和应用。
背景技术
H7N9亚型禽流感病毒是甲型流感中的一种。要想有效预防H7N9亚型禽流 感就必须建立有效的检测手段，以单克隆抗体为基础的抗原捕获ELISA、免疫 胶体金试纸条等是常用的方法。而建立这类检测方法，需要多个针对不同抗 原表位的单克隆抗体，才能获得敏感性和特异性均很高的检测方法。
目前，确定抗原表位的方法主要为竞争抑制ELISA方法。竞争抑制ELISA 法的筛选机理如下：如果标记抗体与未标记抗体识别同一表位，其中一个单 克隆抗体的结合会影响另外一个单克隆抗体的结合，在反应体系中加入未标 记抗体将会抑制酶标记的抗体与包被抗原的结合。在这种情况下，加入未标 记单克隆抗体，读值(OD450/630值)出现逐渐下降的趋势；如果标记抗体与 未标记抗体识别不同表位，未标记抗体不能抑制酶标记抗体与包被抗原的结 合，加入未标记单克隆抗体，读值(OD450/630值)会保持不变。且根据酶 标仪上读取OD450/630数值计算阻断率(阻断率＝1-阻断孔OD450/630值/对照 孔OD450/630值)。结果判断为饱和孔阻断率大于50％为阻断阳性。但是当结 果判断为单克隆抗体之间存在相互竞争时，有可能存在以下因素：(1)两抗 体识别同一抗原表位；(2)两抗体识别的表位接近，前一个抗体与抗原结合 后，阻碍了后一个抗体与抗原的结合；(3)两个抗体识别的表位虽有一定的 距离，但其空间构象位置相近，当前一个抗体与抗原结合后形成了一定的空 间位阻影响后一个抗体的结合。所以采用竞争性抑制ELISA方法来分析单克 隆抗体识别的抗原表位时，阳性结果只能表明是以上几种可能性，并不能将 单克隆抗体所针对的抗原表精确的定位到特定的抗原表位。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供针对不同抗原表位的抗H7N9亚型禽流 感病毒单克隆抗体的筛选方法和应用。本发明提供的筛选方法能够精确定位 到特定的抗原表位，同时筛选得到的单克隆抗体所针对的抗原表位明确，有 利于监测特定抗原表位的H7N9亚型禽流感病毒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了针对特定抗原表位的抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体 的筛选方法，包括以下步骤：
1)野生型H7N9亚型禽流感病毒液与具有中和特性的单克隆抗体腹水等 体积混合，20～28℃孵育1h，得到病毒抗体混合液，所述单克隆抗体由灭活的 野生型病毒株免疫动物通过杂交瘤技术得到；
2)将所述步骤1)得到的病毒抗体混合液接种至SPF鸡胚，将接种后的 SPF鸡胚在35℃条件下培养72h，得到尿囊液；
3)测定所述步骤2)得到尿囊液的血凝效价；
4)将所述步骤3)中测定结果为阳性的尿囊液进行梯度稀释，将稀释后 的尿囊液分别与0.5ml单克隆抗体腹水等体积混合，20～28℃孵育1h，孵育后 的梯度稀释病毒抗体混合液分别接种至SPF鸡胚；
5)测定所述步骤4)中接种72h得到尿囊液的血凝效价，选择最大稀释 度病毒抗体混合液接种鸡胚所获得的阳性尿囊液为抗原，测定单克隆抗体血 凝抑制效价，当所述尿囊液测定的血凝抑制效价比野生型病毒测定的血凝抑 制效价低8log2时，判定该阳性尿囊液为单克隆抗体的逃逸株；
6)将所述步骤5)得到的单克隆抗体的逃逸株接种至SPF鸡胚培养，获 得鸡胚尿囊液；
7)以所述步骤6)得到的尿囊液为样品，利用RT-PCR法扩增HA基因， 对得到的PCR产物进行测序，将所述测序得到的HA基因序列翻译成氨基酸 序列与野生型H7N9禽流感病毒的HA基因进行比对，氨基酸差异位点即为单 克隆抗体所针对的抗原表位，鉴定出针对特定抗原表位的抗H7N9亚型禽流 感病毒单克隆抗体。
优选的，所述步骤2)、步骤4)或步骤6)中接种的接种量为每个SPF 鸡胚接种0.1ml。
优选的，所述步骤7)中扩增HA基因用引物包括正向引物和反向引物； 所述正向引物具有如序列表中Seq ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向引物 具有如序列表中Seq IDNo.2所示的核苷酸序列。
优选的，所述RT-PCR法的反应程序为预变性95℃3min；变性95℃ 15s，退火58℃15s，延伸72℃1min40s，共35个循环；延伸72℃5min。
优选的，所述步骤1)中传代后的H7N9亚型禽流感病毒液与单克隆抗体 腹水混合前预先稀释；所述稀释用溶液为PBS溶液；
所述PBS溶液的浓度为0.01mol/L；
所述PBS溶液的pH值为7.4。
优选的，所述步骤1)中传代后的H7N9亚型禽流感病毒液的病毒浓度为 106EID50/0.5ml。
优选的，所述步骤2)、步骤4)和步骤6)中SPF鸡胚为10日龄鸡胚。
优选的，所述步骤4)中梯度稀释包含四个梯度，分别为稀释后的选择的 稀释浓度为10-5、10-6、10-7和10-84个梯度浓度。
本发明提供了所述方法筛选得到的H7N9亚型禽流感病毒的特定抗原表 位，所述抗原表位由HA基因中第214位氨基酸G和235位氨基酸L组成，或HA 基因中第136位氨基酸S和227位氨基酸G组成。
本发明还提供了具有所述方法筛选得到的抗原表位的或者所述抗原表位 的单克隆抗体在免疫检测试剂中的应用。
本发明提供了针对特定抗原表位的抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体 的筛选方法，野生型H7N9亚型禽流感病毒液与具有中和特性的单克隆抗体 混合孵育，单克隆抗体所针对病毒抗原表位发生突变后，单克隆抗体不能中 和H7N9亚型禽流感病毒，因此接种至SPF鸡胚中的突变H7N9亚型禽流感 病毒能够不断繁殖，经过血凝试验测定，得到含有突变病毒的阳性尿囊液。 将所述阳性尿囊液进行梯度稀释，再次与单克隆抗体腹水混合孵育，防止因 单克隆抗体不足以中和未突变病毒造成假阳性结果；选择最大稀释度病毒抗 体混合液接种鸡胚所获得的阳性尿囊液为待检样品，与单克隆抗体进行血凝 抑制试验，筛选出血凝抑制效价比野生型病毒低8log2的突变逃逸株，所述 逃逸株为所述单克隆抗体针对的抗原表位发生了突变，通过进一步扩增筛选 出的逃逸株的HA基因，同时与野生型病毒的HA基因进行比对，得到所述单 克隆抗体针对的抗原表位的突变位点，从而鉴定出特定抗原表位的单克隆抗 体。所述方法能够明确筛选出针对特定抗原表位的单克隆抗体，方法简单，筛选周期短，能够准确、快速鉴定针对不同抗原表位的抗H7N9亚型禽流感 病毒单克隆抗体。
本发明还提供了上述技术方案筛选得到的单克隆抗体或者所述的单克隆 抗体在免疫检测中的应用。所述应用具有较高的敏感性，同时能够检测特定 抗原表位的病毒株。
附图说明
图1为实施例4纯化后的抗体SDS-PAGE结果；
图2为实施例4胶体金试纸条特异性检测；
图3为实施例4胶体金试纸条灵敏性检测；
图4为实施例4胶体金试纸条广谱性检测；
图5为实施例4胶体金试纸条喉拭子检测；
图6为实施例4胶体金试纸条泄殖腔拭子检测；
图7为实施例4胶体金试纸条组织样品检测。
具体实施方式
本发明提供了针对特定抗原表位的抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体 的筛选方法，包括以下步骤：
1)将野生型H7N9亚型禽流感病毒液与具有中和特性的单克隆抗体腹水 等体积混合，20～28℃孵育1h，得到病毒抗体混合液，所述单克隆抗体由野生 型病毒株免疫动物通过杂交瘤技术得到；
2)将所述步骤1)得到的病毒抗体混合液接种至SPF鸡胚，将接种后的 SPF鸡胚在35℃条件下培养72h，得到尿囊液；
3)测定所述步骤2)得到尿囊液的血凝效价；
4)将所述步骤3)中测定结果为阳性的尿囊液进行梯度稀释，将稀释后 的尿囊液分别与0.5ml单克隆抗体腹水等体积混合，20～28℃孵育1h，孵育后 的梯度稀释病毒抗体混合液分别接种至SPF鸡胚；
5)测定所述步骤4)中接种72h得到尿囊液的血凝效价，选择最大稀释 度病毒抗体混合液接种鸡胚所获得的阳性尿囊液为抗原，测定单克隆抗体测 定血凝抑制效价，当所述尿囊液测定的血凝抑制效价比野生型病毒测定的血 凝抑制效价低8log2时，判定该阳性尿囊液为单克隆抗体的逃逸株；
6)将所述步骤5)得到的单克隆抗体的逃逸株接种至SPF鸡胚培养，获 得鸡胚尿囊液；
7)以所述步骤6)得到的尿囊液为样品，利用RT-PCR法扩增HA基因， 对得到的PCR产物进行测序，将所述测序得到的HA基因序列翻译成氨基酸 序列与野生型病毒的HA基因进行比对，氨基酸差异位点即为单克隆抗体所 针对的抗原表位，鉴定出针对特定抗原表位的抗H7N9亚型禽流感病毒单克 隆抗体。
本发明将野生型H7N9亚型禽流感病毒液与用灭活的野生型病毒株免疫 动物通过杂交瘤技术产生的具有中和特性的单克隆抗体等体积混合，20～28℃ 孵育1h，得到病毒抗体混合液。
本发明中，病毒抗体混合液中部分病毒发生突变，通过接种至SPF鸡胚 中培养将突变病毒筛选出来。本发明对所述野生型病毒的种类没有任何限制， 可以为任一H7N9亚型禽流感病毒分离株，采用本领域技术人员所熟知病毒 分离方法即可获得。
本发明中，所述野生型H7N9亚型禽流感病毒液的病毒浓度为106 EID50/0.5ml。
本发明中，经一次中和后所获得H7N9亚型禽流感病毒尿囊液稀释后再 与单克隆抗体腹水混合。在本发明中，所述稀释用溶液优选为PBS溶液。所 述PBS溶液的浓度为0.01mol/L；所述PBS溶液的pH值为7.4。本发明对所 述稀释的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的病毒稀释方法即 可。
本发明中，所述用灭活病毒株免疫动物通过杂交瘤技术产生的单克隆抗 体没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的制备单克隆抗体的方法即可。
本发明中，所述混合的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知 的混合方法即可。
本发明中，所述孵育的温度优选为22～26℃，更优选为25℃。本发明对 所述孵育的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的对抗原抗体的 孵育方法即可。本发明中，所述孵育的过程能够使未突变的病毒被单克隆抗 体所中和，失去繁殖能力，在SPF鸡胚中无法繁殖；同时发生突变的病毒与 不能被单克隆抗体中和，突变的病毒可具有繁殖力。
病毒抗体孵育后，本发明将所述病毒抗体混合液接种至SPF鸡胚，将接 种后的SPF鸡胚在35℃条件下培养72h，得到尿囊液。
本发明中，所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知 的接种方法即可。所述接种的接种量为每个SPF鸡胚接种0.1ml。所述SPF 鸡胚为10日龄鸡胚。本发明对所述SPF鸡胚的来源没有特殊限制，采用本领 域技术人员所熟知的SPF鸡胚即可。
本发明中，所述SPF鸡胚的培养方法没有特殊限制，采用本领域技术人 员熟知的SPF鸡胚培养的技术方案即可。
得到培养的SPF鸡胚后，本发明收集所述SPF鸡胚的尿囊液，测定尿囊 液的血凝效价，收集血凝效价为阳性的尿囊液。本发明中，所述收集所述SPF 鸡胚的尿囊液的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的收集方法 即可。
本发明对所述血凝效价的测定方法没有特殊限制，采用本领域技术人员 所熟知的血凝试验即可。本发明中，所述血凝效价为阳性的尿囊液的判断标 准是：取红细胞完全不挂线的最低稀释度为血凝效价阳性的尿囊液。所述测 定尿囊液的血凝效价能够从鸡胚接种过程中筛选出未被单克隆抗体中和的抗 原表位发生变异的病毒，舍去野生型病毒。
得到的血凝效价为阳性的尿囊液后，本发明将所述血凝效价为阳性的尿 囊液进行梯度稀释，将稀释后的尿囊液分别与0.5ml单克隆抗体腹水等体积混 合，20～28℃孵育1h，孵育后的病毒抗体混合液分别接种至SPF鸡胚，培养 72h后收集尿囊液。
本发明对所述稀释的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的 稀释方法即可。所述稀释用溶液为PBS溶液；所述PBS溶液的浓度为0.01mol/L； 所述PBS溶液的pH值为7.4。所述梯度稀释时选择的稀释浓度优选为10-5、10-6、 10-7和10-84个梯度浓度。所述梯度稀释能够降低单位体积内的病毒数量，防止 因病毒浓度过高而单克隆抗体中和能力不足，使上步骤中未成功舍去的未突 变的病毒进入下一步骤，导致假阳性结果。
本发明对所述混合的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的 混合方法即可。本发明对所述孵育的方法没有特殊限制，采用本领域技术人 员所熟知的孵育方法即可。
本发明对所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的 接种方法即可。所述接种的接种量优选为每个SPF鸡胚接种0.1ml。所述SPF鸡 胚为10日龄鸡胚。
得到尿囊液中，本发明测定所述尿囊液的血凝效价，选择最大稀释度病 毒抗体混合液接种鸡胚所获得的阳性尿囊液为抗原，测定单克隆抗体测定血 凝抑制效价，当所述尿囊液测定的血凝抑制效价比野生型病毒测定的血凝抑 制效价低8log2时，判定该阳性尿囊液为单克隆抗体的逃逸株。逃逸株的标 准定义为血凝抑制降低8log2以利于鉴定出特定的抗原表位。
本发明中，所述血凝效价测试与上述技术方案一致。
本发明中，所述血凝抑制试验的方法没有特殊限制，采用本领域技术人 员所熟知的血凝抑制试验即可。血凝抑制效价的判断标准如下：挂线说明单 克隆抗体和病毒充分反应，表示为阳性。读数到完全挂线的血清稀释度为该 单克隆抗体针对该病毒的血凝抑制价，即HI效价，效价为4以上记为有效。 病毒阳性对照孔为不挂线，PBS阴性对照孔为挂线。
得到单克隆抗体的逃逸株后，本发明所述单克隆抗体的逃逸株接种至SPF 鸡胚培养，获得鸡胚尿囊液。
所述培养的温度为35℃。所述培养的时间为72h。
得到尿囊液后，本发明以所述尿囊液为样品，利用RT-PCR法扩增HA基 因，得到的PCR产物进行测序，测序得到的HA基因序列翻译成氨基酸序列 与所述步骤1)中野生型病毒的HA基因进行比对，氨基酸差异位点即为单克 隆抗体所针对的抗原表位。
本发明中，所述扩增HA基因用引物优选包括正向引物和反向引物；所 述正向引物优选具有如序列表中Seq ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向引 物优选具有如序列表中Seq ID No.2所示的核苷酸序列。
所述RT-PCR法的反应程序优选为预变性95℃3min；变性95℃15s， 退火58℃15s，延伸72℃1min40s，共35个循环；最后延伸72℃5min。 所述RT-PCR法的反应体系优选为：25μL RT-PCR反应体系：8.5μL ddH2O，12.5μL 2×Phanta Max Buffer，0.5μL dNTP Mix(10mM)，2μL模板cDNA，上 游引物(10μM)和下游引物(10μM)各1μL，0.5μLPhanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 1U/μL。
本发明中，所述测序的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知 的测序方法即可。本发明实施例中，所述测序委托华大基因公司完成。
本发明中，所述翻译的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知 的三个碱基转换成一个氨基酸的方法即可。
本发明中，所述比对的方法都没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟 知的比对软件完成即可。本发明中，所述比对采用MegAlign软件完成。
氨基酸差异的位点是所述接种至鸡胚后的病毒株的突变位点，根据氨基 酸突变的位点指示单克隆抗体针对的抗原表位，因此，得到突变位点后能够 得到单克隆抗体所针对的特定抗原表位。
本发明还提供了所述技术方案筛选得到的H7N9亚型禽流感病毒的特定 抗原表位，所述抗原表位由HA基因中第214位氨基酸G和235位氨基酸L 组成，或HA基因中第136位氨基酸S和227位氨基酸G组成。
本发明还提供了具有上述技术方案筛选得到的抗原表位的或者所述抗原 表位的单克隆抗体在免疫检测试剂中的应用。所述免疫检测试剂包括免疫层 析试纸条和ELISA检测试剂盒。
本发明对所述免疫检测试剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术 人员所熟知的制备方法即可，与现有技术的区别是采用抗体逃逸筛选得到的 针对不同抗原表位的抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体替换常规方法筛选 得到的单克隆抗体即可。
下面结合实施例对本发明提供的抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗 原表位及其筛选方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发 明保护范围的限定。
实施例1
1方法
1.1H7N9亚型禽流感单克隆抗体的制备
1.1.1抗原的制备
1.1.1.1病毒的扩增和灭活
将A/CHICKEN/JIANGSU/W1-8/2015(H7N9亚型禽流感病毒，由扬州大 学农业部畜禽传染病学重点开放实验室从活禽交易市场鸡的棉拭样品中分离 得到)无菌PBS进行10-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，稀释后的病毒液0.2 mL经尿囊腔接种鸡胚，35℃孵育，弃去24h内死亡鸡胚，接种24h后死亡 的鸡胚放入4℃过夜。收集尿囊液，缓慢滴加福尔马林，终浓度为0.1％，4℃ 放置，90rpm，24h进行震荡灭活，最后收集灭活好的病毒液进行纯化。
1.1.1.2抗原的纯化
灭活后的尿囊液经4℃6000rpm离心30min，取上清，弃去沉淀，4℃ 20000rpm离心2h，弃去上清，用3～4mL PBS悬浮乳白色沉淀，在50mL 离心管底部加入5mL 20％蔗糖垫底，沿管壁缓缓加入混匀的沉淀，4℃20000 rpm离心2h，慢慢取出离心管。弃去上清，用3～4mLPBS悬浮乳白色沉淀。 以4℃20000rpm离心2h去除蔗糖，沉淀以少量PBS进行溶解，测定血凝 效价和浓度，-70℃保存备用。
1.1.2动物免疫
取适量的纯化病毒(100μg左右)与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化， 经皮下注射6周龄雌性BALB/c小鼠，分多点注射；2周后、4周后以相同方 法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再免疫一次；5周后采血测效价，如果效价 较高，则6周后取相同剂量抗原(不加佐剂)进行尾静脉加强免疫，3天后 准备融合。
1.1.3融合
1.1.3.1饲养细胞的制备
融合前一天晚上制备饲养细胞：取一只成熟健康ICR小鼠，摘眼球采血 作为阴性血清，脱颈椎处死；放入70％酒精里消毒10min，固定后，无菌打 开腹腔，暴露腹膜，用20mL注射器，16号针头，吸取15mL HAT培养基 注射到腹腔，注意不要戳到血管和组织，用镊子手持酒精棉球轻轻按摩小鼠 腹部，反复抽吸腹腔内液体，可见注射器里培养基慢慢变黄，最后抽出液体， 注入己准备好的装有HAT培养基的盐水瓶中，并置于冰水中降温。将含有饲养细胞的培养基分装至96孔细胞培养板中，每孔一滴，约含有2×104细胞， 加完饲养细胞后放置于细胞培养箱中。
1.1.3.2脾细胞的准备
BALB/c小鼠加强免疫3d后，进行小鼠摘眼球采血，作为阳性血清，脱 颈椎处死，用75％酒精体表消毒10min，四肢固定在解剖台上；无菌打开腹 腔取出脾脏，用DMEM培养基洗涤脾脏，用镊子小心去除其周围结缔组织； 随后将脾脏转移到另一个含5mL DMEM培养基的平皿中。用研磨棒挤压研 磨，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液并进行细胞计数。
1.1.3.3SP2/0细胞的准备
选择处于对数生长期的SP2/0细胞，待其长至75％时弃上清，用DMEM 清洗一次后，再用10mL DMEM培养基将SP2/0细胞从瓶壁上轻轻吹下并进 行细胞计数。
1.1.3.4细胞融合
将制备好的脾细胞和骨髓瘤细胞按照5:1到10:1的比例在融合管中混匀，1000rpm4℃离心10min，弃去上清，并尽量吸干净，手掌轻轻摩擦管底，使 沉淀细胞充分混匀；37℃水浴中60s内缓慢加入1mL预热的PEG1500，边 加边摇匀；随后在90s内滴加30mL 37℃预热的DMEM，先慢后快，37℃ 水浴静置10min，然后1000rpm4℃离心10min；弃上清，用30mL HAT培 养基慢慢悬浮细胞，将其分装于前一天晚上做好的饲养细胞的96孔板中；96孔板置于37℃5％CO2培养箱内培养；融合后5d后用HAT培养基换出一半 液体；10d后全部换成HT培养基；待96孔板底部出现白色细胞团块或者细 胞生长至孔底1/10时，吸取上清做抗体检测。
1.1.4阳性克隆的筛选
用HI试验检测杂交瘤细胞的上清，每孔检测三次，依据血凝抑制实验结 果，最终确定阳性孔。
1.1.5杂交瘤细胞的亚克隆
利用HI试验，选取HI价较高的杂交瘤细胞孔，采用有限稀释法对其进 行三次亚克隆。首先按照1.4.1的方法制备饲养细胞，分装到96孔细胞培养 板的2～12列，每孔100μL，其中第一列不放饲养细胞；用HT培养基将阳 性孔中的杂交瘤细胞吹下，吸取HT加入96孔细胞培养板的第一列第一孔内， 将细胞在第一列从上至下进行倍比稀释；约5min后，在显微镜下观察计数， 选取大约含有100个细胞的孔，吹匀孔里的细胞，加入含有6mLHT的离心 管中，轻轻吹匀离心管中的细胞悬液，加入96孔细胞培养板的第2-4列，0.1 mL/孔；继续加HT将细胞悬液补至6mL，混匀后将其加入96孔细胞培养板 的5-8列，0.1mL/孔；加HT将细胞悬液补至4mL，混匀后将其加入96孔细 胞培养板的9-12列，0.1mL/孔，将其放入37℃5％CO2培养箱培养，从第5 天开始观察96孔板并记录有一个杂交瘤细胞团块的孔，然后换出一半的培 养基；待上清变黄后或细胞长满孔底1/10开始检测，检测方法同2.5；以这样 的方法连续进行3-4次亚克隆，直到每个克隆孔上清均为阳性时可以定株。
1.1.6单克隆抗体腹水的制备
取经产的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌液体石蜡0.5mL/只；1 周后，将处于对数生长期并记数1×106个杂交瘤细胞注射入老鼠腹腔；待小 鼠腹部凸起明显时，采集腹水，1500rpm离心10min，去除油脂，取上清， -70℃保存备用。
1.1.7亚类鉴定
按照单克隆抗体亚类试剂盒说明书中介绍得方法进行。具体如下：取 ELISA酶标板分别加入1:1000稀释的单克隆抗体腹水，每孔100μL，37℃孵 育1h，PBST洗涤3次，每次5min；分别加入工作浓度羊抗鼠IgG2a、IgG1、 IgG2b、IgG3、IgM、IgA亚类血清，每孔100μL，37℃孵育30min，PBST 洗涤3次，每次5min；加入1:8000稀释的兔抗羊辣根过氧化物酶结合物100 μL/孔，37℃孵育15min，PBST洗涤3次，每次5min；加TMB显色液100μL/ 孔，37℃避光显色10min；用2M H2SO450μL/孔终止；在450nm波长下测 定OD值。以OD450值最高的孔所加的亚类为单克隆抗体亚类。
实施例2
(1)用浓度为0.01M，PH＝7.4的PBS将野生型H7N9亚型禽流感病毒 (A/CHICKEN/JIANGSU/W1-8/2015)稀释到106EID50/0.5ml，再取0.5ml 单克隆抗体腹水与稀释好的病毒尿囊液等量混合，与室温作用1h。
(2)取上述病毒和抗体混合液接种4个10日龄的SPF鸡胚，每个鸡胚 接种0.1ml，35℃条件下培养72h。
(3)72h后收取尿囊液，并测其HA效价，具体方法如下：
Ⅰ.在96孔血凝板中每孔加入25μl PBS。
Ⅱ.在96孔血凝板的第一列孔中加入25μl病毒，从左至右倍比稀释至第 11孔，弃掉25μl。第12孔为阴性对照。
Ⅲ.每孔补加25μl PBS。
Ⅳ.在每孔中均加入25μl 1％红细胞，每孔中最后液体体积为75μl，轻轻 震荡血凝板使孔内液体混匀，将血凝板放置室温(20℃)40min。
Ⅴ.放置规定时间后，将V形血凝板倾斜，使阴性对照孔红细胞挂线。然 后观察其它实验孔，取红细胞完全不挂线的稀释度为该病毒的HA效价。
(4)将HA效价阳性的尿囊液用PBS进行10倍梯度稀释，选择10-5、 10-6、10-7和10-84个梯度，再取0.5ml单克隆抗体腹水与稀释好的病毒尿囊液 等量混合，与室温作用1h，每个梯度接种4个10日龄的SPF鸡胚，0.1ml/ 个，72h后收取尿囊液。
(5)按照上述方法测定尿囊液的HA效价。选择上述过程中最大稀释度 所获得的HA效价为阳性的尿囊液，与相应的单克隆抗体进行HI试验，具体 步骤如下：
①在做血凝抑制前先做血凝实验，确定当时待测病毒的HA效价。
②在96孔血凝板每孔中均加入25μlPBS。
③在96孔血凝板的第一列孔中加入25μl阳性血清，从左至右倍比稀释 至第10孔，弃掉25μl。第11孔为病毒阳性对照，第12孔为PBS阴性对照。
④在96孔血凝板的前11列孔中加入现配的4单位病毒，轻轻震荡混匀， 将血凝板放置室温(20℃)40min，或4℃环境60min，使血清和抗原充分反 应。
⑤之后每孔加入25μl 1％的鸡红细胞，震荡混匀放置在室温(20℃)40 min。
⑥将血凝板倾斜，观察红细胞挂线情况。挂线说明血清和病毒充分反应， 表示为阳性。读数到完全挂线的血清稀释度为该血清针对该病毒的血凝抑制 价，即HI效价，效价为4以上记为有效。第11孔病毒阳性对照不挂线，第 12孔PBS阴性对照挂线。
当阳性尿囊液比野生型病毒测定单克隆抗体HI效价低8log2时，判定为 该阳性尿囊液为单克隆抗体的逃逸株。
(6)将所获得的抗体逃逸株经过鸡胚扩增，获得鸡胚尿囊液；采用引 物:5’-AGCAAAAGCAGGGGATACAAAATGA-3’和5’ -GCACCGCATGTTTCCATT CTTTAC-3’经RT-PCR方法扩增HA基因全长， 所述扩增体系为：25μLRT-PCR反应体系：8.5μL dd H2O，12.5μL 2×PhantaMaxBuffer，0.5μLdNTPMix(10mM)，2μL模板cDNA，上游引物(10μM) 和下游引物(10μM)各1μL，0.5μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1U/μL)；所述扩增程序为预变性95℃3min；变性95℃15s， 退火58℃15s，延伸72℃1min40s，共35个循环；最后72℃5min。
(7)纯化PCR产物送华大基因测序公司测序。将抗体逃逸株的HA基因 氨基酸序列与野生型病毒的HA基因氨基酸序列进行比对，氨基酸差异位点 即为单克隆抗体所针对的抗原表位。
结果
经3次亚克隆共得到3株阳性杂交瘤细胞系，分别命名为1C8、1B6 和1A2，3株单克隆抗体均为IgG2a，血凝抑制价分别为213、213和212。如下 表1所示。
表1针对H7N9亚型禽流感病毒的单克隆抗体生物学特性
2.2抗体逃逸株筛选
将这3株单克隆抗体与野生型病毒进行反应接种鸡胚后，成功筛选到3 株抗体逃逸株，分别命名为m1C8、m1B6和m1A2。这3个抗体逃逸株与各 自单克隆抗体反应的血凝抑制价下降10log2以上。抗体逃逸试验成功筛选出 3株抗体逃逸株，其中m1C8和m1B6的突变位点相同，都为G214E和L235Q， 针对同一抗原表位；m1A2的突变位点为S136G,G227E，与m1C8和m1B6的 抗原位点不同。如表2所示。
表2用单克隆抗体筛选出的抗体逃逸株中HA基因氨基酸变化情况
突变株 来源 血凝抑制价HI(log2) 突变位点
m1C8 H7N9 2 G214E，L235Q
m1B6 H7N9 2 G214E，L235Q
m1A2 H7N9 2 S136G，G227E
实施例4
胶体金试纸条制备
1、抗体纯化效果鉴定
1B6和1A2单克隆抗体分别经Protein G亲和层析纯化，得到浓度分别为 1.231mg/mL、2.663mg/mL。对处理好的样品以0.5mg/mL的浓度进行 SDS-PAGE后观察结果。如图1主要出现免疫球蛋白的重链和轻链两条带， 其中M：蛋白分子Marker；1代表1B6；2代表1A2，纯化效果较好。
2、胶体金标记的最佳蛋白量
根据指形管的颜色发现，浓度为40μl/ml开始稳定，故确定最佳标记单 克隆抗体量为40μl/ml。
3、包被抗体稀释倍数的确定
用包被液将包被单克隆抗体分别稀释为0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、 1.2mg/ml，在NC膜上划膜，保证其它条件不变，分别于37℃烘干20min。 当浓度为0.8mg/ml、1mg/ml和1.2mg/ml时条带颜色较深，因此作为检测 线包被的抗体浓度应选择为0.8mg/ml。
4、羊抗鼠IgG抗体稀释度的确定
羊抗鼠IgG抗体以不同与浓度为0.8mg/ml检测线抗体组装成试纸条。 当终浓度为5.3mg/mL时质控线颜色深浅适中。因此确定羊抗鼠IgG抗体稀 释成5.3mg/ml。
5、免疫胶体金试纸条的特异性检测
将H7N9亚型毒株和其他抗原分别加入到试纸条的加样孔中，结果发现 试纸条只与H7反应，与其它的抗原无交叉反应。结果如图2。
7、免疫胶体金试纸条的灵敏性检测
将血凝效价为28的A/CHICKEN/JIANGSU/W1-8/2015病毒2倍倍比稀， 每个稀释度80μL/孔加入到加样孔中，结果显示试纸条可以检测到血凝效价 为0.5的病毒量。结果如图3所示。
8、胶体金试纸条广谱性验证
将H7N9亚型禽流感病毒不同分离株(编号1-23)分别加入到试纸条的加 样孔中，在检测线均有条带，如图4所示。
9、胶体金试纸条临床试验
9.1棉拭子鉴定结果
棉拭子结果表明该胶体金试纸条能检测出病毒滴度为2.5log(EID50/ 0.1ml)的棉拭子样品。如图5～6所示。
9.2组织样品鉴定结果
组织样品结果表明该胶体金试纸条能检测出病毒滴度为2.5log (EID50/0.1ml)的组织样品。如图7所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗原表位及其筛选方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcaaaagca ggggatacaa aatga 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaccgcatg tttccattct ttac 24

Claims (10)

1.抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗原表位的筛选方法，包括以下步骤：
1)将野生型H7N9亚型禽流感病毒液与具有中和特性的单克隆抗体腹水等体积混合，20～28℃孵育1h，得到病毒抗体混合液，所述单克隆抗体由灭活野生型病毒株免疫动物通过杂交瘤技术得到；
2)将所述步骤1)得到的病毒抗体混合液接种至SPF鸡胚，将接种后的SPF鸡胚在35℃条件下培养72h，得到尿囊液；
3)测定所述步骤2)得到尿囊液的血凝效价；
4)将所述步骤3)中测定结果为阳性的尿囊液进行梯度稀释，将稀释后的尿囊液分别与0.5ml单克隆抗体腹水等体积混合，20～28℃孵育1h，孵育后的梯度稀释病毒抗体混合液分别接种至SPF鸡胚；
5)测定所述步骤4)中接种72h得到尿囊液的血凝效价，选择最大稀释度病毒抗体混合液接种鸡胚所获得的阳性尿囊液为抗原，测定单克隆抗体的血凝抑制效价，当所述尿囊液测定的血凝抑制效价比野生型病毒测定的血凝抑制效价低8log2时，判定阳性尿囊液为单克隆抗体的逃逸株；
6)将所述步骤5)得到的单克隆抗体的逃逸株接种至SPF鸡胚培养，获得鸡胚尿囊液；
7)以所述步骤6)得到的尿囊液为样品，利用RT-PCR法扩增HA基因，对得到的PCR产物进行测序，将所述测序得到的HA基因序列翻译成氨基酸序列与野生型H7N9亚型禽流感病毒的HA基因进行比对，氨基酸差异位点即为单克隆抗体所针对的抗原表位，鉴定出抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体的特定抗原表位。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)、步骤4)或步骤6)中接种的接种量为每个SPF鸡胚接种0.1ml。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤7)中扩增HA基因用引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中Seq IDNo.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中Seq ID No.2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1或3所述的筛选方法，其特征在于，所述RT-PCR法的反应程序为预变性95℃3min；变性95℃15s，退火58℃15s，延伸72℃1min40s，共35个循环；延伸72℃5min。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)H7N9亚型禽流感病毒液与单克隆抗体腹水混合前预先稀释；所述稀释用溶液为PBS溶液；
所述PBS溶液的浓度为0.01mol/L；
所述PBS溶液的pH值为7.4。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中H7N9亚型禽流感病毒液的病毒浓度为106EID50/0.5ml。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)、步骤4)和步骤6)中SPF鸡胚为10日龄鸡胚。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤4)中梯度稀释包含四个梯度，分别为稀释后的浓度为10-5、10-6、10-7和10-8。
9.权利要求1～8任意一项所述方法筛选得到的H7N9亚型禽流感病毒的特定抗原表位，所述抗原表位由HA基因中第214位氨基酸G和235位氨基酸L组成，或HA基因中第136位氨基酸S和227位氨基酸G组成。
10.具有权利要求1～8任意一项所述方法筛选得到的抗原表位的或者权利要求9所述抗原表位的单克隆抗体在免疫检测试剂中的应用。
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