CN105727287A

CN105727287A - 一种含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法

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Publication number: CN105727287A
Application number: CN201410737016.0A
Authority: CN
Inventors: 郑长义
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-12-06
Filing date: 2014-12-06
Publication date: 2016-07-06

Abstract

一种含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法，特别是将制备的减毒复合病毒株经解冻后加入抗生素灭菌后直接接种于12日龄鸡胚胎受精鸡蛋中，再抽取尿囊液作病毒培殖、制作成疫苗后施打于产蛋中的蛋鸡体内，再于二周及三周后各追加一剂，并于届满八周与十二周龄再各追补一剂。蛋鸡施打复合病毒疫苗(如H₅N₁及H₇N₉或H₁₀N₈)使鸡只体内产生抗体，经由血清移转到蛋黄中，第四周其产蛋的蛋黄即含有禽流感复合病毒株的免疫抗体Immunoglobulin of yolk(IgY)，且其抗体力价呈现稳定状态，该免疫鸡蛋供人食用，借被动免疫原理，使食用者具预防禽流感的效果。

Description

一种含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法

技术领域

本发明涉及一种含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法，其是将禽流感H₅、H₇、H₉及H₁₀等亚型中，取二种以上复合亚型及N₁、N₂、N₆、N₇、N₈、N₉等病毒株的复合病毒株(如H₅N₁及H₇N₉或H₁₀N₈)经减毒纯化后制成疫苗(抗原)，打入鸡只体内，并于第二及第三周各追加抗原一剂，并于届满八周及十二周龄再各追补抗原一剂，则于第一次施打抗原四周后，其产蛋的蛋黄即开始含有复合亚型多病毒株的免疫抗体，借由人食用，可借被动免疫原理，达到人类预防感染禽流感的效果。

背景技术

(一)世界卫生组织(WHO)统计：全球自2013年3月底至2014年10月底止，大陆十省二市及新疆自治区共有441人罹患H₇N₉确诊病例，逾176人死亡，死亡率为39.9％，且感染的年龄层有下降的趋势，显示H₇N₉对人类的传染性愈来愈强，并证实为「有限度的人传人疫情」，而2013年11月中国江西省发生全球首例的人类感染H₁₀N₈的确诊病例，震惊全球！！且2014年元月26日与2月14日又分别发生第二例及第三例H₁₀N₈，并已有2人死亡。据中国国家流感中心主任舒跃龙2月5日在权威医学期刊「TheLancet」上发表指出：H₁₀N₈是中国十七年来出现的第五种发明流感病毒株，属禽源性基因，其来源是中国禽鸟常见的H₉N₂病毒，且H₅N₁及H₇N₉亦来自H₉N₂的变异病毒株。

(二)H₇N₉及H₁₀N₈在禽类属低病原性病毒，对禽类的致病率不强，但人接触反而易罹病，其传染强度可能会比H₅N₁还高。又最近中国江西省、广西省、湖南省及北京市等城市也有人感染H₇N₇及H₅N₁型禽流感病例发生，据台湾中研院副院长陈建仁博士日前提出警示：中国江南汇集密集鸡、鸭、猪只及居住人口，人、禽、畜三类流感病毒容易进行基因重组，已是全球发明流感病毒重组装及制造的大工厂，未来十年至二十年间预计还会有新病毒不断的产生，致中国已全面陷入禽流感的流行病传染疫区，国人应加强防范！！

(三)中国人感染禽流感病毒的亚型包括H₅、H₇、H₉及H₁₀等，而病毒株包括N₁、N₂、N₇、N₈及N₉等，单一亚型及单一病毒株的疫苗或双亚型单一病毒株的免疫鸡蛋已无法满足当前的需求。

(四)今发明人在台湾取得的发明专利「禽流感免疫鸡蛋的制作方法」(发明I309563号)，仅局限于H₅单一亚型单一病毒株禽流感病毒，而发明人2011年7月在中国申请的专利案201110211929.5亦仅为双亚型单一病毒株的免疫鸡蛋制作方法，实为美中不足，又中国专利申请公开号：CN1384119「抗禽类病毒性疫病的复合卵黄抗体及其制备和应用」，其复合卵黄抗体指禽流感(AIV)及新城鸡瘟(NDV)二种，其病毒非同型禽类病毒，而本发明系指同一型复合亚型禽流感抗体，且抗原制备系以福尔马林进行灭菌，其效果不及于抗生素，又其抗原施打，仅于第一次免疫后7日再强化，取其卵黄复合抗体力价低且不稳定，又其复合抗体应用于禽类的药物或饲料的添加用，对人类感染致死性的禽流感无预防的效果。基上所述，将禽流感免疫鸡蛋的免疫球蛋白(IgY)抗体含括H₅、H₇、H₉及H₁₀等多亚型，来生产二种以上亚型及二种以上病毒株的复合型蛋黄免疫抗体(IgY)的免疫鸡蛋，提高其使用价值及抗体力价稳定性的制程，仍为发明人急需突破研究的课题。

发明内容

本发明所要解决的主要技术问题在于，克服现有技术存在的上述缺陷，而提供一种含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法，食用本发明禽流感的免疫鸡蛋，可预防各种亚型及多病毒株的禽流感病毒的入侵(包括H₅N₁、H₇N₂、H₇N₉、H₉N₂及H₁₀N₈等)可避免禽流感大流行。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法，是以可能产生变异，可感染人类的禽流感H₅N₁、H₇N₂、H₇N₉、H₉N₂及H₁₀N₈等亚型病毒株，选取二个以上亚型及二种以上复合病毒株，经去杂菌及减毒后，直接打入12日受精鸡胚胎蛋中增殖，再抽取尿囊液制备成不活化疫苗(抗原)后，施打于产蛋中的母鸡，蛋鸡施打疫苗后，其体内产生的抗体，经蛋母鸡卵巢上皮细胞的特异性受体(Receptor)接受后将血液中的抗体移行至蛋黄中(IgY)，即得含禽流感H₅、H₇、H₉及H₁₀等亚型及N₁、N₂、N₇、N₈及N₉等病毒株的复合免疫抗体的免疫鸡蛋。

所述的含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法，其中，该疫苗施行的方法是施打疫苗第一剂后，于第二周及第三周后各追加一剂，并于届满八周及十二周龄再各追补一剂。

所述的含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法，其中，蛋黄中复合亚型及多病毒株免疫抗体力价的测定方法为血球凝集抑制试验(HI)。

本发明是利用生物被动免疫原理，即是利用生物科技的免疫抗体(IgY)，将禽流感病毒(复合亚型及多病毒株)，经纯化减毒后，当做抗原施打于蛋鸡体内，并于第二周及第三周后各追加一剂，再于届满八周及十二周各追补一剂，利用长效性基剂的慢慢释放，蛋鸡体内会产生对禽流感病毒(复合亚型多病毒株)的抗体，由血清中移转到蛋黄中(称IgY)后，即可由被动免疫(passiveimmunigation)原理，而立即获得抗体，食用该禽流感的免疫鸡蛋，可预防H₅、H₇、H₉及H₁₀等各亚型及N₁、N₂、N₇、N₈及N₉等病毒株的禽流感病毒的入侵，可预防人感染禽流感。

本发明的有益效果是，食用禽流感的免疫鸡蛋(蛋黄含复合亚型及多病毒株的免疫抗体)可预防H₅及H₇或H₁₀等各亚型及N₁、N₂、N₇、N₈、N₉等病毒株的禽流感病毒的入侵人体，避免禽流感大流行。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明的制作流程方块图。

表一.蛋黄中禽流感复合亚型多病毒株抗体力价测定值(mg/IgY)

图中标号说明：

1复合亚型多病毒株(如H₅及H₇或H₁₀的多亚型及N₁、N₂、N₇、N₈、N₉等多病毒株)

2复合亚型多病毒株经减毒后接种于12日龄鸡胎胚

3取出尿囊液经纯化制作成抗原(疫苗)

4抗原(疫苗)接种鸡只体内

5第二周及第三周后各追加一剂(疫苗)补强及届满八周及十二周各追补一剂抗原(疫苗)再补强

6施打第一剂疫苗后第四周其产蛋蛋黄中即含有H₅及H₇或H₁₀复合亚型及N₁～N₉等多病毒株免疫抗体(IgY)

具体实施方式

本发明的含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法，敬请参阅图1所示，为本发明的制作流程方块图，其主要是以复合亚型多病毒株(如H₅、H₇及H₁₀亚型及N₁、N₂、N₇、N₈、N₉等病毒株)1，禽流感的病毒经减毒灭菌后(复合亚型及多病毒株)接种于12日龄鸡胚胎2，取出尿囊液经纯化制作抗原(疫苗)3，抗原施打于蛋鸡体内4，于第二周及第三周后各追加一剂抗原(疫苗)补强及届满八周及十二周各追补一剂抗原(疫苗)再补强5，施打第一剂疫苗后第四周其产蛋蛋黄中即含有H₅及H₇或H₁₀复合亚型及N₁～N₉等病毒株免疫抗体(IgY)6产生。

至于免疫鸡蛋生产的制程，其先准备：

(一)材料：

选取30-60周龄产蛋中的白来亨蛋鸡(经试验得知白壳蛋优于红壳蛋)。

(二)病毒培植、疫苗制作与抗原施打：

1.病毒H₅、H₇或H₁₀复合亚型及N₁、N₉或N₈等病毒株培殖

(1)将取得的病毒解冻后，加入抗生素灭杂菌。

(2)直接打入12日龄受精蛋中。

(3)抽出的尿囊液测定病毒力价稳定后便为第一代病毒液。

(4)再以第一代病毒液进行增殖。

2.疫苗(病毒)制备

首先：

(1)加入抗生素penicillinstreptomycin200-300μL。

(2)经测试得知禽流感病毒(H₅、H₇或H₁₀复合亚型及N₁、N₉等病毒株)接种于12日龄鸡胚胎，其获得抗体的力价较接种于11日鸡胚胎者高，此为本发明的新发现。病毒接种于受精12日鸡胚胎后的步骤说明如下：

A.接种前先照蛋，将气室划出。

B.授精蛋放置操作台前需先经酒精消毒(器具包括：锥子、注射针都需经酒精灯消毒)。

C.锥子经酒精灯过火，在划线上方刺一小孔。

D.注射针抽取病毒液，每颗蛋注入0.2mL病毒液。此时需注意针头后方不可以碰触到鸡蛋，以免污染。

E.注入病毒液后，使用矿物油封住孔洞。

F.接蛋后隔日照蛋，将胚胎死亡鸡蛋丢掉。

G.第2天照蛋，将胚胎死亡鸡蛋置入4℃冰箱冷藏。

H.第3天，不管胚胎有无死亡，均置入4℃冰箱冷藏。经放置半天或隔日准备抽取尿囊液。

3.抗原(疫苗)施打

第一次每只施打疫苗1mL于胸部肌肉，二周及第三周后追加一剂，第三周开始，每周采血及捡蛋一次，测定蛋黄中抗体(IgY)的力价。

(三)蛋黄抗体力价判定方法

1.血球凝集抑制试验(HI)：

目的：抽取抗体

A.取测定盘96孔每孔加入0.85％NaCl各25μL。

B.取待测物25μL，做连续2被稀释至第11孔(待测物为卵黄，在做分析前需要经过水浴56℃、30分钟，非动化过程，目的为去除卵黄中含其它因子可能造成不正常凝血)。

C.由第1至11孔每孔加入病毒液(力价确定，并且稀释后)。

D.静置30分钟。

E.每孔加入25μL1％鸡RBC。

F.静置40分钟后判读降沉为指标。

凝集+

降沉-降沉为指标

2.蛋黄抗体力价测定：

目的：测定抗体数目

(1)蛋黄萃取液的制备

A取2mL蛋黄至离心管。

B.加入2mL0.85％NaCl。

C.振荡机混合均匀。

D.加入4mLChloroform(目的溶解脂肪)，把上摇匀至变硬。

E.静置10分钟以上(约15分钟)。

F.利用离心机2000rpm，4℃、10分钟。

G.取上清液(内含抗体及病原)。上清液中含有抗体病原，故可用于检测蛋黄中是否含抗原。

H.上清液冰至-20℃储藏。

ps：因为卵黄为2mL、NaCl2mL、Chloroform4mL

卵黄被稀释成1∶3

所以抗体测出后要×3

3.抗体力价测定结果判定：

由表一得知：

(1)疫苗施打第一剂后第四周其产蛋的蛋黄即含有禽流感H₅及H₇复合亚型病毒的免疫抗体(IgY)，此即证明，生产禽流感的免疫鸡蛋，应于母鸡接种禽流感病毒第一剂后的第四周其蛋黄抗体(IgY)已高达7.0以上，即可达到预防禽流感的效果。

(2)抗原(疫苗)接种于不同日龄鸡胚胎，由表1得知，抗体力价测定值于接种12日龄鸡胚胎，高于接种于11日龄鸡胚胎。此为一新发现。

(3)接种疫苗后于第二周及第三周各追加一剂后，再于届满第八周及第十二周，再各追补强一剂，其蛋黄中复合亚型免疫抗体力价，高于仅于届满十二周再追加一剂，且其抗体力价稳定性亦佳(见表1所示)，此为本发明的另一新发现，显示本发明的进步性及创新性。

综上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，(如H₅N₁、H₇N₉及H₁₀N₈三种禽流感病毒株的任何组合)的制程改良，均仍属于本发明技术方案的范围内。

表一.蛋黄中禽流感复合亚型多病毒株抗体力价测定值(mg/IgY)

注：(1)接种疫苗后第二及第三周各追加一剂。

(2)＊p＜0.05(差异显著)

Claims

1.一种含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法，其特征在于，其制程如下：可感染人类的禽流感H₅、H₇、H₉、H₁₀等亚型及N₁、N₂、N₇、N₈、N₉等病毒株，取二种以上复合亚型及多病毒株经去杂菌减毒后，直接打入受精12日鸡胚胎蛋中增殖，再抽取尿囊液制备成不活化疫苗(抗原)后，施打于产蛋中的母鸡，蛋鸡施打疫苗后，其体内产生的抗体，经蛋母鸡卵巢上皮细胞的特异性受体(Receptor)接受后将血液中的抗体移行至蛋黄中(IgY)，接种四周后，其即得含禽流感复合亚型多病毒株蛋黄免疫抗体的免疫鸡蛋。

2.根据权利要求1所述的含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法，其特征在于，所述疫苗(抗原)制备的制程是将二种以上复合亚型(如H₅N₁及H₇N₉或H₁₀N₈)及多病毒株接种于12日龄鸡胚胎蛋中，再制备成抗原(疫苗)。

3.根据权利要求1所述的含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法，其特征在于，所述疫苗施行的方法是施打疫苗第一剂后，于第二周及第三周后各追加一剂，并于届满八周及十二周龄再各追补强一剂。

4.根据权利要求1所述的含复合亚型免疫抗体的禽流感免疫鸡蛋生产制程方法，其特征在于，所述蛋黄中复合亚型禽流感多病毒株蛋黄中抗体力价的测定方法为血球凝集抑制试验(HI)。