CN103690951B - 一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法，按如下步骤制得：菌种准备及细菌的增殖；制备灭活菌苗；产蛋鸡的免疫；高免蛋的收集；提取抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药；效价、安全检验，形成产品。本发明用水貂绿脓杆菌性肺炎病原菌的灭活菌苗免疫产蛋母鸡，从鸡蛋黄中提取蛋白质，对水貂绿脓杆菌性肺炎具有特异性的预防和治疗作用，不仅不产生耐药性，在体内不存在药物残留，而且该药物药效期长，使用成本低，治愈率高，存活数大。

Description

一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法

技术领域

本发明涉及水貂兽药的制备方法，尤其涉及预防和治疗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法。

背景技术

水貂绿脓杆菌性肺炎是由绿脓杆菌引起的严重危害2～7周龄小水貂的一种细菌性传染病，发病率高(5～90%)，死亡率高(1～80%)，即便没有死亡的小水貂也会体重减轻，生长迟缓，给水貂饲养业造成严重的经济损失。该病呈世界性分布，在所有养水貂国家和地区流行且危害严重。我国兽医专家郭玉璞于1982年在北京首次确认此病以来，现在全国许多省区（如四川、重庆、北京、上海、浙江等）都相继有本病的报道。

抗菌药物防治是当前防治水貂绿脓杆菌性肺炎的一项最重要的措施，但其存在许多不足：由于绿脓杆菌对抗菌药物易产生耐药性，各地分离的菌株对抗菌药物的敏感性不完全相同，甚至差别很大，致使抗菌药的应用受到一定的限制。

要想获得针对某一水貂饲养场或地区的水貂绿脓杆菌性肺炎具有很好疗效的药物，必须从该地区或饲养场的病死水貂中分离出病原（绿脓杆菌），再进行体外药物敏感性试验，操作复杂和费时，在我国基层兽医工作中基本不能实现。另外，用药物治疗水貂绿脓杆菌性肺炎需要连续反复给药，治疗成本高，如用高霉素治疗水貂绿脓杆菌性肺炎，每只水貂的药物费用在0.25～0.35元。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种疗效好，成本低的抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药的制备方法，其步骤是：

1、一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法，其特征在于：按如下步骤制得：

(1)菌种准备及细菌的增殖

将真空冻干保存的绿脓杆菌用生理盐水（生理盐水为重量体积比为0.9%的氯化钠水溶液）按体积比1∶1稀释，接种于NAC琼脂培养基，在 37℃的培养箱中培养18～24小时，经纯度检验没有杂菌生长后，用生理盐水制成菌悬液接种于LB琼脂培养基，37℃的培养箱中培养36～48小时后，收集细菌。

所述LB培养基的配制按如下所需组分重量称取混合：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂12.0g/L，加700-800ml蒸馏水溶解，然后加蒸馏水补至1000ml，116℃高压灭菌30min后备用。

 (2) 制备灭活菌苗

将收集的细菌用生理盐水悬浮成菌悬液，即把在培养基上生长的细菌菌落加入到生理盐水中混匀，使每毫升菌悬浮含150～200亿个细菌，用终浓度重量体积比为0.3%的甲醛在37℃下灭活24小时，即为制苗用抗原；把抗原乳化制成油乳剂灭活菌苗，并进行灭活菌苗的安全检验；

(3) 产蛋鸡的免疫

选25周龄的健康产蛋母鸡用安全检验合格的灭活菌苗进行免疫，免疫程序为：

第1次免疫：每只鸡腿肌注射0.2ml，颈部皮下注射0.2ml，

第2次免疫：2周后每只鸡颈部皮下注射1.0ml，

第3次免疫： 2周后，每只鸡颈部皮下多点注射1.5ml；

(4) 高免蛋的收集

产蛋鸡第3次免疫后14天，开始抽样测定高免鸡蛋黄中抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体效价，蛋黄与生理盐水按体积比1∶3稀释后，加入等体积三氯甲烷萃提，上清液琼扩效价≥1∶16即为合格，之后收集鸡蛋；

(5)提取抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药

A、蛋壳消毒：将鸡蛋浸入加热至42℃的0.1%新洁尔灭水溶液中消毒25～35分钟，取出凉干或吹干备用；

B、打蛋分离蛋黄：采用手工或机械打蛋，充分除去蛋清、胚盘和系带，收集蛋黄；

C、萃提：先充分搅拌蛋黄呈均匀膏状，然后加入3倍体积的高压的灭菌生理盐水，再次充分搅拌混匀，使成为蛋黄液；在该蛋黄液中加入等体积的三氯甲烷，充分振荡混合，静置60分钟后以3500～4000rpm用离心机离心30分钟，收集离心管中的上清液；

D、加入灭活剂和稳定剂：上清液按终浓度体积比为0.05%加入甲醛，充分搅拌混合，密封30～60分钟后加入终浓度重量体积比为0.02%的稳定剂吐温-20，混匀；

E、除菌过滤：用0.2～0.3um微孔滤膜过滤除菌，即得到抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药，主要成分是卵黄抗体；

(6)效价、安全检验，形成产品

效价用含8%Nacl的1%琼脂，即用8%氯化钠溶液配制的琼脂，琼脂的含量是1%，1%为重量体积比，为载体的琼扩试验检测，检测用抗原为绿脓杆菌脂多糖抗原，抗原含量为150～200mg/ml；18～20g小鼠3只做安全性检验，每只小鼠腹腔注射0.5ml菌苗，观察7天，无任何异常反应为合格。

在上述步骤(1)的菌种准备及细菌的增殖中，所述NAC琼脂培养基的配制方法：按如下所需组分重量称取，蛋白胨20.0g/L， 硫酸镁0.2g/L，十六烷基三甲基溴化铵0.2g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，萘啶酮酸0.015g/L，琼脂12.0g/L，然后将蛋白胨、硫酸镁、十六烷基三甲基溴化铵、磷酸氢二钾、萘啶酮酸、琼脂混合成NAC琼脂混合物，称取所述NAC琼脂混合物33克，加蒸馏水1000ml，加热煮沸直至混合物全部溶解，摇匀，倾注平板，用于假单胞菌属分离培养；所述LB培养基的配制按如下所需组分重量称取，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂12.0g/L。

在上述步骤(2)的制备灭活菌苗中，乳化是指先分别制备油相和制备水相，再按体积比1:3混合乳化，其中：制备油相，取94ml的10号白油，6ml的司本-80，硬脂酸铝2g，先将硬脂酸铝与20～30ml白油混合加热到70～80℃熔化后，再补足剩余10号白油及加入司本-80充分搅拌分装，在温度116℃下灭菌30分钟，最后在10℃冷藏备用；制备水相，取96ml灭活菌抗原悬液，4ml的吐温-80；乳化按3ml油相和1ml水相配制，取油相加入高速组织捣碎机缸内，在30～50转/分钟的慢速下搅拌，缓缓加入水相之后在180～200转/分钟的高速下搅拌2～5分钟，在终止搅拌前加入1%的硫柳汞溶液，使溶液终浓度为万分之一。

本发明的技术效果是：本发明提供一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药，通过用水貂绿脓杆菌性肺炎病原菌（绿脓杆菌）的灭活菌苗免疫产蛋母鸡，从鸡蛋黄中提取的一种蛋白质，将该蛋白质用于防治水貂绿脓杆菌性肺炎，来解决用抗菌药物防治水貂绿脓杆菌性肺炎存在的易产生耐药菌株、需连续反复给药及成本高的问题。

另外，用水貂绿脓杆菌性肺炎病原菌（绿脓杆菌）的灭活菌苗免疫产蛋母鸡，从鸡蛋黄中提取的一种蛋白质，它对水貂绿脓杆菌性肺炎具有特异性的预防和治疗作用及绿脓杆菌不对它产生耐药性。感染绿脓杆菌性肺炎病的水貂用本发明抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药治疗后，其体内不存在药物残留，该药物药效期长，可达5～7天，一般患病水貂用药一次即可治愈，使用成本低，每只病水貂的治疗成本在0.08～0.12元。因此，本发明抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药在水貂绿脓杆菌性肺炎的防治中具有特效，无残留，不产生耐药性，药效期长，价格低的特点，是一种“绿色”药物，在兽医公共卫生学上有重要意义。

本发明经实验证明取得显著成功，完全达到了发明的目的。它不仅不产生耐药性，在体内不存在药物残留，该药物药效期长，使用成本低，而且，治愈率高，存活数大。

下面是用本发明兽药对水貂传染性肺炎的预防和治疗试验情况说明：

试验一：400只14日龄小水貂，用不含抗菌药物的饲料饲喂，随机分成2组，每组200只；第1组试验水貂每只腿部肌注1.0 ml抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药，第2组试验水貂每只腿部肌注1.0 ml生理盐水：分别于注射后24小时，72小时，120小时及 168小时从各组中随机抽取50只试验水貂用于攻毒试验，结果表明第1组试验水貂在24小时，72小时，120小时及168小时攻毒后存活率为100%。

试验二：用不含抗菌药物的饲料饲喂400只14日小水貂，随机分成4组，每组100只，在实验室条件下人工感染水貂绿脓杆菌性肺炎。第1、2、3组试验水貂分别在感染后12小时，24小时，36小时每只水貂腿部肌肉注射抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药1.0 ml治疗，第4组为空白对照，其结果为：第1、2、3组的治愈比分别为98/100(98%)、85/92 (92.4%)、49/70 (70%)，第4组的存活数为0(0/1 00)。详见下表：

由上表可见，本发明兽药的另一特点是，治愈率高，存活数大。

具体实施方式

下面对本发明的一个较佳实施例进行详细介绍：

1．菌种

用于制造本品的菌种为强毒力的绿脓杆菌菌株。

2．抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体IgY制造及检验

2.1高免鸡蛋的产生

2.1.1产蛋鸡符合以下条件下的普通商品蛋鸡：

2.1.1.1无禽流感感染，监测血清抗体，按0.5%抽样，应全部为阴性。

2.1.1.2按法定方法检疫鸡白痢和鸡支原体病，阳性率≤0.l%。

2.1.1.3产蛋鸡具有商品蛋鸡的良好生产性能。

2.1.1.4蛋鸡饲养管理

鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求。应距交通要道200米以上，进出口道路应分开。场内饲料、粪便道路分开，鸡场进出口应设消毒池。育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水卫生达标。饲养员应健康。

2.1.1.5鸡群疫病防制

无特殊要求。按科学免疫程序适时接种新城疫、马立克氏病、传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病、传染性鼻炎、减蛋综合征、大肠杆菌等疫苗。按常规在饲料中添加如土霉素等抗菌药物，以及防止细菌感染及预防球虫感染的药物。

2.2抗原（免疫原）制备

2.2.1菌种准备及细菌的增殖

将真空冻干保存的绿脓杆菌用生理盐水（重量体积比为0.9%的氯化钠水溶液）按体积比1∶1稀释，接种于NAC琼脂培养基，本实施例的NAC培养基配制方法是： 称取蛋白胨20.0g， 硫酸镁0.2g，十六烷基三甲基溴化铵0.2g ，磷酸氢二钾0.3g，萘啶酮酸0.015g，琼脂12.0g。 然后将蛋白胨、硫酸镁、十六烷基三甲基溴化铵、磷酸氢二钾、萘啶酮酸、琼脂混合成NAC琼脂混合物，称取所述NAC琼脂混合物33克，加蒸馏水1000ml，加热煮沸直至全部溶解，摇匀，倾注平板，用于假单胞菌属分离培养，在 37℃的培养箱中培养18～24小时，经纯度检验没有杂菌生长后，用生理盐水制成菌悬液接种于LB琼脂培养基，37℃的培养箱中培养36～48小时后，收集细菌。

所述LB培养基的配制按如下所需组分重量称取混合：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂12.0g/L，加700-800ml蒸馏水溶解，然后加蒸馏水补至1000ml，116℃高压灭菌30min后备用。

2.2.2制备油乳剂苗

2.2.2.1抗原准备

将收集的细菌用生理盐水悬浮成菌悬浮，使每毫升含150～200亿个细菌，用终浓度0.3%甲醛在37℃下灭活24小时，其闻振摇3～4次，即为制苗用抗原。

2.2.2.2乳化

油相制备，取10号白油94ml，司本-80 6ml，硬脂酸铝2g，先将硬脂酸铝与20-30ml白油混合加热（70-80℃）熔化后，再补足剩下白油及加入司本-80充分搅拌，分装，在温度116℃下，用高压灭菌锅进行30分钟灭菌，最后在10℃左右冷藏备用。

水相制备 ，按抗原（灭活菌抗原悬液）96ml，吐温-80 4ml的比例配制。

乳化按油相3ml，水相1ml配制，取油相加入高速组织捣碎机缸内，慢速（30～50转/分钟）搅拌，缓缓加入水相之后高速（180～200转/分钟）搅拌2～5分钟，在终止搅拌前加入1%的硫柳汞溶液， 1%为重量体积比，使之终浓度为万分之一，万分之一为重量体积比，得到油乳剂抗原。

2.2.2.3检验

物理性状： 油乳剂抗原应为乳白色带粘滞性的均匀乳状液，经3500 r/min离心30分钟，不分层为合格。

无菌检验，无细菌生长。

安全检验，油乳剂抗原接种20～30日龄健康鸡30只，每只颈背部下皮注射3ml，设对照30只，同条件下饲养，观察15天，两组鸡均无异常判该抗原合格。

2.2.2.4保存

上述2.2.2.1制备的抗原应避光4℃保存，6个月内有效，不能冻结。

2.3免疫程序

25周龄左右的健康产蛋母鸡用油乳剂苗首免，免疫剂量为0.5m l/只（左右脚垫各0.15ml，颈部皮下0.2ml），以后每隔2周颈部皮下注射1.0 ml～1.5ml进行加强免疫，共加强免疫2次。

2.4 高免蛋收集

第3次免疫后1 4天开始抽样测定高免鸡蛋黄中抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体IgY兽药效价，蛋黄与生理盐水按体积比1:3稀释后，加入等体积的三氯甲烷萃提，上清液琼扩效价≥1：1 6即为合格，之后收集鸡蛋。

2.5抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体IgY兽药的制造

2.5.1蛋壳消毒：将鸡蛋浸入加热至4 2℃的0.1%新洁尔灭水溶液中消毒3 0分钟，取出凉干备用。

2.5.2打蛋分离蛋黄：采用手工或机械打蛋，充分除去蛋清（白蛋白），胚盘和系带，收集蛋黄。

2.5.3萃提：先充分搅拌蛋黄呈均匀膏状，然后加入3倍体积的高压灭菌生理盐水，再次充分搅拌混匀，使成为蛋黄液：在该蛋黄液中加入等体积的三氯甲烷，充分振荡混合，静置6 0分钟后以3500～4000rpm用离心机离心3 0分钟左右，收集离心管中的上清液。

2.5.4上清液加入灭活剂和稳定剂：上清液按终浓度为0.05%（体积比）加入甲醛，充分搅拌混合，密封30～60分钟后加入终浓度为0.02%（重量体积比）的稳定剂吐温-20，混匀；

2.5.5除菌过滤：用0.22um微孔滤膜过滤除菌，即为抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体IgY兽药。

2.6成品检验

无菌检验，应无细菌生长。

效价测定： 采用琼脂扩散试验检测，在浓度为8%氯化钠溶液（重量体积比）中加入1g琼脂粉，加热融化（加热到50～60℃）后加入终浓度为0.01%（重量体积比）硫柳汞防腐，浇制凝胶板，按中央l盲孔，外围6盲孔打孔，孔径3 mm，间距4 mm，加样量为15 ～20ul，加样后在37℃温度盒内孵育24小时，再在室温放置24～48小时；观察判定结果：与标准抗原形成白色沉淀线的最大稀释度即为抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体IgY兽药的效价；成品中抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体IgY药的效价应≥1:16。

（11）安全检验：取18～22g健康小白鼠5只，各皮下注射本品0.5ml；2周龄健康小水貂1 0只，各皮下注射本品3.0ml。观察10天，小白鼠和小水貂均应全部健活。

Claims (1)

1.一种抗水貂绿脓杆菌性肺炎兽药的制备方法，其特征在于：按如下步骤制得：

(1)菌种准备及细菌的增殖

将真空冻干保存的绿脓杆菌用生理盐水按体积比1∶1稀释，接种于NAC琼脂培养基，在 37℃的培养箱中培养18～24小时，经纯度检验没有杂菌生长后，用生理盐水制成菌悬液接种于LB琼脂培养基，在37℃的培养箱中培养36～48小时后，收集细菌；所述NAC琼脂培养基的配制方法：按如下所需组分重量称取，蛋白胨20.0g/L， 硫酸镁0.2g/L，十六烷基三甲基溴化铵0.2g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，萘啶酮酸0.015g/L，琼脂12.0g/L，然后将蛋白胨、硫酸镁、十六烷基三甲基溴化铵、磷酸氢二钾、萘啶酮酸、琼脂混合成NAC琼脂混合物，称取所述NAC琼脂混合物33克，加蒸馏水至1000ml，加热直至混合物全部溶解，摇匀，倾注平板，用于假单胞菌属分离培养；所述LB培养基的配制按如下所需组分重量称取混合：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂12.0g/L，加700-800ml蒸馏水溶解，然后加蒸馏水补至1000ml，116℃高压灭菌30分钟后备用；

 (2) 制备灭活菌苗

将收集的细菌用生理盐水悬浮成菌悬液，使每毫升菌悬液含150～200亿个细菌，用终浓度0.3%甲醛在37℃下灭活24小时，即为制苗用抗原；把抗原乳化制成油乳剂灭活菌苗，并进行灭活菌苗的安全检验；所述乳化是指先分别制备油相和制备水相，再按体积比1:3混合乳化，其中：制备油相，取94ml的10号白油，6ml的司本-80，硬脂酸铝2g，先将硬脂酸铝与20～30ml白油混合加热到70～80℃熔化后，再补足剩余10号白油及加入司本-80充分搅拌分装，在温度116℃下灭菌30分钟，最后在10℃冷藏备用；制备水相，取96ml灭活菌抗原悬液，4ml的吐温-80；乳化按3ml油相和1ml水相配制，取油相加入高速组织捣碎机缸内，在30～50转/分钟的慢速下搅拌，缓缓加入水相之后在180～200转/分钟的高速下搅拌2～5分钟，在终止搅拌前加入1%的硫柳汞溶液，使溶液终浓度为万分之一；

(3) 产蛋鸡的免疫

选25周龄的健康产蛋母鸡用安全检验合格的灭活菌苗进行免疫，免疫程序为：

第1次免疫：每只鸡腿肌注射0.2ml，颈部皮下注射0.2ml，

第2次免疫：2周后每只鸡颈部皮下注射1.0ml，

第3次免疫： 2周后，每只鸡颈部皮下多点注射1.5ml；

(4) 高免蛋的收集

产蛋鸡第3次免疫后14天，开始抽样测定高免鸡蛋黄中抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体效价，蛋黄与生理盐水按体积比1∶3稀释后，加入等体积三氯甲烷萃提，上清液琼扩效价≥1∶16即为合格，之后收集鸡蛋；

(5) 提取抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药

A、蛋壳消毒：将鸡蛋浸入加热至42℃的0.1%新洁尔灭水溶液中消毒25～35分钟，取出凉干或吹干备用；

B、打蛋分离蛋黄：打蛋，充分除去蛋清、胚盘和系带，收集蛋黄；

C、萃提：先充分搅拌蛋黄呈均匀膏状，然后加入3倍体积的高压灭菌生理盐水，再次充分搅拌混匀，使成为蛋黄液；在该蛋黄液中加入等体积的三氯甲烷，充分振荡混合，静置60分钟后装入离心管以3500～4000rpm离心30分钟，收集离心管中的上清液；

D、加入灭活剂和稳定剂：上清液按终浓度为0.05%加入甲醛，充分搅拌混合，密封30～60分钟后加入终浓度为0.02%的稳定剂吐温-20，混匀；

E、除菌过滤：用0.2～0.3um微孔滤膜过滤除菌，即得到抗水貂绿脓杆菌性肺炎卵黄抗体兽药；

(6)效价、安全检验，形成产品

效价用含氯化钠的琼脂为载体进行琼扩试验检测，所述含氯化钠的琼脂是用8%氯化钠溶液配制的琼脂，琼脂的含量是1%，检测用抗原为绿脓杆菌脂多糖抗原，抗原含量为150～200mg/ml；18～20g小鼠3只做安全性检验，每只小鼠腹腔注射0.5ml菌苗，观察7天，无任何异常反应为合格。