CN104530232B

CN104530232B - 鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法

Info

Publication number: CN104530232B
Application number: CN201410815354.1A
Authority: CN
Inventors: 李朝阳; 赵锋祥; 乔彦良; 吴庆海; 薛希娟
Original assignee: Shandong Sinder Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Sinder Technology Co ltd
Priority date: 2014-12-23
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2018-05-01
Anticipated expiration: 2034-12-23
Also published as: CN104530232A

Abstract

本发明提供鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，包括以下步骤：分离鸭病毒性肝炎毒株和制备灭活疫苗；所述灭活疫苗免疫无病产蛋鸡群得到高免蛋，分离蛋黄后经酸化处理、辛酸处理、离心、板框过滤、灭活、超滤、配液、过滤除菌后得到鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体。将鸭病毒性肝炎1型和鸭病毒性肝炎3型毒株单独做苗，分开免疫健康产蛋鸡群，避免了两种抗原在同一机体中的免疫应答竞争影响的因素，每种血清型的抗体效价单独控制，避免因一种血清型抗体效价不高时，再次免疫二联疫苗对另一种血清型抗原造成免疫耐受的后果。该技术得到了无类脂物质、无任何外源微生物污染的高效价精制蛋黄抗体。

Description

鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及禽用生物制品领域，特别涉及鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭的一种高度致死性、传播迅速的病毒性疾病，以肝炎为其主要特征。如果防治不当，死亡率很高，对养鸭场会造成很大的经济损失。

鸭病毒性肝炎于1958年始发于我国上海地区，迄今为止，该病已在我国流行50多年。根据大量的文献报道及实验室检测结果，表明目前在我国大量流行的鸭病毒性肝炎的发生主要由DHAV-1型和DHAV-3型感染所致，其中单个血清型的流行占据70％以上，两种血清型的混合感染占据小于30％的比例，但是目前临床现有的鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体主要以二价抗体为主，并未针对地方所流行血清型来选择特异性抗体。DHAV-1型和DHAV-3型之间几乎没有交叉保护，这样无疑造成了非特异性抗体的浪费。为了适应市场需求，降低非特异性鸭肝抗体的浪费，研究一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的新型制备方法，根据地方流行鸭肝炎病毒血清型来选择相应的血清型抗体预防和治疗，迫在眉睫。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在通过分离目前临床最流行的鸭肝炎病毒的血清型毒株，提出鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，以制备出高效价、高特异性、高纯度、无任何外源微生物污染的鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体。

本发明提出了一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，包括以下步骤：分离鸭病毒性肝炎毒株和制备灭活疫苗；所述灭活疫苗免疫健康产蛋鸡群得到高免蛋，分离蛋黄后经酸化处理、辛酸处理、离心、板框过滤、灭活、超滤、配液、过滤除菌后得到鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体。

本发明的有益效果在于：

1)将鸭病毒性肝炎1型和鸭病毒性肝炎3型毒株单独做苗，分开免疫健康产蛋鸡群，避免了两种抗原在同一机体中的免疫应答竞争影响的因素，每种血清型的抗体效价单独控制，避免因一种血清型抗体效价不高时，再次免疫二联疫苗对另一种血清型抗原造成免疫耐受的后果。

2)通过辛酸处理、离心、板框过滤、灭活等环节处理，该技术非常适合大规模生产，得到了无类脂物质、无任何外源微生物污染的高效价精制蛋黄抗体。

3)中和效价均高于1:350，中和效价远高于现有的鸭病毒性肝炎二价精制蛋黄抗体。

4)鸭病毒性肝炎1型和鸭病毒性肝炎3型疫苗分开免疫鸡群，单独生产制备抗体，可以针对特定鸭病毒性肝炎血清型的流行区域制备同种血清型的抗体，避免了非特异性抗体的浪费，降低了养殖户的抗体使用成本。

附图说明

图1是本发明实施例的鸭肝炎病毒1型引物扩增结果示意图；

图2是本发明实施例的鸭肝炎病毒3型引物扩增结果示意图。

图1中，M：MarkerDL2000；1：已知1型鸭肝炎病毒；2：待检鸭肝炎肝脏病料；3：已知3型鸭肝炎肝脏病料；4：鸭瘟病毒；5：番鸭细小病毒；

图2中，M：MarkerDL2000；1：已知3型鸭肝炎病毒；2：待检鸭肝炎肝脏病料；3：已知1型鸭肝炎肝脏病料；4：鸭瘟病毒；5：番鸭细小病毒。

具体实施方式

以下优选实施例，对本发明作详细描述，以使本领域的技术人员能够实践它们。

下面对本发明做详细描述。

鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，包括以下步骤：分离鸭病毒性肝炎毒株和制备灭活疫苗；所述灭活疫苗免疫健康产蛋鸡群得到高免蛋，分离蛋黄后经酸化处理、辛酸处理、离心、板框过滤、灭活、超滤、配液、过滤除菌后得到鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体。

其中，以下菌株保藏于中国典型培养物保藏中心：

名称鸭肝炎病毒SD-1株Duck hepatitis virus；

保藏编号CCTCC V201440；

保藏日期2014年11月2日；

简称为鸭肝炎病毒SD-1株；

保藏地址中国.武汉.武汉大学。

名称鸭肝炎病毒SD-3株Duck hepatitis virus；

保藏编号CCTCC V201441；

保藏日期2014年11月2日；

简称为鸭肝炎病毒SD-3株；

保藏地址中国.武汉.武汉大学。

本发明所述鸭病毒性肝炎毒株为鸭病毒性肝炎1型(DHAV-1)和鸭病毒性肝炎3型(DHAV-3)毒株中的一种或两种；所述鸭病毒性肝炎1型的所述免疫原性较好的血清型病毒为鸭肝炎病毒SD-1株CCTCC V201440；所述鸭病毒性肝炎3型的所述免疫原性较好的血清型病毒为鸭肝炎病毒SD-3株CCTCC V201441。

所述步骤具体为：

一、免疫抗原(疫苗)的制备

1.1分离鸭病毒性肝炎毒株和制备灭活疫苗：选取鸭病毒性肝炎毒株接种鸭胚，分离筛选到免疫原性较好的血清型的病毒，将获得的免疫原性较好的血清型的病毒用灭菌生理盐水做1:1000倍稀释后，绒毛尿囊腔接种11日龄非免疫鸭胚，每胚0.2ml，置37～38℃继续孵育。24h内死亡的鸭胚弃去，鸭胚死亡时间稳定在72～120小时，死亡胚胎眼观病变为全身皮肤和皮下充血、出血，胚肝呈红黄色,肿大并有针头大小出血点和坏死灶,死亡时间较长的胚胎绒尿液显浅绿色。死亡的鸭胚置于4℃冰箱冷藏过夜，无菌收取尿囊液和胚体，胚体用组织匀浆机处理后，反复冻融3次，4℃，5000r/min离心取上清液与尿囊液混合，病毒液4倍浓缩，浓缩后取出部分待检验及测定毒价，剩余的-20℃保存待用做制备疫苗。

其中，所述鸭病毒性肝炎毒株为鸭病毒性肝炎1型和鸭病毒性肝炎3型毒株中的一种或两种；所述鸭病毒性肝炎1型的所述免疫原性较好的血清型病毒为鸭肝炎病毒SD-1株CCTCC V201440；所述鸭病毒性肝炎3型的所述免疫原性较好的血清型病毒为鸭肝炎病毒SD-3株CCTCC V201441。

1.2免疫原性较好的血清型病毒液纯净性检验

将浓缩后的病毒液按照现行《中国兽药典》三部附录进行无菌、支原体、外源病毒检验，均为阴性，证明所得的病毒液均无菌、无支原体、无外源病毒污染。

1.3免疫原性较好的血清型病毒液病毒含量测定

将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4～10^-8 5个稀释度，绒毛尿囊腔接种11日龄非免疫鸭胚5个，每胚0.1ml。置37～38℃继续孵育，观察24～96小时，24小时内死亡鸭胚弃去，记录24～96小时死亡鸡胚数量，计算ELD₅₀含量至少为10^6.86ELD₅₀/ml。

1.4免疫原性较好的血清型病毒液灭活

将病毒液中加入甲醛溶液，使其终浓度为0.1％，密闭后充分振摇混匀，置37℃温箱灭活48小时，期间每6小时振摇一次。

1.5灭活检验

对灭活液抽样并接种11日龄非免疫鸭胚，抗原接种5枚，连续观察7天，鸭胚全部健活。

1.6疫苗乳化

①油相制备：10号白油94份，司本-806份，硬脂酸铝2％。硬酯酸铝与少量白油混合加热熔化后，补足白油，加入司本-80，充分搅拌，分装。116℃，30分钟灭菌，10℃冷藏备用。

②水相制备：按抗原96份，吐温-804份配制。吐温-80加入带玻璃珠的瓶中灭菌。吐温-80先与少量抗原混和，然后与大量抗原混合，充分振摇，使吐温-80完全溶解。

③乳化:按油相3份，水相1份配制。取油相加入高速乳化机缸内，慢速搅拌，徐徐加入水相，加毕高速乳化2～5分钟。取少量乳化液低于冷清水中，不扩散为乳化完成。

1.7疫苗检验

①物理性状：油乳佐剂抗原应为乳白色带粘滞性的均匀乳状液，经3500r/min离心30分钟，无分层现象。

②无菌检验：按现行《中国兽药典》三部进行，无菌生长。

③安全检验：每批油乳剂抗原接种20-30日龄健康鸡10只，每鸡颈背皮下注射3ml，设对照组5只，隔离饲养，观察15天后剖杀，两组鸡均无肉眼可见异常病理变化。

二、免疫无病产蛋鸡群获得高免蛋

2.1鸡群的选择

选择有正规及成熟的免疫程序的鸡场，适时接种新城疫、禽流感、马立克氏病、传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病、传染性鼻炎、减蛋综合征(EDS₇₆)、大肠杆菌等疫苗，并现行《中国兽药典》三部附录检测无禽白血病污染，按中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布的《鸡白痢抗体检测方法-全血平板凝集试验》和《鸡败血支原体感染抗体检测方法-快速血清凝集试验》标准对鸡白痢和鸡支原体病进行检测，阳性率均不高于0.1％。

2.2免疫程序

免疫前适当给鸡群添加抗应激及抗菌药物。

第一次免疫：胸部肌肉分点注射，1ml/只；第二次免疫：于一免后两周胸部注射分点注射，2.0ml/只，二次免疫后两周测定中和效价。血清型疫苗免疫鸡群1000只。

2.3中和效价测定

对所述DHAV-1、DHAV-3毒株进行上述步骤，按照现行《中国兽药典》三部进行，上述DHAV-1型抗体的中和效价为1:1139，上述DHAV-3型抗体的中和效价为1:1328。中和效价均高于1:1024，开始收集高免蛋，高免蛋存于18℃阴凉库保存。

三、鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备

3.1分离蛋黄：将上述检测合格的高免蛋取500kg，将蛋壳用新吉尔灭彻底消毒后，进行蛋黄分离，分离蛋黄得蛋黄液约为125kg。

3.2酸化处理：按比例配制醋酸-醋酸盐缓冲液，称量375L注射用水，按比例称量无水乙酸钠0.375kg，1.125升冰乙酸，称量后加入注射用水中，充分搅拌直至完全溶解。溶解后加入重量比是上述注射用水质量的1/3的绞碎的蛋黄液，搅拌充分搅拌30min。

3.3辛酸处理：按比例缓慢加入辛酸20L至蛋黄液中，充分搅拌60min。

3.4离心：将辛酸处理后的物料转入管式连续离心机，4℃，14000r/min离心，离心液转入另一储存罐中，收获离心液体积约为375L。

3.5板框过滤：将上步储存罐中的离心液通过25张微孔滤膜，滤液转入另一储存罐中，收获滤液约为370L。

3.6灭活：向储存罐滤液中加入甲醛0.185L，密封60min。

3.7超滤去除病毒：将灭活后的液体用截除分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒，转入另一储存罐中。

3.8配液：向储存罐中加入0.37L的吐温-80，之后用4％的氢氧化钠调整pH值到6.8。

3.9过滤除菌：用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，即得鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体原液，2～8℃储存。

实施例1鸭病毒性肝炎DHAV-1型和DHAV-3型二价精制蛋黄抗体的制备

1)分离蛋黄：将上述检测合格的DHAV-1型和DHAV-3型高免蛋各取250kg，共500kg，将蛋壳用新吉尔灭彻底消毒后，进行蛋黄分离，分离蛋黄得蛋黄液约为125kg。

2)酸化处理：按比例配制醋酸-醋酸盐缓冲液，称量375L注射用水，按比例称量无水乙酸钠0.375kg，1.125升冰乙酸，称量后加入注射用水中，充分搅拌直至完全溶解。溶解后加入重量比是上述注射用水质量的1/3的绞碎的蛋黄液，搅拌充分搅拌30min。

3)辛酸处理：按比例缓慢加入辛酸20L至蛋黄液中，充分搅拌60min。

4)离心：将辛酸处理后的物料转入管式连续离心机，4℃，14000r/min离心，离心液转入另一储存罐中，收获离心液体积约为375L。

5)板框过滤：将上步储存罐中的离心液通过25张微孔滤膜，孔径为0.22μm，滤液转入另一储存罐中，收获滤液约为370L。

6)灭活：向储存罐滤液中加入甲醛0.185L，密封60min。

7)超滤去除病毒：将灭活后的液体用截除分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒，转入另一储存罐中。

8)配液：向储存罐中加入0.37L的吐温-80，之后用4％的氢氧化钠调整pH值到6.8。

9)过滤除菌：用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，即得鸭病毒性肝炎二价精制蛋黄抗体原液，2～8℃储存。

实施例1的成品检验：

1)物理性状：略带棕色或淡黄色的透明液体，pH值为6.87，符合规定。

2)无菌检验：按现行《中国兽药典》三部进行，无菌生长。

3)支原体检验：按现行《中国兽药典》三部进行，无支原体生长。

4)外源病毒检验：按现行《中国兽药典》三部进行，无外源病毒无染。

5)安全检查：1日龄健康易感雏鸭5只，各皮下注射2ml；18～22g清洁级小鼠5只，各皮下注射0.5ml。观察10日，雏鸭和小鼠均全部健活。

6)效力检验

①中和试验：按照现行《中国兽药典》三部进行，DHAV-1型抗体的中和效价为1:362，DHAV-3型抗体的中和效价为1:431。

②用雏鸭效检：取4～7日龄雏鸭50只，随机分为3组，每组10只。第1组和第2组各皮下注射实施例1成品0.5ml，第3组和第4组各皮下注射生理盐水0.5ml。24小时后，用鸭病毒性肝炎强毒1型强毒病毒液皮下注射第1组和第3组鸭，用鸭病毒性肝炎强毒3型强毒病毒液皮下注射第2组和第4组鸭，每只0.2ml(约含100LD₅₀)。第5组为空白对照组，不注射任何物品，观察10日。结果见表1。

表1鸭病毒性肝炎二价精制蛋黄抗体效检结果

由表1可见两种强毒攻毒对照组全部死亡，而两组保护组全部健活，表明效力检验合格。

7)甲醛残留量测定按照现行《中国兽药典》三部进行，甲醛残留量符合规定。

8)辛酸含量测定辛酸含量≤0.1％，符合规定。

实施例2鸭病毒性肝炎DHAV-1型精制蛋黄抗体的制备

1)分离蛋黄：将上述检测合格的DHAV-1型高免蛋取250kg，将蛋壳用新吉尔灭彻底消毒后，进行蛋黄分离，分离蛋黄得蛋黄液约为63kg。

2)酸化处理：按比例配制醋酸-醋酸盐缓冲液，称量189L注射用水(蛋黄液重量3倍)，按比例称量无水乙酸钠0.189kg，0.567升冰乙酸，称量后加入注射用水中，充分搅拌直至完全溶解。溶解后加入绞碎的蛋黄液，搅拌充分搅拌30min。

3)辛酸处理：按比例缓慢加入辛酸10L至蛋黄液中，充分搅拌60min。

4)离心：将辛酸处理后的物料转入管式连续离心机，4℃，14000r/min离心，离心液转入另一储存罐中，收获离心液体积约为189L。

5)板框过滤：将上步储存罐中的离心液通过25张微孔滤膜，孔径为0.22μm，滤液转入另一储存罐中，收获滤液约为185L。

6)灭活：向储存罐滤液中加入甲醛0.093L，密封60min。

8)配液：向储存罐中加入0.185L的吐温-80，之后用4％的氢氧化钠调整pH值到6.8。

9)过滤除菌：用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，即得鸭病毒性肝炎DHAV-1型精制蛋黄抗体原液，2～8℃储存。

实施例2的成品检验：

1)物理性状：略带棕色或淡黄色的透明液体，pH值为6.90，符合规定。

2)无菌检验：按现行《中国兽药典》三部进行，无菌生长。

6)效力检验

①中和试验：按照现行《中国兽药典》三部进行，DHAV-1型抗体的中和效价为1:387。

②用雏鸭效检：取4～7日龄雏鸭30只，随机分为3组，每组10只。第1组皮下注射实施例2成品0.5ml，第2组皮下注射生理盐水0.5ml。24小时后，用鸭病毒性肝炎强毒1型强毒病毒液皮下注射第1组和第2组鸭，每只0.2ml(约含100LD₅₀)。第3组为空白对照组，不注射任何物品，观察10日。结果见表2。

表2鸭病毒性肝炎DHAV-1型精制蛋黄抗体效检结果

由表2可见强毒攻毒对照组全部死亡，而第一组作为保护组全部健活，表明效力检验合格。

7)甲醛残留量测定：按照现行《中国兽药典》三部进行，甲醛残留量符合规定。

8)辛酸含量测定：辛酸含量≤0.1％，符合规定。

实施例3鸭病毒性肝炎DHAV-3型精制蛋黄抗体的制备

1)分离蛋黄：将上述步骤2检测合格的DHAV-3型高免蛋取250kg，将蛋壳用新吉尔灭彻底消毒后，进行蛋黄分离，分离蛋黄得蛋黄液约为63kg。

2)酸化处理：按比例配制醋酸-醋酸盐缓冲液，称量189L注射用水(蛋黄液重量3倍)，按比例称量无水乙酸钠0.189kg，0.567升冰乙酸，称量后加入注射用水中，充分搅拌直至完全溶解。溶解后加入重量比是上述注射用水质量的1/3的绞碎的蛋黄液，搅拌充分搅拌30min。

6)灭活：向储存罐滤液中加入甲醛0.093L，密封60min。

9)过滤除菌：用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，即得鸭病毒性肝炎DHAV-3型精制蛋黄抗体原液，2～8℃储存。

实施例3的成品检验：

1)物理性状：略带棕色或淡黄色的透明液体，pH值为6.85，符合规定。

2)无菌检验：按现行《中国兽药典》三部进行，无菌生长。

6)效力检验

①中和试验：按照现行《中国兽药典》三部进行，DHAV-3型抗体的中和效价为1:440。

②用雏鸭效检：取4～7日龄雏鸭30只，随机分为3组，每组10只。第1组皮下注射实施例3成品0.5ml，第2组皮下注射生理盐水0.5ml。24小时后，用鸭病毒性肝炎强毒3型强毒病毒液皮下注射第1组和第2组鸭，每只0.2ml(约含100LD₅₀)。第3组为空白对照组，不注射任何物品，观察10日。结果见表3。

表3鸭病毒性肝炎DHAV-3型精制蛋黄抗体效检结果

由表3可见强毒攻毒对照组全部死亡，而保护组全部健活，表明效力检验合格。

8)辛酸含量测定：辛酸含量≤0.1％，符合规定。

临床应用实施例

实施例4山东省沂南县某小型养鸭场，购入4000只鸭苗，起初两天雏鸭精神状态良好，于第三天发生雏鸭零星死亡，第四天死亡率达到近15％，发病鸭精神委顿，食欲减退或废绝，有些雏鸭表现扭头，转圈，抽搐，两腿成划水样，死后的雏鸭呈角弓反张姿势。现场对死亡雏鸭解剖发现，肝脏严重出血，有大量弥散性出血点或出血斑，有的呈刷状出血。经判定为鸭病毒性肝炎，同时结合实验室对当地的血清型检测结果(鸭肝炎DHAV-1型和DHAV-3型混感)及时给出了临床治疗方案。

1.临床试验方案

将剩余的约3300只雏鸭随机分为三组，第一组为约300只，投以抗病毒药，联合抗生素使用；第二组约1500只，在同第一组投药的基础上，每只鸭肌肉注射某公司鸭病毒性肝炎DHAV-1型精致蛋黄抗体1.5ml；第三组约1500只，在同第一组投药的基础上，每只鸭肌肉注射本发明鸭病毒性肝炎二价精制蛋黄抗体1.5ml，连续观察十天，观察结果见下表4。

表4雏鸭用药后观察十天各试验组死亡情况统计

2.实验室检测

通过RT-PCR检测方法，对采集的病料进行检测，由图1可知，用鸭肝炎病毒1型引物扩增时，1型阳性对照有特异性条带出现，而已知三个阴性对照均无条带出现，待检样品有特异性条带，说明待检鸭肝炎病料有鸭肝炎1型病毒感染；同理，由图2可知，待检鸭肝炎病料有鸭肝炎3型病毒感染，综上结果证明沂南发病鸭场为鸭病毒性肝炎1型和3型混感。

通过上述临床实施例可知，本发明鸭病毒性肝炎二价精制蛋黄抗体对临床鸭肝炎病毒1型和3型混感的治疗效果明显优于传统的鸭病毒性肝炎1型精制蛋黄抗体。本发明可以应用于鸭病毒性肝炎的紧急治疗和预防。

实施例5四川省绵阳市某养鸭户，购入5000只鸭苗，起初两天雏鸭精神状态良好，于第三天发生雏鸭零星死亡，第四天死亡率达到近20％，发病鸭精神委顿，食欲减退或废绝，有些雏鸭表现扭头，转圈，抽搐，两腿成划水样，死后的雏鸭呈角弓反张姿势。现场对死亡雏鸭解剖发现，肝脏严重出血，有大量弥散性出血点，有的呈刷状出血。经判定为鸭病毒性肝炎，同时结合对该区域流行病学调查显示，该区域主要鸭肝炎病毒的流行血清型为DHAV-1型，经与养殖户商议，其同意少部分单纯使用鸭病毒性肝炎DHAV-1型精制蛋黄抗体(0.8ml/只)，为安全起见大部分还是使用了鸭病毒性肝炎DHAV-1型和DHAV-3型二价精制蛋黄抗体(1.5ml/只)。根据当地的血清型检测结果及时给出了临床治疗方案。

临床治疗方案

将剩余的约4000只雏鸭随机分为两组，第一组为约3500只，每只鸭肌肉注射我公司鸭病毒性肝炎DHAV-1型和DHAV-3型二价精致蛋黄抗体1.5ml，同时配合部分抗生素使用；第二组约500只，每只鸭肌肉注射鸭病毒性肝炎DHAV-1型精制蛋黄抗体0.8ml，连续观察十天，观察结果见下表5。

表5雏鸭用药后观察十天各试验组死亡情况统计

由上述治疗方案可见，使用DHAV-1型和DHAV-3型二价精致蛋黄抗体和仅使用DHAV-1型精制蛋黄抗体的治疗效果基本一致，但注射二价抗体的剂量要比单价抗体多出近一倍，相应的成本也就高出一倍，因此，根据流行病学调查结果，使用特异性单价抗体能够节省治疗成本。

实施例6山东省莘县某养鸭户，购入8000只鸭苗，起初三天雏鸭精神状态良好，于第四天发生雏鸭零星死亡，第五天死亡率超过20％，发病鸭精神委顿，食欲减退或废绝，有些雏鸭表现扭头，转圈，抽搐，两腿成划水样，死后的雏鸭呈角弓反张姿势。现场对死亡雏鸭解剖发现，肝脏严重出血，有大量弥散性出血点和出血斑，有的甚至呈“刷状”出血。经本公司多年临床经验的水禽技术专家判定为鸭病毒性肝炎，同时结合对该区域流行病学调查显示，该区域主要鸭肝炎病毒的流行血清型为DHAV-3型，经与养殖户商议，其同意剩余约1/10的雏鸭单纯使用鸭病毒性肝炎DHAV-3型精制蛋黄抗体(0.8ml/只)，剩余的还是使用了鸭病毒性肝炎DHAV-1型和DHAV-3型二价精制蛋黄抗体(1.5ml/只)。根据当地的血清型检测结果及时给出了临床治疗方案。

临床治疗方案

将剩余的约6300只雏鸭随机分为两组，第一组为约5700只，每只鸭肌肉注射我公司鸭病毒性肝炎DHAV-1型和DHAV-3型二价精致蛋黄抗体1.5ml，同时配合部分抗生素使用；第二组约600只，每只鸭肌肉注射鸭病毒性肝炎DHAV-3型精制蛋黄抗体0.8ml，连续观察十天，观察结果见下表6。

表6 雏鸭用药后观察十天各试验组死亡情况统计

由上述治疗方案可见，使用DHAV-1型和DHAV-3型二价精致蛋黄抗体和仅使用DHAV-3型精制蛋黄抗体的治疗效果基本一致，但注射二价抗体的剂量要比单价抗体多出近一倍，相应的成本也就高出一倍，因此，根据流行病学调查结果，使用特异性单价抗体能够节省治疗成本。

通过临床应用实例可知，使用DHAV-1型和DHAV-3型二价精致蛋黄抗体和仅使用DHAV-3型精制蛋黄抗体的治疗效果基本一致，但注射二价抗体的剂量要比单价抗体多出近一倍，成本也高出一倍，所以实施例2、实施例3使用相应血清型的抗体能够显著减少使用成本，为优选方法。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较优实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、增添、等同替换和优化改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：分离鸭病毒性肝炎毒株和制备灭活疫苗；所述灭活疫苗免疫无病产蛋鸡群得到高免蛋，分离蛋黄后经酸化处理、辛酸处理、离心、板框过滤、灭活、超滤、配液、过滤除菌后得到鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体；

所述步骤具体为：

1)分离鸭病毒性肝炎毒株和制备灭活疫苗：选取鸭病毒性肝炎毒株接种鸭胚，分离筛选到免疫原性较好的血清型的病毒，制备灭活疫苗；

2)所述灭活疫苗免疫健康产蛋鸡群得高免蛋：所述灭活疫苗免疫鸡群，第一次免疫1ml/只，两周后第二次免疫2.0ml/只，两次免疫后测定中和效价，效价合格后每5-6周加强免疫一次，每次2.0ml/只，得到高免蛋的蛋黄；

3)酸化处理：将所述蛋黄按照1:3的比例加入到缓冲液中，充分搅拌20-30min；

4)辛酸处理：将辛酸按照3％-5％加入到经过酸化处理的蛋黄液中，充分搅拌30-60min；

5)离心：将步骤4)中得到的蛋黄液用管式连续离心机离心进行固液分离，4℃，14000r/min，离心分离得到上清液；

6)板框过滤：将所述上清液用20-30张板框过滤，得到澄清液；

7)灭活：将所述澄清液加入到浓度为0.05％的甲醛灭活，密封灭活60min；

8)超滤：用截除分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒；

9)配液：用4％的氢氧化钠调整pH值至6.8，加入终浓度为0.05-0.15％的吐温-80稳定剂；

10)过滤除菌：用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，即得；

所述鸭病毒性肝炎毒株为鸭病毒性肝炎1型(DHAV-1)和鸭病毒性肝炎3型(DHAV-3)毒株中的一种或两种；所述鸭病毒性肝炎1型的所述免疫原性较好的血清型病毒为鸭肝炎病毒SD-1株，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC V201440；所述鸭病毒性肝炎3型的所述免疫原性较好的血清型病毒为鸭肝炎病毒SD-3株，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC V201441。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鸭病毒性肝炎毒株的含毒量≥106.8ELD50/ml。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鸭病毒性肝炎毒株的血清型抗体中和效价高于1：1024时开始收获高免蛋，若低于1：1024进行第三次免疫。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为蛋黄液-醋酸-醋酸盐缓冲液，所述蛋黄液与醋酸-醋酸盐缓冲液比例为1:3，所述醋酸-醋酸盐缓冲液中含冰乙酸0.27-0.31％、无水乙酸钠0.08-0.1％。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，无水乙酸钠添加量为0.1％，冰乙酸的添加量为0.3％。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述板框数量为25张。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吐温-80的添加量为0.1％。