CN105367654A - 一种i型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法，该方法先收集I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋蛋黄进行初步灭活，而后以醋酸盐缓冲液进行初步酸化萃提，再以辛酸作为灭活剂和萃提剂进行二次灭活，在此基础上进行过滤澄清、过滤除菌，最后经超滤浓缩后以甲醛进行三次灭活，最终得到卵黄抗体溶液。以上通过酸化水-辛酸方法有效降低了产品中脂类的含量，降低了不良反应风险，同时超滤浓缩步骤有助于保证产品抗体效价，提升保护率；较高的抗体效价在未来使用环节需要较高的稀释倍数，从而间接降低了杂质含量，进而提升安全性。

Description

一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎(DuckVirusHepatitis，DVH)是由小RNA病毒科肠病毒属的鸭肝炎病毒(DuckHepatitisVirus，DHV)引起雏鸭的一种急性、高度致死性、烈性传染病。其特征为病鸭痉挛、头向背部后仰、呈角弓反张特异姿势。主要病变特点为肝脏肿大，有大小不等的出血斑、出血点。鸭肝炎病毒有血清型I型、Ⅱ型和Ⅲ型,三个型之间没有抗原相关性。以往在我国流行的主要是I型鸭肝炎病毒，但近几年来，不断有使用I型鸭肝炎弱毒疫苗或高免卵黄抗体进行预防或治疗无效的鸭群爆发疑似鸭肝炎，怀疑为新型鸭肝炎。本病在国内雏鸭群中频频发生，给养殖户带来了极大的经济损失。

卵黄抗体的形成过程是：当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体，IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG。

卵黄抗体浓度高于血清IgG，单个卵黄(约15ml)含200mg左右的卵黄抗体，而且从卵黄中提取抗体较从动物血清中提取抗体简便。除此之外卵黄抗体还有许多重要的理化特性，卵黄抗体在多种环境中有较高的稳定性，在低于75℃的条件下，卵黄抗体具有良好的热稳定性，90℃处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在PH<4时，仅有少量卵黄抗体失去活性。在pH4～12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，在pH>12时，卵黄抗体迅速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4℃保存可达5年以上，活性仅下降5％左右。

对于鸭病毒性肝炎的预防和治疗，目前除了加强消毒和疫苗免疫外，抗体免疫也在控制该病的流行中发挥着重要作用。由于卵黄抗体成本比较低且比较容易获得，所以已广泛使用于一些疾病的预防和治疗。但由于卵黄中含有大量的脂质，若在制备环节中去除不彻底则容易导致使用后发生不良反应，因此卵黄抗体生产工艺中如何除脂成为影响产品品质和安全性的关键环节，现有技术中常用的纯化方法有聚乙二醇法、硫酸葡聚糖法、有机溶剂法、水稀释法、辛酸法等，目前实际应用中显示其脂类去除率仍有待提升。此外，上述方法所纯化得到的卵黄抗体效价不高，在一定程度上制约了疗效。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法，以解决现有技术中相关方法所制备的卵黄抗体中脂类残留量较高的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术的相关方法所制备的卵黄抗体效价较低。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)取I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋卵黄，搅拌均匀得到卵黄液；

2)将步骤1)所述卵黄液与水按1:(0.5～1.5)(v/v)比例混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60～65℃条件下保温25～35min；

3)向卵黄稀释液中加入所述卵黄液体积2.5～3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后滤布过滤收集滤液；

4)向步骤3)所述滤液中加入辛酸至终浓度3.5～4.5％(v/v)，搅拌后于2～8℃放置4～8小时；

5)取步骤4)放置后的溶液过滤至滤液澄清，收集澄清滤液；

6)取步骤5)所述澄清滤液过滤除菌，而后加入甲醛至终浓度0.1％(v/v)，于35～37℃灭活12～20h。

作为优选，步骤1)所述的高免鸡蛋是利用I型鸭肝炎病毒疫苗分4次免疫母鸡后所产鸡蛋，每次免疫间隔2周；进一步优选的，所述免疫是颈部皮下或肌肉注射I型鸭肝炎病毒疫苗。

作为优选，步骤1)所述I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋的卵黄中，I型鸭肝炎病毒抗体效价不低于1:1024。

作为优选，步骤1)中先对所述高免鸡蛋蛋壳消毒，而后再取卵黄；进一步优选的，所述消毒方法是先以1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，蛋壳干燥后再喷洒75％酒精至蛋壳表面。

作为优选，步骤1)中所述的水是先于80℃保持30min，而后冷却至65℃以下的注射水。

作为优选，步骤2)所述的醋酸盐缓冲液pH是4.8～5.2，更优的是5.0。

作为优选，步骤3)所述的搅拌，其持续是30～120min，更优的是90min。

作为优选，步骤3)所述的滤布是丙纶750B滤布。

作为优选，步骤4)所说的搅拌，其持续时间是30～120min，更优的是90min。

作为优选，步骤5)所述的过滤是先以滤布过滤，而后再以滤膜过滤至滤液澄清；进一步优选的，所述滤布是丙纶750B滤布。

作为优选，步骤6)中用于过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。

作为优选，步骤6)除菌后的澄清滤液中I型鸭肝炎病毒抗体效价不低于1:512。

作为优选，步骤6)中除菌后先进行超滤浓缩，而后再加入甲醛灭活；进一步优选的，所述超滤浓缩是利用30～50KD的PES中空纤维超滤膜实现的；进一步优选的，所述浓缩是在2～8℃条件下进行的。

在以上技术方案中，收集高免鸡蛋卵黄后先进行初步灭活，而后以醋酸盐缓冲液进行初步酸化萃提，再以辛酸作为灭活剂和萃提剂进行二次灭活，在此基础上进行过滤澄清、过滤除菌，最后经超滤浓缩后以甲醛进行三次灭活，最终得到卵黄抗体溶液。以上通过酸化水-辛酸方法有效降低了产品中脂类的含量，降低了不良反应风险，同时超滤浓缩步骤有助于保证产品抗体效价，提升保护率；较高的抗体效价在未来使用环节需要较高的稀释倍数，从而间接降低了杂质含量，进而提升安全性。

此外，本发明通过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定工作，最终筛选得到免疫原性较好的I型鸭肝炎病毒HB-34株，选用该毒株作为抗原制备疫苗再用于本发明卵黄抗体的制备，所得产品效价高，保护率突出。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

一、生产用毒株

制苗免疫原用鸭肝炎病毒(Duckhepatitisvirus)I型HB-34株，由瑞普(保定)生物药业有限公司分离、鉴定、保管和供应。

二、疫苗(免疫原)的制备

1.制苗用病毒液的制备

HB-34株病毒液制备将生产用毒种HB-34株作100倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸡胚，置2～8℃放置4～12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。用胚液匀浆后、冻融3次，3000r/min离心10min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。

2.浓缩

将收获的HB-34株病毒液在2～8℃条件下，用膜包对毒液进行浓缩，按现行《中国兽药典》规定进行无菌检验，应无菌生长，并留样备测毒价。每0.1ml病毒含量均应不低于10^5.0ELD₅₀，浓缩后的胚液随即进行灭活。

3.灭活

将浓缩后的HB-34株病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入

另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活24小时(以罐内温度达到37℃开始计时)后取出，置2～8℃保存，应不超过3个月。

4.鸭病毒性肝炎灭活疫苗半成品检验

(1)无菌检验取灭活的浓缩胚液，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(2)病毒含量测定

浓缩后HB-34株病毒含量测定将浓缩后的病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个稀释度，分别尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml。同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.2ml。置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD₅₀。

(3)灭活检验将HB-34株灭活后的病毒液尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚和12～13日龄易感鸡胚各10枚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，连续观察168小时。

5.灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

油相制备取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本-806份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

水相制备将灭活检验合格的HB-34株病毒液适当比例混合，使每0.1ml水相中含HB-34株病毒含量均不低于10^5.0ELD₅₀。取灭菌后的吐温-804份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

乳化水相与油相混合乳化比例为1:1(V/V)，先将油相导入胶体磨，2500转/分钟搅拌，缓慢加入水相，加完后10000转/分钟乳化3～5分钟。在终止乳化前按疫苗总量0.01％加入硫柳汞，充分振荡混匀。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相≤0.5ml。

二、高免蛋的制备

1.免疫程序颈部皮下或肌肉注射

基础免疫：于开产前2～3周做基础免疫，2ml/只；

第2次免疫：基础免疫后2周，加强免疫，2ml/只；

第3次免疫：第2次免疫后2周，加强免疫2ml/只；

加强免疫：第3次免疫后2周，加强免疫2ml/只；

2.高免蛋收集

加强免疫后第14日，测定卵黄中I型鸭肝炎病毒的中和抗体效价。抗体效价均不低于1:1024为合格。收集高免鸡蛋，2～8℃贮存备用，贮存时间应不超过7日。

三、鸭病毒性肝炎卵黄抗体制造

1.卵黄抗体制造

(1)将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min。取出消毒后的鸡蛋自然晾干或吹干，喷洒75％的酒精对蛋壳表面消毒后备用。

(2)卵黄分离采取机械打蛋。打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

(3)灭活Ⅰ将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水(注射用水先经80℃30min消毒，并冷却至65℃以下)，搅拌混匀后，60～65℃保温(灭活)30min。

(4)酸化萃提先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄3倍体积的PH值5.0的醋酸缓冲液，然后加入卵黄液，开启搅拌机搅，拌搅90分钟后，用丙纶750B滤布过滤收集滤液。

(5)灭活Ⅱ卵黄液液中加入终浓度(V/V)为4％的辛酸作灭活剂和萃提剂，剧烈搅拌90分钟，2～8℃放置4～8小时。

(6)粗滤用丙纶750B滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。

(7)除菌过滤用0.22μm微孔芯过滤除菌。置2～8℃存放，应不超过14日。同时取样检测I型鸭肝炎病毒的中和抗体效价。

(8)浓缩如检测的I型鸭肝炎病毒的中和抗体效价低于1:512，应将除菌过滤后的卵黄抗体在2～8℃条件下，用30～50KD的PES中空纤维超滤膜进行适当倍数的超滤浓缩，浓缩后的I型鸭肝炎病毒中和抗体效价应均不低于1:512。

(9)灭活Ⅲ将过滤后的溶液导入灭活罐中，计量加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度(V/V)为0.1％，37℃灭活16小时。

实施例2

1免疫原制备

1.1制苗用病毒液的制备

HB-34株毒液制备将生产用毒种HB-34株作100倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚100枚，每胚0.1ml，36～37℃孵育，每日2次照胚检查。接种后48～120小时内死亡的鸡胚，置2～8℃放置4～12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。用胚液匀浆后、冻融3次，3000r/min离心10min，取上清混合于无菌容器中，置2～8℃保存。(参见表1)。

表1毒液的制备

毒株名称	胚品种	接种胚数(枚)	胚日龄	收获毒液(ml)
					HB-34株	SPF鸡胚	100	10	1140

1.2浓缩

将收获的HB-34株病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机分别浓缩至原体积的1/3，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无菌生长，并留样备测毒价。HB-34株病毒液每0.1ml病毒含量应≥10^5.0ELD₅₀，浓缩后的胚液随即进行灭活。(参见表2)。

表2毒液浓缩

1.3灭活

将浓缩后的HB-34株病毒液导入灭活罐内，加入10％甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃密封灭活24小时(以罐内温度达到37℃开始计)，其间每隔4～6小时搅拌一次，灭活后置2～8℃保存。

1.4灭活苗制备

(1)油相制备取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本-806份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

(2)水相制备将灭活检验合格的HB-34株96份加入4份灭菌吐温-80，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化水相与油相混合乳化比例为1:1(V/V)，先将油相导入胶体磨，2500转/分钟搅拌，缓慢加入水相，加完后10000转/分钟乳化5分钟。在终止乳化前按疫苗总量0.01％加入硫柳汞，充分振荡混匀。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。

(4)无菌分装后，轧盖后在2～8℃保存。(参见表3)

表3疫苗乳化和分装

2I型鸭病毒性肝炎卵黄抗体制备

2.1高免蛋的制备

将上述制备的I型鸭病毒性肝炎灭活疫苗免疫蛋鸡，首次免疫每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，14天后进行第二次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，二免后14天进行第三次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，三免后14天进行加强免疫,每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，加强免疫之后14天，采集卵黄测定I型鸭病毒性肝炎中和抗体效价应≥1:1024。

2.2卵黄抗体制造(参见表4)

(1)蛋壳消毒将18公斤高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min。取出消毒后的鸡蛋自然晾干或吹干，喷洒75％的酒精对蛋壳表面消毒后备用。

(2)卵黄分离采取机械打蛋。打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

(3)灭活Ⅰ将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水(注射用水先经80℃30min消毒，并冷却至65℃以下)，搅拌混匀后，60～65℃保温(灭活)30min。

(4)酸化萃提先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄3倍体积的PH值5.0的醋酸缓冲液，然后加入卵黄液，开启搅拌机搅，充分拌搅30分钟。

(5)灭活Ⅱ卵黄液液中加入终浓度(V/V)为4％的辛酸作灭活剂和萃提剂，剧烈搅拌90分钟，2～8℃放置4～8小时。

(6)粗滤用丙纶750B滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。

(7)除菌过滤用0.22μm微孔芯过滤除菌。置2～8℃存放，应不超过14日。同时取样检测I型鸭肝炎病毒的中和抗体效价。

(8)浓缩如检测的I型鸭肝炎病毒的中和抗体效价低于1:512，应将除菌过滤后的卵黄抗体在2～8℃条件下，用30～50KD的浓缩膜包进行适当倍数的超滤浓缩，浓缩后的I型鸭肝炎病毒中和抗体效价应均不低于1:512。

(9)灭活Ⅲ将过滤后的溶液导入灭活罐中，计量加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度(V/V)为0.1％，37℃灭活16小时。

表4卵黄抗体制造及分装

实施例3

一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋卵黄，搅拌均匀得到卵黄液；

2)将步骤1)所述卵黄液与水按1:0.5(v/v)比例混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60℃条件下保温25min；

3)向卵黄稀释液中加入所述卵黄液体积2.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后滤布过滤收集滤液；

4)向步骤3)所述滤液中加入辛酸至终浓度3.5％(v/v)，搅拌后于2℃放置4小时；

5)取步骤4)放置后的溶液过滤至滤液澄清，收集澄清滤液；

6)取步骤5)所述澄清滤液过滤除菌，而后加入甲醛至终浓度0.1％(v/v)，于35℃灭活12h。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)所述的高免鸡蛋是利用I型鸭肝炎病毒疫苗分4次免疫母鸡后所产鸡蛋，每次免疫间隔2周，所述免疫是颈部皮下或肌肉注射I型鸭肝炎病毒疫苗。

步骤1)所述I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋的卵黄中，I型鸭肝炎病毒抗体效价不低于1:1024。

步骤1)中先对所述高免鸡蛋蛋壳消毒，而后再取卵黄。

步骤2)所述的醋酸盐缓冲液pH是5.0。

步骤3)所述的滤布是丙纶750B滤布。

步骤5)所述的过滤是先以滤布过滤，而后再以滤膜过滤至滤液澄清。

步骤6)中用于过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。

步骤6)除菌后的澄清滤液中I型鸭肝炎病毒抗体效价不低于1:512。

实施例4

一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋卵黄，搅拌均匀得到卵黄液；

2)将步骤1)所述卵黄液与水按1:1.5(v/v)比例混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于65℃条件下保温35min；

3)向卵黄稀释液中加入所述卵黄液体积3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后滤布过滤收集滤液；

4)向步骤3)所述滤液中加入辛酸至终浓度4.5％(v/v)，搅拌后于8℃放置8小时；

5)取步骤4)放置后的溶液过滤至滤液澄清，收集澄清滤液；

6)取步骤5)所述澄清滤液过滤除菌，而后加入甲醛至终浓度0.1％(v/v)，于37℃灭活20h。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)所述的高免鸡蛋是利用I型鸭肝炎病毒疫苗分4次免疫母鸡后所产鸡蛋，每次免疫间隔2周，所述免疫是颈部皮下或肌肉注射I型鸭肝炎病毒疫苗。

步骤1)所述I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋的卵黄中，I型鸭肝炎病毒抗体效价不低于1:1024。

步骤2)所述的醋酸盐缓冲液pH是5.0。

步骤5)所述的过滤是先以滤布过滤，而后再以滤膜过滤至滤液澄清。

步骤6)除菌后的澄清滤液中I型鸭肝炎病毒抗体效价不低于1:512。

实施例5

一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋卵黄，搅拌均匀得到卵黄液；

2)将步骤1)所述卵黄液与水按1:1(v/v)比例混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于62℃条件下保温30min；

3)向卵黄稀释液中加入所述卵黄液体积3倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后滤布过滤收集滤液；

4)向步骤3)所述滤液中加入辛酸至终浓度4％(v/v)，搅拌后于5℃放置6小时；

5)取步骤4)放置后的溶液过滤至滤液澄清，收集澄清滤液；

6)取步骤5)所述澄清滤液过滤除菌，而后加入甲醛至终浓度0.1％(v/v)，于36℃灭活16h。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋卵黄，搅拌均匀得到卵黄液；

2)将步骤1)所述卵黄液与水按1:(0.5～1.5)(v/v)比例混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60～65℃条件下保温25～35min；

3)向卵黄稀释液中加入所述卵黄液体积2.5～3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后滤布过滤收集滤液；

4)向步骤3)所述滤液中加入辛酸至终浓度3.5～4.5％(v/v)，搅拌后于2～8℃放置4～8小时；

5)取步骤4)放置后的溶液过滤至滤液澄清，收集澄清滤液；

6)取步骤5)所述澄清滤液过滤除菌，而后加入甲醛至终浓度0.1％(v/v)，于35～37℃灭活12～20h。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)所述的高免鸡蛋是利用I型鸭肝炎病毒疫苗分4次免疫母鸡后所产鸡蛋，每次免疫间隔2周，所述免疫是颈部皮下或肌肉注射I型鸭肝炎病毒疫苗。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)所述I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋的卵黄中，I型鸭肝炎病毒抗体效价不低于1:1024。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)中先对所述高免鸡蛋蛋壳消毒，而后再取卵黄。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)所述的醋酸盐缓冲液pH是5.0。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)所述的滤布是丙纶750B滤布。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤5)所述的过滤是先以滤布过滤，而后再以滤膜过滤至滤液澄清。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤6)中用于过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤6)除菌后的澄清滤液中I型鸭肝炎病毒抗体效价不低于1:512。