CN107365382A - 一种鸭2型腺病毒病的卵黄抗体及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种防治鸭2型腺病毒病的卵黄抗体，其制备过程中使用的抗原为灭活后的GD株病毒制备的疫苗；所述的鸭2型腺病毒GD株，于2016年6月5日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201633。本发明制备的鸭2型腺病毒病的卵黄抗体安全性良好，未出现由卵黄抗体引起的任何局部和全身不良反应。经过鉴定、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用攻毒后注射法和注射后攻毒法评估卵黄抗体的使用效果。结果显示，本发明中制备的鸭2型腺病毒病的卵黄抗体能够有效的预防和治疗鸭2型腺病毒病的感染，具有很好的商品化开发前景。

Description

一种鸭2型腺病毒病的卵黄抗体及制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种防治鸭2型腺病毒病的卵黄抗体及其制备方法。

背景技术

腺病毒是家禽常见的传染性病原体。禽腺病毒分为三个群：Ⅰ群是从鸡、火鸡、鹅和鸭的呼吸道感染分离出来的禽腺病毒，有共同的群特异性抗原，可分为A、B、C、D、E5个种和12个血清型；鸭2型腺病毒属于Ⅰ群禽腺病毒，是1977年法国匈牙利人从患病番鸭上分离出来的，感染鸭主要表现精神沉郁，下痢，消瘦等症状。近年来，我国养鸭业发展迅速，尤其是散养户较多，一些养鸭设施简陋，消毒意识淡薄及环境卫生不到位等原因，疾病流行情况复杂造成一些新的变异株及不同血清型毒株出现。病毒一旦带入鸭群很难清除，给番鸭养殖业造成严重的经济损失。

目前，国内外仅有预防这种病的商品化的灭活疫苗，一方面，免疫后产生抗体时间长、保护率低、经济价值高；另一方面，鸭群发病时，不能及时、快速治疗。基于以上两点，研制安全有效的卵黄抗体迫在眉睫，必须通过创新技术克服这一问题。发明人筛选了一株变异的优良病毒株来制备疫苗免疫番鸭，采集高免鸭蛋制备卵黄抗体，可用于鸭2型腺病毒病的紧急预防和早期感染的治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种防治鸭2型腺病毒病的卵黄抗体及其制备方法。从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的鸭2型腺病毒病的卵黄抗体，其制备过程中使用的抗原为灭活后的GD株病毒制备的疫苗；所述的鸭2型腺病毒GD株，于2016年6月5日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201633。

本发明所提供的卵黄抗体的制备方法，是将使用的抗原为灭活后的GD株病毒的疫苗免疫番鸭，经分离高免鸭蛋蛋黄、萃取、过滤、灭活精制而成。

其具体制备方法如下：

1)疫苗制备：

将GD株病毒液中加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h，灭活的病毒液与油佐剂1:2混合乳化，得到鸭2型腺病毒病的灭活疫苗；

1)免疫：

第1次免疫：开产前2～3周，1.0ml/只；

第2次免疫：第1次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；

第3次免疫：第2次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；

第4次免疫：第3次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；

第N次免疫：第N-1次免疫后，每隔6～8周，加强免疫1.0ml/只；

3)采蛋第4次免疫后一周开始，每隔5天抽样高免鸭蛋，测定蛋黄中鸭2型腺病毒的琼扩抗体效价，蛋黄琼扩抗体效价≥1:32时收集高免蛋，2～8℃贮存备用，贮存时间不超过14日。

4)精制卵黄抗体制造对高免蛋进行蛋壳消毒、打蛋分离蛋黄、巴氏灭活Ⅰ、酸化萃取、离心分离、辛酸灭活Ⅱ、深滤、甲醛灭活Ⅲ、超滤除病毒、调配总混、过滤除菌得到抗体。

卵黄抗体在制备用于预防和治疗鸭2型腺病毒病的感染的制品中的应用。

本发明制备的鸭2型腺病毒病的卵黄抗体安全性良好，未出现由卵黄抗体引起的任何局部和全身不良反应。经过鉴定、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用攻毒后注射法和注射后攻毒法评估卵黄抗体的使用效果。结果显示，本发明中制备的鸭2型腺病毒病的卵黄抗体能够有效的预防和治疗鸭2型腺病毒病的感染，具有很好的商品化开发前景。

具体实施方式

发明人筛选了发生变异的型腺病毒病毒株，在筛选该毒株的基础上形成了本发明。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1

1、GD株的筛选 2015年发明人成功从广东某养鸭场的鸭群中分离出一株鸭2型腺病毒。经PCR检测和Hexon测序，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1,编码的氨基酸序列为SEQ IDNO:2。通过NCBI BLAST比对分析，分离株Hexon基因与Ⅰ群禽腺病毒属于同一分支，与GenBank数据库中GR株(登录号：NC_024486.1)的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.02％和99.70％。GD株与GR株的Hexon所编码的氨基酸第71位、160位、177位、213位、598位、634位不同，GD株以上六个位点编码的氨基酸分别为缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、异亮氨酸(I)，GR株株以上六个位点编码的氨基酸分别为异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)。GD株与GenBank数据库中I群禽腺病毒的部分核苷酸同源性为31％～88％，详细见表1。

表1 分离的GD株与I群禽腺病毒Hexon基因的核苷酸同源性比较

2 GD株的毒种繁殖 取11～13日龄的番鸭胚，用0.25％胰酶进行消化，加入适量含10％血清的M199培养液进行培养。挑选已长满单层的MDEF，弃掉原培养液，加入终浓度1％毒种(GD株原始毒种第3代)无血清的M199维持液，37℃静置培养60～78h，可出现明显的细胞病变，当细胞病变达80％以上时收获。按此方法连传10代，分别标记为C4～C10代。测定每代次病毒含量。将检验无菌且病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/0.1ml病毒液混合，定量分装，冻干保存。作为基础种子和生产用毒种备用。

3 GD株的抗原制备 按上述“毒种繁殖”方法用生产毒种接种长满单层的MDEF，收获病毒，反复冻融2次，低速离心去沉淀。测定的病毒含量为10^7.75TCID₅₀/0.1ml，大于10^6.0TCID₅₀/0.1ml，判为合格。

4 GD株病毒液的灭活及检验

将合格的GD细胞病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

将灭活后的病毒液作10倍稀释，接种已长满单层的MDEF(24孔细胞板)4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.0ml；同时设未接种的鸭胚成纤维细胞作空白对照，37℃、5％CO2培养箱培养，观察168小时。将培养物收获反复冻融后盲传一代，继续培养120小时。结果所有细胞孔均没有出现CPE，说明灭活完全。

5 灭活疫苗的制备 将灭活彻底的抗原液制备成水相，白油制备成油相。取油相2份导入乳化罐中，开动电机低速搅拌，同时徐徐加入水相1份后，1000r/min，乳化30分钟，即成油乳剂灭活疫苗。

6 安全检验 皮下免疫1日龄番鸭10只，每只颈部皮下分点注射疫苗1.0ml，观察21d，生长发育均正常，精神状态良好，且不出现注射疫苗引起的明显局部或全身反应。

7 疫苗免疫效果检测

7.1 血清学方法和免疫攻毒法 取21日龄番鸭20只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另10只不接种，作为对照，接种后21～28日采血，分离血清，用鸭2型腺病毒GD株测定血清的琼扩抗体效价，免疫组琼扩抗体9/10阳性，对照组全部为阴性。免疫后21～28日，所有免疫鸭和对照鸭，肌肉注射病毒液(约含10^6.0TCID₅₀/0.1ml)，每只0.2ml。观察并详细记录免疫鸭和对照鸭的发病情况。

结果显示：免疫组28日及以后琼扩抗体均≥9/10阳性，对照组鸭全部为阴性；免疫鸭攻毒后观察14日，保护数均不少于9只；对照鸭攻毒7日内全部发病，死亡9只，死亡鸭(死亡后剖检)及发病鸭(攻毒后7日剖检)剖检病理变化：均出现典型的肝脏肿大和坏死，脾脏、肾脏等多个器官坏死。

与此同时，用目前市场上出售的Ⅰ群鸭2型腺病毒疫苗进行免疫，免疫组28日琼扩抗体均≤3/10阳性，再用本发明筛选的GD株进行攻毒实验；免疫鸭攻毒后观察14日，保护数均≤4/10只；对照鸭攻毒7日内全部发病，死亡9只，剖检病理变化：均出现典型的肝脏肿大和坏死，脾脏、肾脏等多个器官坏死。对比试验表明：目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明的GD株制备的灭活疫苗的效果；推测是由于GD株基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。

实施例2

精制卵黄抗体的制造

1 高免鸭蛋的生产 鸭场抽样检验应无鸭瘟、鸭病毒性肝炎、小鹅瘟、番鸭细小病毒病禽副黏病毒和禽流感等疾病感染，按科学免疫程序适时接种病毒和细菌等疫苗。按常规在饲料中添加抗菌药物防制细菌感染及添加抗球虫药预防球虫感染等。

2 免疫程序

第1次免疫：开产前2～3周，1.0ml/只；

第2次免疫：第1次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；

第3次免疫：第2次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；

第4次免疫：第3次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；

第N次免疫：第N-1次免疫后，每隔6～8周，加强免疫1.0ml/只。

3 采蛋 第4次免疫后第10天开始，每隔五天抽样测定高免鸭蛋黄中鸭2型腺病毒抗体效价。蛋黄琼扩抗体效价≥1:32时收集高免蛋，2～8℃贮存备用，贮存时间不超过14日。

4 精制卵黄抗体制造

4.1 蛋壳消毒 将鸭蛋浸入42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟。蛋壳污染严重的，事先选出，单独消毒并用清水冲洗干净后，再浸泡消毒一次。随后，鸭蛋浸入水温95℃以上的水浴中消毒5秒种，取出后晾干或吹干备用。

4.2 打蛋分离蛋黄 采取手工或机械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。

4.3 灭活Ⅰ 将蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入适量的注射用水，充分搅拌均匀后，60℃～65℃加热灭活10～15分钟。灭活后，水浴冷却至30℃一下。

4.4 酸化萃提 于酸化反应罐中加入相当于原蛋黄体积4倍的注射用水，用1mol/L盐酸将pH调为4.2～4.3，并降温至2～4℃。然后，将灭活Ⅰ的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时。

4.5 离心分离 将酸化萃取液冷冻离心，去除沉淀，分离上清液备用。

4.6 灭活Ⅱ 加入辛酸至终浓度为0.02％，搅拌混匀，室温放置2～4小时。

4.7 粗滤及深滤 用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤澄清。

4.8 灭活Ⅲ 按终浓度为0.05％加入甲醛溶液于浓缩液中，充分搅拌混匀，密封30～60分钟。

4.9 超滤除病毒 用截除分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒。

4.10 调配总混 加入吐温-80至终浓度为0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为6.4～7.2。

4.11 除菌过滤 用0.22μm微孔滤芯过滤除菌。

5 组批与分装 无菌混合组批，混合时应多加入20％抗体，无菌定量分装。

实施例3

卵黄抗体安全性试验

1 用1日龄健康易感雏番鸭5只，各皮下注射本品2ml，逐日观察14日，均不出现因注射本品引起的死亡或明显的局部反应或全身反应。

2 用体重18～22g的小鼠5只，各皮下注射本品0.5ml，观察7天，小鼠均应全部健活。

实施例4

卵黄抗体的应用

1 鸭2型腺病毒病精制卵黄抗体的琼脂扩散试验

1.1 琼脂板制备 称取琼脂糖1.0g，NaCl 8g，加入100ml pH7.2的PBS中，再加入1％的叠氮纳或硫柳汞1ml，68.94kPa灭菌10min，待冷却至50℃时倒入平皿，琼脂厚度为2.5mm，凝固后置4℃保存备用。

1.2 AGP试验 用直径3mm的金属打孔器按六角形图案打孔或用梅花形打孔器打孔。中心孔与外周孔距离约为3mm。中心孔加满标准阳性血清(或标准抗原)，周围孔加满不同稀释度待检表达产物及标准琼扩抗原(或待检血清)。在37℃放置24～48小时，观察结果。

1.3 结果判定 以抗原抗体相融合，出现明显沉淀线且待检抗原(或待检血清)与标准抗原(或标准阳性血清)沉淀线相吻合判为阳性。中心孔与待检孔之间出现免疫沉淀线的最高稀释度为待检抗原(或待检血清抗体)滴度，AGP琼扩抗体效价应≥1:8。

实测结果为1：8，所以制备每个批次的卵黄抗体的AGP琼扩抗体效价标准为1:8。

2 鸭2型腺病毒病精制卵黄抗体的最小预防剂量的试验

为了确定鸭2型腺病毒病精制卵黄抗体对番鸭的最小预防剂量，实验室制备3批生物制品2016001、2016002、2016003随机挑取一批进行试验。28日龄番鸭60只，以0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml剂量颈部皮下注射28日龄番鸭，对照组接种生理盐水，24小时后，用病毒液攻击所有接种抗体组和对照组。每只攻毒0.2ml(10^6.0TCID₅₀/0.1ml)。同时设置健康对照组。观察每组SPF鸡发病、死亡情况至168小时。结果见表2。

表2 28日龄番鸭卵黄抗体不同注射剂量与攻毒试验

结果表明，从表2可以看出，对28日龄番鸭，随着免疫剂量的增加，保护率也相应升高。0.2ml注射组保护率≥8/10，攻毒对照组番鸭全部发病，健康对照番鸭均健活。生理盐水对照鸡48小时开始发病死亡，168小时内10只鸡全部发病，对发病鸡进行剖检，均可发现肝肾肿大、出血等特征性病理变化。健康对照10/10健活，因此本发明精制卵黄抗体对28日龄SPF鸡的最小预防剂量是0.2ml。

为保证产品在实际生产中的使用效果建议预防用量为：21日龄以下的番鸭0.5ml/只，21日龄以上的番鸭1.0ml/只。

2鸭2型腺病毒病精制卵黄抗体最小治疗剂量试验

为了确定鸭2型腺病毒病精制卵黄抗体对番鸭的最小治疗剂量，实验室制备3批生物制品2016001、2016002、2016003随机挑取一批进行试验。28日龄番鸭80只，取70只番鸭，每只番鸭攻毒0.2ml(约10^6.0TCID50/0.1ml)，12小时后，用2016002批次卵黄抗体分别以0.2ml、0.4ml、0.8ml剂量分组注射28日龄番鸭各20只，每组的20只番鸭分成2组，10只/组，分别为卵黄抗体注射1次、2次，每次注射间隔24小时。同时各设28日龄注射生理盐水攻毒对照番鸭10只、健康对照番鸭10只。观察每组番鸭发病、死亡情况至攻毒后168小时。将全部番鸭扑杀、剖检观察病变。

表3 28日龄番鸭攻毒后与卵黄抗体不同治疗剂量试验

结果表明：从表3可以看出，28日龄番鸭注射一次0.2ml保护率为5/10，注射2次的保护率为7/10，≥0.4ml剂量1～2次保护率均≥8/10。非治疗组10/10死亡，健康对照组10/10健活，解剖死亡鸭和发病鸭具有典型的特征。经过对其病料进行PCR鉴定为阳性。因此，我们确定鸭2型腺病毒病精制卵黄抗体对28日龄鸭的单次注射的最小治疗剂量为0.4ml，严重者隔日注射一次，效果更好。

为保证卵黄抗体的应用效果，在实际生产中，影响抗体效果的因素很多，建议使用剂量为：21日龄以下的番鸭1.0ml/只，21日龄以上的番鸭1.5ml/只。严重病患番鸭可隔日连续使用1次。

3 比较本产品与同类产品的使用效果

2015～2017年，在华南地区，围绕鸭2型腺病毒进行了流行病学调查。主要发现南方部分地区的鸭群出现鸭2型腺病毒临床症状，剖检发现肝脏、脾脏出血，肝脏坏死等病变。大多数鸭群处于自然感染的潜伏期，特别是其他疾病使鸭群的健康恶化。针对以上情况，制备4批生物制品2016001、2016002、2016003、2016004，与目前国内外已报道并且在市场上销售的Ⅰ群鸭2型腺病毒病的卵黄抗体进行了对比使用，注射剂量来根据抗体的说明书进行使用，预防使用结果见表4，用于治疗的结果见表5。

表4 2016～2017年南方部分鸭场使用卵黄抗体的预防效果

由表4可见，对比本产品与同类产品的预防使用效果，在湛江地区同一个鸭群使用两种抗体7天，使用本品的死亡率为0.7％，同类产品的死亡率为34.3％，死亡率明显差异。比较湛江和安庆两个地区，使用本品后也出现鸭群的死亡，这可能与鸭群的应激反应、其他继发疾病等有关。说明本品比同类产品的预防效果好。

表5 2016～2017年南方部分鸭场使用卵黄抗体的治疗效果

由表5可见，同一地区，同一个鸭群，使用本品后鸭群的治愈率在85％以上，比同类产品的治愈率高。不同地区不同鸭群，本品比同类产品的治愈率高9％以上。抗体注射2次比注射1次治愈率明显提高。使用抗体后都出现鸭群的死亡，这可能与鸭群的应激反应、其他继发疾病等有关。

以上试验结果表明，本发明的鸭2型腺病毒病的蛋黄抗体安全性好、预防效果好、治愈率高，可以大规模的用于临床上治疗鸭2型腺病毒病，具有重大的经济和社会效益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，其他的任何未背离本发明精神和原则之内，所做的改变、修饰、替代、组合等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东信得科技股份有限公司 青岛信得药业有限公司

<120> 一种鸭2型腺病毒病的卵黄抗体及制备方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2823

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

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taa 2823

<210> 2

<211> 940

<212> PRT

<213> 2

<400> 2

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50 55 60

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100 105 110

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275 280 285

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290 295 300

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Gly Met Asn Val Val Val Ala Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser

325 330 335

Tyr Gln Tyr Met Leu Ala Asp Met Met Ser Arg His His Tyr Phe Ala

340 345 350

Leu Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp His Asp Val Arg Val Phe

355 360 365

Asn Asn Asp Gly Tyr Glu Asp Ser Val Ser Gly Tyr Ala Phe Ala Pro

370 375 380

Asn Gly Leu Gly Asn Lys Thr Gly Leu Leu Tyr Thr Lys Leu Lys Val

385 390 395 400

Met Val Thr Asp Gln Ser Thr Gly Glu Ile Thr Ser Gln Thr Glu Val

405 410 415

Thr Pro Thr Thr Ser Ser Ala Phe Gly Val Gly Asn Val Pro Ser Tyr

420 425 430

Glu Ile Asn Ile Pro Ala Ile Met Lys Arg Asn Phe Ile Met Ser Asn

435 440 445

Ile Ala Asp Tyr Leu Pro Asp Lys Tyr Lys Val Ser Ile Asp Asn Thr

450 455 460

Asp Gly Val Asp Pro Ser Ser Tyr Glu Tyr Met Asn Lys Arg Val Pro

465 470 475 480

Leu Thr Asn Val Val Asp Leu Phe Thr Asn Ile Gly Ala Arg Trp Ser

485 490 495

Val Asp Gln Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Trp

500 505 510

Gly Leu Lys Tyr Arg Ser Gln Leu Leu Gly Asn Ser Arg Tyr Cys Pro

515 520 525

Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys Tyr Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu

530 535 540

Leu Leu Pro Gly Thr Tyr Thr Tyr Glu Trp Val Leu Arg Lys Asp Pro

545 550 555 560

Asn Met Val Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asn Leu Arg Glu Glu Ala

565 570 575

Lys Ile Thr Phe Ser Glu Val Asn Leu Met Ala Ser Phe Met Pro Met

580 585 590

Asp His Asn Thr Ser Thr Gln Leu Glu Leu Met Met Arg Asn Ala Thr

595 600 605

Asn Asp Gln Thr Phe Met Asp Tyr Leu Gly Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

610 615 620

Ser Ile Pro Ala Gly Gln Gln Gln Ile Ile Ile Asn Ile Pro Ala Arg

625 630 635 640

Thr Trp Glu Gly Met Arg Gly Trp Ser Phe Thr Arg Leu Lys Thr Lys

645 650 655

Glu Thr Pro Gln Gln Gly Ala Gln Tyr Asp Val Gly Phe Lys Tyr Ser

660 665 670

Gly Ser Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe

675 680 685

Arg Asn Met Ser Val Leu Phe Asp Thr Ser Ile Asn Trp Pro Gly Asn

690 695 700

Asp Arg Leu Met Ser Pro Asn Met Phe Glu Ile Lys Arg Pro Gln Ser

705 710 715 720

Ala Asp Ser Glu Gly Phe Thr Met Ser Gln Ser Asp Ile Thr Lys Asp

725 730 735

Trp Phe Leu Ile Gln Met Ala Thr Asn Tyr Asn Phe Val Tyr Asn Gly

740 745 750

Tyr Arg Phe Trp Pro Asp Arg His Tyr Phe Gln Tyr Asp Phe Leu Arg

755 760 765

Asn Phe Asp Pro Met Thr Arg Gln Tyr Pro Leu Phe Thr Thr Ser Asn

770 775 780

Lys Leu Tyr Asp Leu Leu Ser Tyr Asp Asn Ser Pro Ser Ala Leu Val

785 790 795 800

Lys Gln Asp Tyr Val Arg Asn Asn Ser Gly Phe Ile Pro Pro Arg Asp

805 810 815

Glu Pro Val Ser Asn Ser Val Gln Gly His Ala Trp Pro Ala Asn Trp

820 825 830

Pro Tyr Pro Leu Ile Gly Lys His Cys Val Asp Pro Ser Asn Ile Leu

835 840 845

Asn Tyr Lys Lys Phe Leu Cys Asp Asn Tyr Leu Trp Thr Ile Pro Phe

850 855 860

Ser Ser Asp Phe Met Tyr Met Gly Glu Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn

865 870 875 880

Pro Met Tyr Thr Asn Asn Ser His Ser Met Val Ile Asn Phe Glu Val

885 890 895

Asp Pro Met Asp Glu Asp Thr Tyr Leu Tyr Met Leu Tyr Gly Val Phe

900 905 910

Asp Ala Val Arg Val Asn Gln Pro Glu Arg Asn Val Leu Ala Met Ala

915 920 925

Tyr Phe Arg Thr Pro Phe Ala Thr Gly Asn Ala Val

930 935 940

Claims (5)

1.一种鸭2型腺病毒病的卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体的制备过程中使用的抗原为灭活后的GD株病毒制备的疫苗；其中鸭2型腺病毒GD株的保藏编号为CCTCC No：V201633。

2.保藏编号为CCTCC No：V201633的鸭2型腺病毒GD株在制备卵黄抗体中的应用。

3.权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体是将使用灭活的保藏编号为CCTCC No：V201633的鸭2型腺病毒GD株作为抗原制备的疫苗免疫番鸭，经分离高免鸭蛋蛋黄、萃取、过滤、灭活精制而成。

4.如权利要求1或3所述的卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体的制备方法包括如下的步骤：

1)疫苗制备：

将GD株病毒液中加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h，灭活的病毒液与油佐剂1:2混合乳化，得到鸭2型腺病毒病的灭活疫苗；

2)免疫：

第1次免疫：开产前2～3周，1.0ml/只；

第2次免疫：第1次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；

第3次免疫：第2次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；

第4次免疫：第3次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；

第N次免疫：第N-1次免疫后，每隔6～8周，加强免疫1.0ml/只；

3)采蛋第4次免疫后一周开始，每隔5天抽样高免鸭蛋，测定蛋黄中鸭2型腺病毒的琼扩抗体效价，蛋黄琼扩抗体效价≥1:32时收集高免蛋，2～8℃贮存备用，贮存时间不超过14日；

4)精制卵黄抗体制造对高免蛋进行蛋壳消毒、打蛋分离蛋黄、巴氏灭活Ⅰ、酸化萃取、离心分离、辛酸灭活Ⅱ、深滤、甲醛灭活Ⅲ、超滤除病毒、调配总混、过滤除菌得到抗体。

5.权利要求1所述的卵黄抗体在制备用于预防和治疗鸭2型腺病毒病的感染的制品中的应用。