CN105153303B - 一种防治鸭细小病毒的卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种防治鸭细小病毒的卵黄抗体及其制备方法，所述的卵黄抗体来源于使用鸭细小病毒活疫苗和鸭细小病毒灭活疫苗高强度联合免疫健康蛋鸡的初产蛋，这种卵黄抗体，不仅制备方法易于操作，适合大规模生产，且制备的鸭细小病毒卵黄抗体性质稳定、纯度高、效价高、特异性较强，无药残，温和环保，对鸭细小病毒感染的预防及治疗极具应用价值，为鸭细小病毒卵黄抗体的制备提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品领域，提供了一种防治鸭细小病毒的卵黄抗体及其制备方法。
背景技术
鸭细小病毒是细小病毒的一种，主要侵害1～3周龄的雏鸭，临床以腹泻、呼吸困难和脚软为主要症状，一年四季均有发生，给鸭饲养带来极大的经济损失，是鸭饲养中主要的疾病之一，发病率和死亡率也较高。
2015年3月以来，我国山东、江苏和安徽等地肉鸭群出现了一种疾病，该病以鸭喙发育不良，舌头外伸为特征，本病主要发生在14日龄以上的商品鸭，鸭群发病率为10％-20％，最高可达50％，大群感染率最高可达100％，但该病不造成患鸭死亡。患鸭发育迟缓，体温略升高，喙短，弹性降低，舌肿胀，外伸，感染后期患鸭胫骨和翅骨易发生骨折。该病主要导致鸭群料肉比上升，养殖成本升高，鸭出栏合格率降低。对肉鸭养殖业造成巨大的经济损失。
禽类卵黄中的抗体主要是卵黄免疫球蛋白，与血清抗体相比，卵黄抗体具有许多独特的优点：
(1)无需采血，只需收集免疫种鸭产下的蛋即可纯化得到卵黄抗体；
(2)有良好的稳定性，且耐热耐酸，常温下仍能保持一定的活性；
(3)治疗效果明显，特异性强，且易大规模生产；
(4)安全、高效、无残留、温和环保。
因此，开发一种安全有效的鸭细小病毒卵黄抗体迫在眉睫。
发明内容
针对上述情况，本发明的发明人提供了一种防治鸭细小病毒的卵黄抗体及其制备方法，所述的卵黄抗体来源于使用鸭细小病毒活疫苗和鸭细小病毒灭活疫苗高强度联合免疫健康蛋鸡的初产蛋，这种卵黄抗体，不仅制备方法易于操作，适合大规模生产，且制备的鸭细小病毒卵黄抗体性质稳定、纯度高、效价高、特异性较强，无药残，温和环保，对鸭细小病毒感染的预防及治疗极具应用价值，为鸭细小病毒卵黄抗体的制备提供了新的思路。
发明人首先获得了一株新的鸭细小病毒，命名为鸭细小病毒GT2015株，发明人对该毒株进行了生物保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，生物保藏编号为CCTCC No：V201527，发明人发现该毒株为中等毒力分离株，无法直接作为活疫苗使用，因此发明人将该毒株经鸭胚克隆纯化传代40代次，获得了的一株新的弱毒疫苗株，命名为GT2015v，并对该弱毒疫苗株进行了生物保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，生物保藏编号为CCTCC No：V201528。
在分离获得上述两株毒株的基础上，发明人获得了GT2015的灭活疫苗和GT2015v的活疫苗，利用上述两种疫苗，发明人提供了所述卵黄抗体的制备方法，具体步骤如下：
(1)蛋鸡开产前高免：先后使用鸭细小病毒活疫苗和鸭细小病毒灭活疫苗高强度联合免疫健康蛋鸡；
(2)采集高免初产种蛋：采集经高免的蛋鸡群开产1个月以内的初产蛋；
(3)清洁消毒：将采集到的高免初产种鸡蛋清洁后用消毒液浸泡3-5分钟，晾干；
(4)无菌分离卵黄：在无菌条件下，打开蛋壳，倒出蛋内容物，分离卵黄；
(5)稀释：在无菌条件下，按照体积比为3.5∶6.5的比例向卵黄中加入含有庆大霉素和分析纯甲醛的生理盐水；
(6)搅拌过滤：在无菌条件下将卵黄稀释液搅拌成悬液，然后经50目滤膜过滤；
(7)封装保存：在无菌条件下将滤液分装于经消毒的玻璃瓶或一次性塑料瓶中，盖上胶塞，加封铝盖，贴上标签，保存待用，保存温度为4-8℃或-20℃。
其中稀释是使用的含有庆大霉素和分析纯甲醛的生理盐水，含0.85％NaCl，经1kg/㎝2压力20分钟高压灭菌或煮沸20分钟消毒，加庆大霉素使稀释后庆大霉素终浓度为100IU/mL，再加甲醛使其终浓度为v/v 0.08％。
所述的消毒液为v/v0.1％新洁尔灭消毒水溶液。
本发明提供的卵黄抗体，不仅制备方法易于操作，适合大规模生产，且制备的鸭细小病毒卵黄抗体性质稳定、纯度高、效价高、特异性较强，无药残，温和环保，对鸭细小病毒感染的预防及治疗极具应用价值，为鸭细小病毒卵黄抗体的制备提供了新的思路。
发明人对本发明所公开的鸭细小病毒GT2015和GT2015v进行了生物保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，具体保藏信息如下：
保藏信息
保藏时间：2015年8月28日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心 CCTCC
保藏编号：CCTCC NO：V201527
保藏单位地址：中国武汉大学
分类命名:鸭细小病毒GT2015
保藏时间：2015年8月28日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心 CCTCC
保藏编号：CCTCC NO：V201528
保藏单位地址：中国武汉大学
分类命名:鸭细小病毒GT2015v。
具体实施方式
实施例1 GT2015灭活疫苗的制备
(1)病毒增殖程序 将GT2015株按照0.2mL/胚接种9日龄健康鸭胚，120h后收获病毒尿囊液，-20℃下保存；
(2)病毒的灭活 病毒尿囊液过滤处理，加入甲醛溶液至终浓度为0.1％，然后再37℃灭活16h，期间振摇3-4次，保存于4℃；
(3)灭活疫苗的的制备
a.油相的制备 白油94份、司盘-80 6份，混合后加热，加入硬脂酸铝2份混合均匀，即得油相；
b.水相的制备 吐温-80 4份、灭活浓缩后的病毒抗原液96份，混合均匀，即得水相；
c.混合与乳化 6份油相放入胶体磨中，开动机器慢速搅拌,同时缓慢加入3份水相，加完后以8000-10000r/min乳化3分钟,然后加入1份水相,继续搅拌30秒,在终止搅拌前加入w/v 1％硫柳汞水溶液,使其终浓度w/v为万分之一即得。
实施例2 GT2015v活疫苗的制备
疫苗毒株的增殖：病毒增殖选用发育良好的9日龄健康鸭胚，鸭细小病毒致弱毒GT2015v株，37℃培养5天，收集病毒尿囊液，-20℃保存。
配苗与冻干：将检验合格的鸭细小病毒液与5％蔗糖脱脂乳混合按配苗羽份要求的比例量混合，分装后进行冷冻真空干燥。
实施例3防治鸭细小病毒的卵黄抗体的制备
1.选择90日龄的健康蛋鸡，使用鸭细小病毒油乳剂灭活疫苗进行初次免疫(颈部皮下注射1mL)；间隔7天，使用鸭细小病毒油乳剂灭活疫苗进行第二次免疫(颈部皮下注射2mL)；间隔14天，使用鸭细小病毒油乳剂灭活疫苗进行第三次免疫(颈部皮下注射3mL)；间隔21天，使用鸭细小病毒油乳剂灭活疫苗进行第四次免疫(颈部皮下注射3mL)。第四次免疫后采用琼脂扩散试验检测血清抗体效价达1：64时，收集其所产卵，无菌分离卵黄。
2.稀释：在无菌条件下，按照卵黄和所加生理盐水的比例(体积比)为3.5∶6.5的比例，在卵黄中加入含有庆大霉素和分析纯甲醛的生理盐水；
3.搅拌过滤：在无菌条件下将卵黄稀释液搅拌成悬液，然后经50目滤膜过滤；
4.封装保存：在无菌条件下将滤液分装于经消毒的玻璃瓶或一次性塑料瓶中，盖上胶塞，加封铝盖，贴上标签，保存待用，保存温度为4-8℃或-20℃。
其中，以上所述生理盐水含0.85％NaCl，经1kg/㎝2压力20分钟高压灭菌或煮沸20分钟消毒，加庆大霉素使稀释后庆大霉素终浓度为100IU/mL，再加甲醛使其终浓度为0.08％。
5.安全性检测：从非鸭细小病毒疫区未免疫鸭细小病毒疫苗的鸭场购买的20只1日龄健康雏鸭，随机分为A、B两组，每组各十只。A组雏鸭腿部肌肉注射所提卵黄抗体0.2mL/只，B组雏鸭腿部肌肉注射灭菌生理盐水0.2mL/只。连续饲养观察两周，A、B两组实验鸭均无异常，饮食状态良好。即所制备卵黄抗体无不良刺激反应。
6.保护性试验：取1日龄无鸭细小病毒抗体的健康易感雏鸭30只，均分为甲,乙,丙三组，不同组别的试验雏鸭隔离饲养。甲、乙组试验雏鸭全部肌肉注射发病剂量106EID50的鸭细小病毒中等毒力GT2015株(CCTCC No：V201527)，于第二日，将甲组试验雏鸭肌肉注射鸭细小病毒卵黄抗体制剂稀释液(0.2mL/只)，乙组试验雏鸭不注射鸭细小病毒卵黄抗体，丙组试验雏鸭为对照组，不攻毒也不注射卵黄抗体。三组试验雏鸭均持续饲养，记录发病情况。
7.于20日龄剖杀后，采集肝脏进行病毒核酸检测。临床观察结果显示，甲、丙两组鸭均未出现短喙长舌、胫骨短粗症状，剖杀时未见胸腺出血、肝脏略肿等病变。乙组鸭出现短喙长舌(3/20)、胫骨短粗(12/20),剖杀可见胸腺出血(10/20)，肝脏略肿(8/20)。PCR检测结果显示，乙组鸭肝脏在攻毒后20天均可检测到病毒核酸，而其他两组均为阴性。可见制备的鸭细小病毒卵黄抗体性质稳定、纯度高、效价高、特异性较强，无药残，温和环保，对鸭细小病毒感染的预防及治疗极具应用价值。
Claims (2)
1.一种防治鸭细小病毒的卵黄抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）选择90日龄的健康蛋鸡，使用鸭细小病毒油乳剂灭活疫苗进行初次免疫，颈部皮下注射1mL；间隔7天，使用鸭细小病毒油乳剂灭活疫苗进行第二次免疫，颈部皮下注射2mL；间隔14天，使用鸭细小病毒油乳剂灭活疫苗进行第三次免疫颈部皮下注射3mL；间隔21天，使用鸭细小病毒油乳剂灭活疫苗进行第四次免疫颈部皮下注射3mL；第四次免疫后采用琼脂扩散试验检测血清抗体效价达1：64时，收集其所产卵，无菌分离卵黄；
（2）稀释：在无菌条件下，按照卵黄和所加生理盐水的体积比为3.5∶6.5的比例，在卵黄中加入含有庆大霉素和分析纯甲醛的生理盐水；
（3）搅拌过滤：在无菌条件下将卵黄稀释液搅拌成悬液，然后经50目滤膜过滤；
（4）封装保存：在无菌条件下将滤液分装于经消毒的玻璃瓶或一次性塑料瓶中，盖上胶塞，加封铝盖，贴上标签，保存待用，保存温度为4-8℃或-20℃；
其中所述鸭细小病毒油乳剂灭活疫苗，所采用的毒株为鸭细小病毒GT2015株，其保藏编号为：CCTCC No：V201527。
2.根据权利要求1所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述含有庆大霉素和分析纯甲醛的生理盐水，含0.85% NaCl，经1kg/㎝²压力20分钟高压灭菌或煮沸20分钟消毒，加庆大霉素使稀释后庆大霉素终浓度为100IU/mL，再加甲醛使其终浓度为v/v 0.08%。
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