CN107177001A - 一种防治猪流行性腹泻病的卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗猪流行性腹泻病的卵黄抗体及其制备方法，以猪流行性腹泻病毒灭活疫苗为免疫原，免疫产蛋鸡，收获卵黄液并从中纯化出卵黄抗体，其中的猪流行性腹泻病毒毒株为PEDV/CH/2014，其保藏编号为CGMCC No.10111。本发明制备的卵黄抗体性状良好，易储存，安全性高，具备良好的预防与治疗效果：体外中和试验测定卵黄抗体中和效价可达1：128；临床预防试验可使试验猪的腹泻发病率降低20%，人工感染治愈率达100%。
Description
技术领域
本发明涉及一种卵黄抗体，具体涉及一种防治猪流行性腹泻病的卵黄抗体及其制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的以呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状特征的接触性肠道传染病。本病对2周龄内的哺乳仔猪造成的危害最为严重，致死率可达100%，严重影响养猪业的健康发展。目前尚无特效药物治疗猪流行性腹泻，因此开发有效治疗该病的生物制品是十分必要的。
新生仔猪通过觅食初乳获得母源抗体来抵御流行性腹泻病毒的感染，卵黄抗体与初乳中的母源抗体作用机理相似，通过被动免疫使仔猪获得免疫力，可有效中和消化系统入侵的PEDV，达到保护仔猪的效果；此外，卵黄抗体具有性质稳定，产量高，成本低，适于生产特异性抗体等优点，因此研制猪流行性腹泻卵黄抗体具有一定价值，对仔猪病毒性腹泻的防治具有重要意义。
本发明以临床上新分离到的PEDV流行毒株为免疫原免疫产蛋鸡而获得高效价卵黄抗体，并对制备的卵黄抗体在细胞水平上测定了中和病毒的能力，同时也对其在仔猪上的治疗效果进行了研究，有望为防治猪流行性腹泻提供一种安全有效、易于生产的生物制品。
发明内容
基于以上背景，本发明目的之一是提供一种防治猪流行性腹泻病毒的卵黄抗体。
本发明目的之二是提供一种防治猪流行性腹泻病毒的卵黄抗体的制备与纯化方法。
本发明提供的一种防治猪流行性腹泻病的卵黄抗体，是用免疫原免疫健康产蛋鸡，收获高免蛋卵黄液，再从卵黄液中提取卵黄抗体，其特征在于，所用免疫原为猪流行性腹泻病毒灭活苗，猪流行性腹泻病毒为PEDV/CH/2014株，微生物保藏号为CGMCC No.10111。
本发明涉及的猪流行性腹泻病毒，名称为PEDV/CH/BJ/2014，于2014年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.10111。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
其中，灭活苗制备需要的灭活剂为β-丙内酯。
灭活苗为弗氏完全佐剂疫苗或弗氏不完全佐剂疫苗。
本发明提供的猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：
1）扩大培养猪流行性腹泻病毒：用含10%FBS，1%青链霉素的DMEM细胞培养液培养Vero细胞长至单层；用无菌1×PBS洗涤细胞2次，加入适量无血清DMEM；取PEDV病毒液接种于Vero细胞上，并在DMEM中添加胰酶至终浓度3~5μg/mL形成吸附液；于37℃，5%浓度CO2的条件下吸附1.5h，吸附完成后弃掉吸附液，加入含有浓度为5~10μg/mL胰蛋白酶的无血清DMEM作为维持液，于37℃，5%浓度CO2的细胞培养箱中培养；连续培养48~72h或细胞病变达80%后，收获细胞培养物置于-80℃冰箱，反复冻融3次，收集病毒培养物，经8000转/分钟离心10分钟去除细胞碎片即可；
2）PEDV病毒的灭活：取步骤1）所得病毒液，加入终浓度0.1%-0.2%的β-丙内酯，充分混合均匀后放置在4℃灭活20h-24h，期间每隔2h摇动一次，灭活完成后置37℃放置2h降解β-丙内酯；
3）免疫接种：采用胸部肌肉多点注射，共免疫4次；将灭活后的病毒液加入等量弗氏完全佐剂乳化成的疫苗作为首次免疫的免疫原，免疫剂量1mL，胸肌多点注射；分别间隔两周进行二免、三免和四免，且二免、三免和四免均接种弗氏不完全佐剂疫苗，免疫剂量增至1.5mL、2mL、4mL；
4）抗体效价检测：四免后1周开始每隔1周收集卵黄，利用琼脂扩散试验测定卵黄抗体的效价，待效价达到1:64时收集高免蛋；
5）卵黄抗体的提取纯化：无菌条件下收集高免卵黄液，加入7倍体积pH5.0的酸化水，边加边搅拌，混匀后，于4℃静置3-4h，取分层后的上清液并离心去除残留的不溶物；收集离心后上清，待上清恢复至室温后加入体积比为0.2%的辛酸，充分混匀后于室温静置3-4h，离心取上清，经超滤浓缩后即为提纯的卵黄抗体。
本发明还公开了卵黄抗体在预防治疗猪流行性腹泻中的应用方法。
本发明的PEDV PEDV/CH/2014株是申请人从北京一发病猪场分离到的强毒株，是目前国内的流行毒株，经灭活后其免疫原性好，能够有效抵抗目前流行强毒株的攻击，保护率达90%以上。
本发明制备的猪流行性腹泻病毒卵黄抗体为无色透明液体，无细菌污染，中和抗体效价可达1：128。该卵黄抗体用于人工感染仔猪治愈率达100%；在临床预防试验中，该发明中的卵黄抗体可使试验仔猪的腹泻发病率降低20%。
附图说明
图1 PEDV/CH/BJ/2014分离株S基因系统进化分析结果。
图2 PEDV感染Vero细胞病变图（200×），其中2-1:正常细胞对照；2-2:病料传至第6代时，Vero细胞感染病毒36h后的病变照片，细胞融合成合胞体。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步对本发明进行阐述，以便于本领域的技术人员能更好地理解及实施本发明，但实施例并不作为对本发明的限定。
实施例1 猪流行性腹泻病毒PEDV/CH/2014 S基因进化分析
本发明涉及的猪流行性腹泻病毒，名称为PEDV/CH/BJ/2014，于2014年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.10111。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
利用DNAStar软件对测序结果进行分析，结果表明PEDV/CH/BJ/2014株与我国分离株 2011-BJ-1构成一新的分支，与美国报道株MEX/104/2013、USA/Colorado/2013及KUIDL-PED-2014-007同源性较高；与经典参考株如比利时CV777、韩国毒株DR13等相比，不在同一进化分支上，已经发生了明显的变异，表明我国当前新流行的PEDV野毒株发生了明显的变异，结果见图1。
实施例2 猪流行性腹泻病毒液的制备
参照《中国兽药典》附录对PEDV/CH/BJ/2014病毒液进行无菌、支原体及外源病毒检测，结果无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。
取PEDV/CH/BJ/2014第39代培养物，按0.5%的量接入铺满单层Vero细胞中，吸附1.5 h，弃病毒液，补充含5μg/mL胰酶的维持液，于37℃，5% CO2条件下培养至90%细胞出现病变时收获病毒液，测定毒价，病毒含量为3*10^7 TCID50/mL，将病毒置于-80℃保存备用。
实施例3 PEDV灭活苗的制备
PEDV病毒的灭活：取上述病毒液，加入0.2%的β-丙内酯，充分摇匀，置4℃冰箱灭活24h，期间每隔2h摇动一次，灭活完成后，置37℃灭活降解β-丙内酯，4℃保存备用。取适量灭活后的病毒液接种健康Vero细胞进行灭活检测，连续观察7天，若细胞无病变则说明病毒灭活彻底。
PEDV弗氏完全/不完全佐剂疫苗：取灭活后的病毒液，加入等量的弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂，用玻璃注射器连接三通阀进行乳化，制备好灭活疫苗，4℃保存备用。
实施例3 PEDV卵黄抗体的制备及纯化
1）免疫动物
选用150日龄健康产蛋鸡，进行胸部肌肉多点注射，共免疫4次。首免、二免、三免、四免均间隔两周，其中首次免疫1mL PEDV弗氏完全佐剂疫苗，二免、三免、四免均接种PEDV 弗氏不完全佐剂疫苗，接种剂量分别为1.5mL、2mL、4mL。
2）抗体效价测定
第4次免后1周开始每隔7天收集高免蛋，通过琼脂扩散试验检测卵黄抗体效价，待卵黄抗体效价达到1:64时即可收集卵黄。结果表明第4次免疫后2周卵黄抗体效价逐渐升高，第4次免疫后第4周达到峰值，抗体效价为1:512，维持6周以上。
3）卵黄抗体的纯化
无菌条件下收集高免卵黄液，加入7倍体积酸化水（pH5.0），边加边搅拌，4℃条件下静置4h， 吸取上清，4℃，4000rpm/min离心30min去除残留的不溶物。收集离心后上清，加入0.2%的辛酸，待上清恢复室温后加入0.2%的辛酸，充分混匀后于室温静置3-4h，离心取上清，经超滤浓缩后再经0.22 μm滤膜过滤除菌，即为提纯的卵黄抗体。
4）纯化后卵黄抗体的浓度和效价测定
利用蛋白质定量试剂盒测定纯化抗体的浓度，结果为9.5mg/mL；采用琼脂扩散试验测定纯化后的抗体效价为1:256。此外应用微量中和试验法测定纯化后卵黄抗体的中和效价为1:128。
5）微生物检测
将纯化后的卵黄抗体按照《中国兽药典》的方法进行微生物检测，观察有无细菌生长，结果无细菌生长。
实施例4 安全性检验
取健康小鼠12只，随机分成2组，实验组每只小鼠灌服1mL纯化的卵黄抗体，对照组每只小鼠灌服1mL无菌生理盐水。连续观察72h后剖检小鼠，观察各组织器官是否有病理变化。结果：实验组和对照组小鼠都未出现不良反应，剖检结果与对照组相比，小鼠的心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏及消化道未见异常变化。
实施例5 人工感染治疗效果评价
选取30头未吃初乳的新生仔猪，人工饲养5天，随机分成3组，每组10头，第1组为试验组，第2、3组为对照组。将第1组和第2组仔猪口服流行性腹泻强毒株PEDV/CH/BJ/2014各2mL(病毒含量1*10^4 TCID50/mL)，第3组口服2mL DMEM细胞培养液作为空白对照。连续观察至仔猪开始出现腹泻时开始治疗，第1组肌注本研究制备的卵黄抗体2 mL，每日2次。第2、3组肌注等量生理盐水。观察治疗效果，记录发病及死亡情况。
结果：攻毒后24h-36h，第1组和第2组所有仔猪都出现腹泻症状，第1组在卵黄抗体的治疗后2天腹泻症状减轻，治疗后3~4天基本恢复正常。试验2组在攻毒后第3天开始出现死亡，至攻毒后第5天共死亡6头。空白对照组均未发病，无死亡。
表1仔猪攻毒后不同天数存活情况
| 组别 | 1日 | 2日 | 3日 | 4日 | 5日 | 存活率 |
| 1组治疗组 | 10/10 | 10/10 | 6/10 | 2/10 | 0/10 | 100% |
| 2组非治疗组 | 10/10 | 10/10 | 8/8 | 5/5 | 4/4 | 40% |
| 3组空白对照 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 100% |
注：分母为存活仔猪数量，分子为腹泻仔猪数量。
实施例6 临床预防效果评价
在北京某猪场应用本发明制备的卵黄抗体，检验本抗体的预防效果，选取40头15日龄仔猪，随机分成两组，第1组使用本发明中的卵黄抗体，2mL/天/次；第2组为空白对照。试验持续14天，统计期间每天腹泻发生情况。结果显示：第1组试验期间发生腹泻的仔猪数量为4头，第2组发生腹泻的仔猪头数为12头，见表2，说明卵黄抗体具有一定的预防效果。
表2 腹泻发病率统计表
| 组别 | 14日内发生腹泻仔猪数量 | 发病率 |
| 1组 | 4 | 10% |
| 2组 | 12 | 30% |
Claims (4)
1.一种防治猪流行性腹泻病的卵黄抗体，用免疫原免疫健康产蛋鸡，收获高免蛋卵黄液，再从卵黄液中提取卵黄抗体，其特征在于，所用免疫原为猪流行性腹泻病毒灭活苗，猪流行性腹泻病毒为PEDV/CH/2014株，微生物保藏号为CGMCC No.10111。
2.根据权利要求1所述的卵黄抗体， 其特征在于，所述灭活苗制备需要的灭活剂为β-丙内酯。
3.根据权利要求1或2所述的卵黄抗体，其特征在于，所述灭活苗为弗氏完全佐剂疫苗或弗氏不完全佐剂疫苗。
4.一种权利要求1~3任一项所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，制备过程包括以下步骤：
1）扩大培养猪流行性腹泻病毒：用含10%FBS，1%青链霉素的DMEM细胞培养液培养Vero细胞长至单层；用无菌1×PBS洗涤细胞2次，每个底面积225cm2的细胞培养瓶中加入15mL无血清DMEM；取PEDV病毒液按0.1MOI接种于Vero细胞上，并在DMEM中添加胰酶至终浓度3~5μg/mL形成吸附液；于37℃，5%浓度CO2的条件下吸附1.5h，吸附完成后弃掉吸附液，加入含有浓度为5~10μg/mL胰蛋白酶的无血清DMEM作为维持液，于37℃，5%浓度CO2的细胞培养箱中培养；连续培养48~72h或细胞病变达80%后，收获细胞培养物置于-80℃冰箱，反复冻融3次，收集病毒培养物，经8000转/分钟离心10分钟去除细胞碎片即可；
2）PEDV病毒的灭活：取步骤1）所得病毒液，加入终浓度0.1%-0.2%的β-丙内酯，充分混合均匀后放置在4℃灭活20h-24h，期间每隔2h摇动一次，灭活完成后置37℃放置2h降解β-丙内酯；
3）免疫接种：采用胸部肌肉多点注射，共免疫4次；将灭活后的病毒液加入等量弗氏完全佐剂乳化成的疫苗作为首次免疫的免疫原，免疫剂量1mL，胸肌多点注射；分别间隔两周进行二免、三免和四免，且二免、三免和四免均接种弗氏不完全佐剂疫苗，免疫剂量增至1.5mL、2mL、4mL；
4）抗体效价检测：四免后1周开始每隔1周收集卵黄，利用琼脂扩散试验测定卵黄抗体的效价，待效价达到1:64时收集高免蛋；
5）卵黄抗体的提取纯化：无菌条件下收集高免卵黄液，加入7倍体积pH5.0的酸化水，边加边搅拌，混匀后，于4℃静置3-4h，取分层后的上清液并离心去除残留的不溶物；收集离心后上清，待上清恢复至室温后加入辛酸至体积终浓度0.2%，充分混匀后于室温静置3-4h，离心取上清，经超滤浓缩后即为提纯的卵黄抗体。
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Application publication date: 20170919 Assignee: CHINA TECHNOLOGY EXCHANGE Co.,Ltd. Assignor: BEIJING VICA BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Contract record no.: X2021980013179 Denomination of invention: The invention relates to an egg yolk antibody for preventing and treating porcine epidemic diarrhea and a preparation method thereof Granted publication date: 20210101 License type: Exclusive License Record date: 20211124 |
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Denomination of invention: The invention relates to an egg yolk antibody for preventing and treating porcine epidemic diarrhea and a preparation method thereof Effective date of registration: 20211125 Granted publication date: 20210101 Pledgee: CHINA TECHNOLOGY EXCHANGE Co.,Ltd. Pledgor: BEIJING VICA BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2021110000070 |