CN103554254A - 一种抗人a组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抗人A组轮状病毒鸡卵黄抗体及其制备方法和应用，该方法包括：体外表达纯化人A组轮状病毒结构蛋白VP7或VP8，并免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，分离纯化出VP7或VP8卵黄抗体。制备得到的鸡卵黄抗体可冻干制备成用作预防和治疗轮状病毒感染的抗体干粉。本发明的有益效果：采用基因工程技术体外大量表达重组VP7和VP8抗原，效益高，成本低，场地需求小、环保；避免了传统卵黄抗体制备过程中使用轮状病毒灭活或减毒疫苗所带来的潜在散毒风险，符合动物福利要求；采用本发明制备的卵黄抗体，经无菌检验后，制备成抗体干粉口服生物制剂，对治疗轮状病毒感染性腹泻具显著效果，预防率可达95%以上，见效快、成本低。

Description

一种抗人A组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及卵黄抗体，尤其是一种高效价抗A组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和在预防和治疗轮状病毒感染中的应用。

背景技术

人A组轮状病毒（Rotavirus, RV）是引起婴幼儿感染性腹泻疾病的主要原因，其发病率高、危害严重，严重影响了婴幼儿的发育、营养要求和生存质量[Parashar UD等，2003；阳艳丽等，2011]。无论在发达国家还是发展中国家，轮状病毒所致的胃肠炎都是一个严重的公共卫生问题，该病毒所致的腹泻普遍流行，好发于秋冬季节，几乎所有5岁以下的儿童均发生过RV感染。据估计，每年因轮状病毒感染导致的门诊病例有2500多万人，住院病例200多万人[Tate JE等，2012]，就2004年轮状病毒致死人数据估计达到52.7万（47.5万-58.0万），并且主要发生在低收入国家。

目前，仍然缺少抗轮状病毒的特效药物。临床上一方面纠正水电解质平衡，另一方面以微生态制剂为主要组分的妈咪爱和以蒙脱石为主要组分的思密达进行治疗，但均不能对轮状病毒引起的婴幼儿腹泻进行有效预防和治疗，甚至滥用抗生素加剧肠道菌群的紊乱，进一步引起药物较难控制的肠炎。目前使用的主要是轮状病毒活疫苗，由于该疫苗有增加肠套叠风险和免疫保护局限等问题，致使该疫苗对轮状病毒引起腹泻的预防在发展中国家推广受阻【Patel NC等，2010；Patel MM等，2011；Vesikari T等，2012】。因此研发一种高效安全，易于服用的抗体疫苗，是本病防治急需解决的问题。

卵黄抗体（immunoglobulin yolk, IgY），即产蛋鸡经特定抗原免疫后，产生相应特异性抗体，并转运、储存于卵黄中，形成卵黄抗体。卵黄抗体相当于人的IgG，抗体亲和力比较高。特异性lgY通过与病原的结合，抑制病原菌的生长、运动和粘附作用。卵黄技术近年获得快速发展，在医疗领域具有良好的应用前景[Dias da Silva W等，2010]。IgY已经显示出较好的抗细菌、真菌和病毒效果。口服IgY已被证明能有效替代抗生素治疗因耶尔森菌、肠毒性大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、幽螺杆菌、轮状病毒等感染引起的胃肠道疾病。在我国，lgY在兽药领域获得生产批文的已达到10个，同时已有很多添加lgY的功能性保健食品和卫生消毒产品等上市销售，lgY技术在医疗诊断及治疗通过临床验证已显示出良好效果。

对于轮状病毒的卵黄抗体及相关产品，中国专利申请CN1201693A和CN1435260A均公开了采用野生型轮状病毒株，对其进行病毒细胞培养、病毒纯化和灭活，而制备成灭活病毒苗，通过免疫产蛋鸡获得相应的卵黄抗体。然而，灭活疫苗具有生产要求高、存在灭活不彻底和散毒的危险，同时，由于病毒残存等因素，这些都会对后期卵黄抗体的纯化带来困难。

发明内容

针对以上不足和缺陷，本发明的目的是提供一种抗A组轮状病毒鸡卵黄抗体制备方法。

本发明根据现代分子免疫学理论，分析并选择轮状病毒的主要抗原表位决定簇肽段VP7和VP8作为免疫原，采用基因工程技术实现在体外大量表达轮状病毒VP7和VP8抗原，将纯化的抗原与适宜的佐剂制备成疫苗免疫产蛋鸡，采用常规水稀释-硫酸铵沉淀-超滤法提取高效价的轮状病毒VP7和VP8的卵黄抗体。

本发明的另一目的是提供抗人A组轮状病毒的鸡卵黄抗体在预防和治疗轮状病毒感染中的应用。

本发明采用的技术方案为：

一种抗人A组轮状病毒鸡卵黄抗体的制备方法，包括：体外表达纯化人A组轮状病毒结构蛋白VP7或VP8，并免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，分离纯化出VP7或VP8卵黄抗体。

优选一种抗人A组轮状病毒鸡卵黄抗体的制备方法，包括：PCR扩增人A组轮状病毒的结构蛋白VP7或VP8 DNA序列，将得到的VP7或VP8 DNA序列克隆到原核表达载体pET28a(+)上并转化大肠杆菌表达菌株BL21，诱导表达和纯化VP7或VP8重组蛋白，将VP7或VP8重组蛋白按照体积比1:1与弗氏佐剂混合乳化，肌肉或皮下注射免疫产蛋鸡，每隔一个月加强免疫一次，共2次，第3次免疫后一周开始收集鸡蛋，从蛋黄中分离纯化出抗轮状病毒结构蛋白VP7或VP8的特异性卵黄抗体。

更优选的一种抗A组轮状病毒鸡卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）PCR扩增：设计引物，以包含G4P8血清型全长VP7或VP8的质粒DNA为模板，PCR扩增VP7或VP8 DNA序列；包含G4P8血清型全长VP7或VP8模板DNA序列可以从G4P8血清型人A组轮状病毒 T114株（中国科学院微生物研究所购得）中提取；

（2）蛋白表达纯化：将PCR扩增得到的VP7或VP8 DNA序列克隆到原核表达载体pET28a(+)上，并转化到大肠杆菌表达菌株BL21中，通过0.1-0.7 mM IPTG诱导VP7或VP8重组抗原蛋白的大量表达，诱导表达温度为25-37℃，时间8-12h，离心收集诱导表达后的菌体，按照体积比0.01M PBS ：菌体=10:1，用0.01M PBS悬浮菌体，采用3-6次反复冻融和溶菌酶（终浓度1-10mg/ml）裂解菌体，离心收集沉淀，用含有质量百分比0.8-1.2 %的Triton和1.5-2.5 M尿素的0.01M PBS洗涤去除细胞碎片，获得粗制的包涵体，再用0.01 MPBS洗涤包涵体2-4次，最后按照含有6-8 M尿素的0.01 M PBS缓冲液：包涵体=50:1的体积比溶解包涵体，采用梯度透析的方法复性包涵体得到VP7或VP8重组抗原蛋白；

（3）免疫：将2-10mg/ml VP7或VP8重组抗原蛋白按照体积比1:1与完全弗氏佐剂乳化，2-3点肌肉或皮下注射免疫产蛋鸡，初免剂量为250-500μg/只，每隔一个月加强免疫一次（加强免疫采用不完全弗氏佐剂），共2次，免疫剂量为100-200μg/只，第3次免疫一周以后开始收集鸡蛋，加强免疫后，当抗体滴度低于1:10⁴时，再给予强化免疫，免疫剂量为100-200μg/只即可；

（4）分离纯化卵黄抗体：用水稀释-硫酸铵沉淀-超滤法从蛋黄中分离纯化轮状病毒特异性的VP7卵黄抗体或VP8卵黄抗体。

其中，0.01MPBS由以下组分组成：氯化钠 (NaCl)，8g；磷酸氢二钠(Na2HPO4)，1.16g；磷酸二氢钾(KH2PO4)，0.24g，加800ml ddH₂O，并用1M的HCI或NaOH调pH至7.4, 定容1L，高压蒸汽灭菌，室温保存。

其中，VP7结构蛋白的氨基酸序列如下：SEQ ID NO.1:

Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Val Leu Phe Tyr Leu Ile Ser Phe Val Leu Val Ser Tyr Ile Leu Lys Thr Val Ile Lys Ile Met Asp Tyr Ile Ile Tyr Arg Ile Thr Phe Val Ile Val Val Leu Ser Met Leu Ser Asn Ala Gln Asn Tyr Gly Ile Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser Met Asp Thr Ala Tyr Val Asn Ser Thr Gln Asp Asn Asn Phe Leu Ser Ser Thr Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Ser Glu Ala Pro Thr Gln Ile Ser Asp Thr Glu Trp Lys Asp Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro Thr Gly Ser Val Tyr Phe Asn Glu Tyr Ser Asn Val Leu Glu Phe Ser Ile Asp Pro Lys Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Val Val Leu Ile Arg Phe Ala Ser Gly Glu Glu Leu Asp Ile Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Thr Leu Tyr Tyr Tyr Gln Gln Thr Gly Glu Ala Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Ser Ser Cys Thr Ile Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Thr Leu Gly Ile Gly Cys Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp Ser Glu Lys Leu Ala Ile Ile Asp Val Val Asp Ser Val Asn His Lys Leu Asp Val Thr Ser Thr Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Asn Lys Leu Gly Pro Arg Glu Asn Val Ala Ile Ile Gln Val Gly Gly Ser Asn Ile Leu Asp Val Thr Ala Asp Pro Thr Thr Ser Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Val Asn Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Val Val Asp Tyr Ile Asn Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asp Ser Ser。

VP8结构蛋白的氨基酸序列如下：SEQ ID NO.２:

Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Ser Val Asp Leu Tyr Asp Glu Ile Glu Gln Ile Gly Ser Glu Lys Thr Gln Asn Val Thr Val Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Pro Val Asn Trp Gly His Gly Glu Ile Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Ile Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Thr Pro Pro Ile Asp Tyr Trp Ile Leu Ile Asn Ala Asn Thr Asn Gly Val Val Tyr Glu Ser Thr Asn Asn Ser Asp Phe Trp Thr Ala Val Val Ala Val Glu Pro His Val Ser Pro Val Asp Arg Gln Tyr Thr Val Phe Gly Glu Asn Lys Gln Phe Asn Val Arg Asn Asp Ser Asp Lys Trp Lys Phe Leu Glu Met Phe Arg Ser Ser Ser Gln Asn Glu Phe Tyr Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Asp Thr Lys Leu Val Gly Ile Leu Lys Tyr Gly Gly Arg Ile Trp Thr Phe His Gly Glu Thr Pro Arg Ala Thr Thr Asp Ser Ser Asn Thr Ala Asn Leu Asn Asp Ile Ser Ile Ile Ile His Ser Glu Phe Tyr Ile Ile Pro Arg Ser Gln Glu Ser Lys Cys Asn Glu Tyr Ile Asn Asn Gly Leu Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Leu Ser Leu Ser Ser Arg Ser Ile Gln Tyr Lys Arg Ala Gln Val。

具体地，上述步骤（1）的VP7上游引物为5’-CCGGAATTCTTGCCAATTACTGGATCTAT-3’，下游引物为5’- CCGCTCGAGCATTCGTTCTGTTTGTGGA-3’，所述步骤（1）的VP8上游引物为5’-CCGGAATTCATGGCTTCACTCATTTAT-3’和下游引物为5’- CCGCTCGAGAACTTGTGCCCTCTTATA-3’，所述PCR的退火温度设为53-57 ℃进行PCR扩增；上述步骤（2）的梯度透析的方法复性包涵体包括：将上述步骤（2）中得到的0.1MPBS溶解的包涵体加入到透析袋内，按照透析缓冲液：袋内透析液（即溶解的包涵体液）=10:1体积比，将透析袋置于包含5-6 M尿素的透析缓冲液中，进行梯度透析复性，透析4-5 h；弃1/4-1/6体积原透析缓冲液，补充新的所弃体积的透析缓冲液，透析4-5 h，共透析6-9次；最后用0.01M PBS透析3-4 h，重复1-3次；收集透析液，4℃下12000rpm离心15分钟，上清即为复性的VP7或VP8重组抗原，经SDS-PAGE电泳确认有分子量大小为33KD（VP7重组抗原）或35KD（VP8重组抗原）的特征性电泳带，灰度扫描纯度在90%以上则满足进入下一步骤要求，上述中所述透析缓冲液组分为：50 mM Tris，0.5 mM EDTA，50 mM NaCl，5%体积比甘油，1%质量百分比 Gly，其余为超纯水，pH 8.1。最后利用Bradford法对纯化的VP7或VP8蛋白进行定量分析，调整蛋白浓度至3mg/ml。

优选的，用ELISA法检测步骤（3）中收集的鸡蛋蛋黄中抗体滴度，滴度达到1:20000以上即满足进入下一步骤的要求，利用水稀释-硫酸铵沉淀-超滤法从蛋黄中分离纯化轮状病毒特异性的卵黄抗体，包括：用蒸馏水按蒸馏水:卵黄体积比8:1稀释卵黄，用稀HCl调节pH至5.2，4℃静置6-8 h，离心去脂，收集上清液，再用质量百分比40%和25%(NH4)₂SO₄分步沉淀卵黄抗体，终浓度分别为10%和30%质量百分比，收集沉淀用0.01M PBS溶解后超滤（截留分子量为100kD）即得包含有抗VP7或VP8的卵黄抗体。

通过上述方法制备得到卵黄抗体，抗体的纯度为90%以上，抗体滴度为2×10⁴，其得率为10-12mg/ml蛋黄液，将上述卵黄抗体冻干制备成用作预防和治疗轮状病毒感染的抗体干粉，抗体干粉可做为口服生物制剂原料。

VP7和VP4位于轮状病毒的外层呈星状分布，分别决定了轮状病毒的G血清型和P血清型，在轮状病毒感染肠上皮细胞的粘附、浸入和感染过程中扮演了重要的作用。VP8属于VP4结构蛋白的N端肽端，位于病毒颗粒的表面，呈星状排布。流行性病学调查显示，人RV病毒至少有11种G血清型和11种不同的P血清型，G血清型与P血清型的组合两者可以是独立的，目前P8血清型、G1血清型和G4血清型最为流行，在全球大多数地区占人类轮状病毒感染的90 %以上。本发明以G4和P8血清型轮状病毒的VP7和VP8为靶点，设计和制备抗VP7和VP8的卵黄抗体，可以特异性阻断和中和P8和G4血清型轮状病毒的感染，对治疗和预防轮状病毒感染性腹泻具有极显著地效果。

基因工程菌遗传背景清楚，目标基因表达水平高，表达系统成熟完善，易于培养（培养方法简单、生长快、培养周期短、抗污染能力强）、成本低，被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。基因工程菌表达蛋白质的结构比较成熟，与其他方法表达的蛋白质有着更好的应用效果，安全性比较强，其制备的重组抗原作为免疫原免疫产蛋鸡，相对于已有的灭活或减毒病毒苗具有安全、稳定、特异性高等特点。

本发明的有益效果：在制备疫苗过程中，采用基因工程技术在体外大量表达重组VP7和VP8抗原，其效益高，成本低，场地需求小、环保等特点；避免了传统卵黄抗体制备过程中使用轮状病毒灭活或减毒疫苗所带来的潜在散毒风险，且符合动物福利的要求；采用本发明方法制备的VP7和VP8卵黄抗体，经无菌检验后，制备成抗体干粉口服生物制剂，对轮状病毒感染性腹泻治疗具有显著效果，其预防率可达到95%以上，具有见效快、成本低等特点。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1是IgY对小鼠腹泻的免疫保护作用图，横坐标分别为VP7IgY治疗组、VP8IgY治疗组与对照组，纵坐标为腹泻小鼠只数。

图2是小鼠粪便病毒抗原排量分析图，横坐标分别为VP7IgY治疗组、VP8IgY治疗组与对照组，纵坐标为小鼠粪便病毒排量。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书（包括任何附加权利要求、摘要和附图）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例1 制备轮状病毒VP7卵黄抗体及口服抗体干粉

包括以下步骤：

（1）VP7重组抗原的制备

根据人A组轮状病毒VP7基因序列的保守性，设计一对PCR扩增引物：VP7上游引物 (5’-CCGGAATTCEcoRITTGCCAATTACTGGATCTAT-3’) 和下游引物 (5’-CCGCTCGAGXhoICATTCGTTCTGTTTGTGGA-3’)，以VP7全长基因（从中国科学院微生物研究所购得人A组轮状病毒 T114株获得）作为模板，退火温度设为54 ℃进行PCR扩增（PCR扩增程序为：热激活，110℃；变性，94℃ 1min;退火，54℃ 45s；延伸，72℃ 1min ）。凝胶电泳并回收PCR产物（约700bp），经EcoR I 和Xho I酶切回收，与同样经过双酶切（EcoR I 和Xho I）处理的pET28a(+)原核表达载体进行连接、转化原核表达载体（pET28a(+)）。对重组质粒进行DNA测序，确认正确后将重组质粒命名为pET28a-VP7。将鉴定正确的重组质粒pET28a-VP7转化表达菌株E.coli BL21(DE3)。次日挑取单菌落接种于3 ml含卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，150 rpm振荡培养；过夜培养后，按体积比1：200接种到含卡那霉素50μg/ml的LB液体培养基中扩大培养，待菌液OD 600值为0.6-0.8时加入终浓度为0.5 mM IPTG诱导，诱导温度为25℃，诱导时间10 h后，12000 rpm离心收集菌体，按照0.01M PBS：菌体=10:1体积比用0.01M PBS悬浮菌体，加入终浓度为10 mg/ml的溶菌酶，冰浴1 h；采用4次反复冻融法裂解菌体，12000 rpm离心15 min，收集上清和沉淀，经SDS-PAGE确定VP7重组蛋白以不可溶形式表达后，收集包涵体沉淀；用质量百分比1.2%的Triton和2 M尿素的0.01M PBS洗涤包涵体一次；再用0.01M PBS洗涤包涵体3次，最后用含有6 M尿素的0.01 M PBS缓冲液，按照缓冲液：包涵体=50:1体积比加入0.01MPBS缓冲液溶解包涵体，将溶液的包涵体液加入透析袋中，按照透析缓冲液：袋内透析液=10:1体积比，将透析袋置于包含5 M尿素的透析缓冲液中，进行梯度透析复性，透析5 h；弃1/6体积原透析液，补充新的1/6体积的透析缓冲液，透析5 h，共透析6次；最后用0.01M PBS透析4 h，重复3次；收集透析液，4℃下12000rpm离心15分钟，上清即为复性的VP8重组抗原，经SDS-PAGE电泳确认有分子量大小为35KD的特征性电泳带，灰度扫描纯度在90%以上则满足进入下一步骤要求。最后利用Bradford法对纯化的VP7蛋白进行定量分析，调整蛋白浓度至3mg/ml。

上述透析缓冲液组分为：50 mM Tris，0.5 mM EDTA，50 mM NaCL，5%重量体积比甘油，1%重量体积比Gly，其余为超纯水，pH 8.1。

（2）抗轮状病毒VP7卵黄抗体的制备

①对产蛋鸡的免疫

初免：取3mg/ml VP7重组抗原蛋白按照1:1体积比与完全弗氏佐剂混匀乳化，3点肌肉注射免疫产蛋鸡，免剂量为500μg/只。

加强免疫：初免1个月后，取3mg/ml VP7重组抗原与不完全弗氏佐剂等体积混匀并充分乳化后，按200 μg/只剂量进行加强免疫，隔月一次，共两次加强免疫；于两周后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。加强免疫以后，当抗体滴度低于1:10⁴时，给予强化免疫，免疫剂量为200μg/只即可。用ELISA法检测收集的鸡蛋的蛋黄中的抗体滴度，滴度为1:100000。

② 抗轮状病毒VP7卵黄抗体的提取与纯化

用蒸馏水漂洗卵黄，按卵黄：水体积比为1: 8对卵黄进行稀释；振荡器混匀，用稀HCl调节pH至5.2，4℃静置8 h；次日4℃下12000 rpm离心15 min。收集上清液（即为水粗提液WSF），缓缓加入(NH₄)₂SO₄（终浓度为10%），4℃静置2h，12000 rpm低温离心15 min，去沉淀；上清中缓缓加入(NH₄)₂SO₄（终浓度为30%），4℃静置2h；12000 rpm低温离心15 min，收集沉淀，用0.01M PBS溶解，并于超滤管进一步纯化和浓缩（截留分子量为100 KD），即得VP7卵黄抗体。

（3）口服抗体干粉制备

冷冻干燥，即为纯化的IgY抗体干粉；取样采用Bradford蛋白定量、SDS-PAGE和ELISA方法进行定量、纯度和滴度等分析。结果表明，制备的卵黄抗体纯度为91%，抗体滴度为2 x 10⁴；卵黄抗体产量可达80-110mg/10ml卵黄。同时对卵黄抗体进行无菌检测，并于-80℃保存。

实施例2 制备轮状病毒VP8卵黄抗体及口服抗体干粉

包括以下步骤：

（1）VP8重组抗原的制备

根据人A组轮状病毒VP8基因序列的保守性，设计一对PCR扩增引物：VP8上游引物(5’-CCGGAATTC EcoR I ATGGCTTCACTCATTTAT-3’)和下游引物(5’-CCGCTCGAG Xho I AACTTGTGCCCTCTTATA-3’)，以VP8全长基因（从中国科学院微生物研究所购得人A组轮状病毒 T114株中获得）作为模板，退火温度设为56℃进行PCR扩增（PCR扩增程序：热激活，110℃；变性，94℃ 1min;退火，56℃ 45s；延伸，72℃ 1min）。凝胶电泳并回收PCR产物（约750bp），经EcoR I 和Xho I酶切回收，与同样经过双酶切（EcoR I 和Xho I）处理的pET28a(+)原核表达载体进行连接、转化原核表达载体（pET28a(+)）。对重组质粒进行DNA测序，确认正确后将重组质粒命名为pET28a-VP8。将鉴定正确的重组质粒pET28a-VP8转化表达菌株E.coli BL21(DE3)。次日挑取单菌落接种于3 ml含卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，150 rpm振荡培养；过夜培养后，按体积比1：200接种扩大培养，待菌液OD 600值为0.6-0.8时加入终浓度为0.6  mM IPTG诱导（同时设不加IPTG诱导或空载体相关对照），诱导温度为25℃，诱导时间12 h后，12000 rpm离心收集菌体。按照0.01M PBS:菌体=10:1体积比用0.01M PBS悬浮菌体，加入终浓度为10 mg/ml的溶菌酶，冰浴1 h；采用4次反复冻融法裂解菌体，12000 rpm离心15 min，收集上清和沉淀，经SDS-PAGE确定VP8重组蛋白以不可溶形式表达后，收集包涵体沉淀；用包含质量百分比1.2%的Triton和2 M尿素的0.01M PBS洗涤包涵体一次；再用0.01M PBS洗涤包涵体4次，最后用包含有8 M尿素的0.01 M PBS缓冲液，按照缓冲液：包涵体=50:1体积比溶解包涵体，将包涵体液加入到透析袋中，按照透析缓冲液：袋内透析液（包涵体液）=10:1体积比，将透析袋置于包含6 M尿素的透析缓冲液中，进行梯度透析复性，透析4 h；弃1/5体积原透析液，补充新的1/5体积的透析缓冲液，透析5 h，共透析8次；最后用0.01M PBS透析4 h，重复3次；收集透析液，4℃下12000rpm离心15分钟，上清即为复性的VP8 重组抗原，经SDS-PAGE电泳确认有分子量大小为35KD的特征性电泳带，灰度扫描纯度在90%以上则满足进入下一步骤要求。最后利用Bradford法对纯化的VP7蛋白进行定量分析，调整蛋白浓度至3mg/ml。

上述透析缓冲液组分为：50 mM Tris，0.5 mM EDTA，50 mM NaCl，5%重量比甘油，1%重量比Gly，其余为超纯水，pH 8.1。

（2）抗轮状病毒VP8卵黄抗体的制备

①对产蛋鸡的免疫

初免：取3mg/mL VP8重组抗原蛋白按照1:1体积比与完全弗氏佐剂混匀乳化，2点肌肉或皮下注射免疫产蛋鸡，免剂量为300μg/只。

加强免疫：初免1个月后，取3mg/mL VP8重组抗原与不完全弗氏佐剂等体积混匀并充分乳化后，按200μg/只剂量进行加强免疫，隔月一次，共两次加强免疫；于两周后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。加强免疫以后，当抗体滴度低于1:10⁴时，给予强化免疫，免疫剂量为200μg/只即可。用ELISA法检测收集的鸡蛋的蛋黄中的抗体滴度，滴度为1:100000。

② 抗轮状病毒VP8卵黄抗体的提取与纯化

用蒸馏水漂洗卵黄，按卵黄：水的体积比为1:8对卵黄进行稀释；振荡器混匀，用稀HCI调节pH至5.2，4℃静置8 h；次日4℃下12000 rpm离心15 min。收集上清液（即为水粗提液WSF），缓缓加入(NH₄)₂SO₄（终浓度为10 %），4℃静置2h，12000 rpm低温离心15 min，去沉淀；上清中缓缓加入(NH₄)₂SO₄（终浓度为30%），4℃静置2h；12000 rpm低温离心15 min，收集沉淀，用0.01M PBS溶解，用0.01M PBS溶解，并于超滤管进一步纯化和浓缩（截留分子量为100 KD），即得VP8卵黄抗体。

（3）口服抗体干粉

冷冻干燥，即为纯化的IgY抗体干粉；取样采用Bradford蛋白定量、SDS-PAGE和ELISA方法进行定量、纯度和滴度等分析。结果表明，制备的卵黄抗体纯度为93%，抗体滴度为2×10⁴；卵黄抗体产量可达85-108mg/10ml卵黄。同时对卵黄抗体进行无菌检测，并于-20℃保存

实施例3: 本实施例为实施例1和2得到的VP7或VP8卵黄抗体干粉与市售抗体的效价比较分析

1、实施例1制备的VP7卵黄抗体与类似抗体效价比较

用棋盘滴定法分析抗原VP7的稀释倍数，结果表明VP7抗原稀释2000倍为最佳抗原稀释倍数，包埋在酶标板孔内，4℃孵育过夜，PBST洗涤缓冲液洗涤3次，加入200μL封闭液，37℃静置1.5h，同样洗涤3次，购买市售A组轮状病毒粒子诱导的卵黄抗体和实施例1制备的VP7卵黄抗体，梯度稀释，每孔加相应抗体100μL，室温孵育2~3h；同样洗涤3次，加入羊抗鸡二抗（1:5000），每孔加100μL，室温孵育2～3h；同样洗涤3次，加显色液（TMB ELISA显色液）100 μL并在黑暗处静置3～30min（按说明书要求处理）；终止反应，用酶标仪读取405nm处的吸光度值。结果见表1。

表1.  VP7卵黄抗体效价比较结果(OD₄₀₅值)

VP7抗体稀释倍数	100	1000	10000	100000
					市售抗体	1.737	1.541	1.152	0.826
实施例1制备的 VP7卵黄抗体	2.714	2.181	1.714	1.342

从表1可以知道，实施例1制备的VP7卵黄抗体滴度显著高于市售抗体滴度近100倍。

2、实施例2制备的VP8卵黄抗体与类似抗体效价比较

用棋盘滴定法分析抗原VP8的稀释倍数，结果表明VP8抗原稀释2000倍为最佳抗原稀释倍数，包埋在酶标板孔内，4℃孵育过夜，PBST洗涤缓冲液洗涤3次，加入200μL封闭液，37℃静置1.5h，同样洗涤3次，购买市售A组轮状病毒粒子诱导的卵黄抗体和实施例2制备的VP8卵黄抗体，做梯度稀释，每孔加相应抗体100μL，室温孵育2~3h；同样洗涤3次，加入羊抗鸡二抗（1:5000），每孔加100μL，室温孵育2～3h；同样洗涤3次，加显色液（TMB ELISA显色液）100 μL并在黑暗处静置3～30min（按说明书要求处理）；终止反应，用酶标仪读取405nm处的吸光度值。结果见表2所示。

表2 . VP8卵黄抗体效价比较(OD₄₀₅值)

VP8抗体稀释倍数	100	1000	10000	100000
					市售抗体	1.309	1.071	1.021	0.86
实施例2制备的VP8卵黄抗体	2.414	1.881	1.299	1.06

从表2可以看出，实施例2制备的抗体滴度显著高于市售抗体滴度近100倍（见表2）。

实施例4：动物治疗实验

1、细胞中和实验

应用MAC145细胞进行Wa轮状病毒体外中和试验，阴性对照为PBS溶液免疫的对照IgY；VP7和VP8免疫产蛋鸡的IgY稀释倍数分别为62.5、125、250、500、1000和2000，试验重复3次。细胞结果分析表明，由VP7和VP8诱导的产蛋鸡产生的IgY在稀释500倍时可以使Wa株侵染MAC145细胞形成的蚀斑数减少50%以上，当稀释倍数在125或以下时其对Wa株侵染MAC145细胞形成的蚀斑数减少至90%以上。这个结果证明VP7和VP8可诱导产蛋鸡产生针对人A组轮状病毒RV的中和抗体IgY。

2、卵黄抗体IgY在动物体内的保护实验

取出生8天的雌性BALB/c乳鼠150只随机分成三组：VP7 IgY组、VP8 IgY组和对照IgY组。使用感染婴幼儿的人A组轮状病毒株Wa进行小鼠攻毒实验，攻毒剂量为5×10⁴pfu；攻毒12h后开始卵黄抗体IgY灌喂处理，一天两次，每次IgY剂量为0.5mg，并按表一进行数据记录，观察14天。其中，平均累计得分计算方法：0分，正常粪便；1分，膏状粪便；2分，半液体状粪便；3分，液体粪便。并且应用ELISA方法检测粪便中轮状病毒抗原排除量。结果如表3所示。

表3 口服抗人轮状病毒卵黄抗体的小鼠攻毒结果（出生7天的雌性BALB/c乳鼠）

由表3的结果表明，与对照组相比，RME IgY能显著提高小鼠抗轮状病毒感染性腹泻的能力（如表3）。腹泻鼠获得90%以上的保护（见图1），小鼠粪便排出的病毒量明显减少，显著低于对照组（见图2）。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims (10)

1.一种抗人A组轮状病毒的鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，体外表达纯化人A组轮状病毒结构蛋白VP7或VP8，并免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，分离纯化出VP7或VP8卵黄抗体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，PCR扩增人A组轮状病毒的结构蛋白VP7或VP8 DNA序列，将其克隆到原核表达载体pET28a(+)上并转化大肠杆菌表达菌株BL21，诱导表达和纯化VP7或VP8重组蛋白，将VP7或VP8重组蛋白溶液按照体积比1:1与弗氏佐剂混合乳化，肌肉或皮下注射免疫产蛋鸡，每隔一个月加强免疫一次，共2次，第3次免疫后一周开始收集鸡蛋，从蛋黄中分离纯化出抗轮状病毒结构蛋白VP7或VP8的特异性卵黄抗体。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）PCR扩增：设计引物，以包含G4P8血清型全长VP7或VP8的质粒DNA为模板，PCR扩增VP7或VP8 DNA序列；

（2）蛋白表达纯化：将PCR扩增得到的VP7或VP8 DNA序列克隆到原核表达载体pET28a(+)上，并转化到大肠杆菌表达菌株BL21中，通过0.1-0.7mM IPTG诱导VP7或VP8重组抗原蛋白的大量表达，诱导表达温度为25-37℃，时间8-12 h，离心收集诱导表达后的菌体，按照体积比0.01M PBS ：菌体=10:1，用0.01M PBS悬浮菌体，采用3-6次反复冻融和溶菌酶裂解的方法裂解菌体，溶菌酶的终浓度为1-10mg/ml；离心收集沉淀，用含质量百分比0.8-1.2%的Triton和1.5-2.5M尿素的0.01M PBS洗涤去除细胞碎片，获得粗制的包涵体，再用0.01 MPBS洗涤包涵体2-4次，最后按照体积比含有6-8 M尿素的0.01 M PBS缓冲液：包涵体=50:1加入0.01 M PBS缓冲液溶解包涵体，将溶解的包涵体加入到透析袋内，采用梯度透析的方法复性包涵体得到VP7或VP8重组抗原蛋白；

（3）免疫：取2-10mg/ml VP7或VP8重组抗原蛋白按照与完全弗氏佐剂1:1体积比混匀乳化，2-3点肌肉或皮下注射免疫产蛋鸡，初免剂量为250-500μg/只，每隔一个月加强免疫一次，共2次，免疫剂量为100-200μg/只，加强免疫采用不完全弗氏佐剂，第3次免疫一周以后开始收集鸡蛋，抗体滴度低于1:10⁴时，再给予强化免疫，免疫剂量为100-200μg/只即可；

（4）分离纯化卵黄抗体：用水稀释-硫酸铵沉淀-超滤法从蛋黄中分离纯化轮状病毒特异性VP7或VP8卵黄抗体。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的VP7上游引物为5’-CCGGAATTCTTGCCAATTACTGGATCTAT-3’，VP7下游引物为5’- CCGCTCGAGCATTCGTTCTGTTTGTGGA-3’，所述步骤（1）的VP8上游引物为5’- CCGGAATTCATGGCTTCACTCATTTAT-3’和下游引物为5’- CCGCTCGAGAACTTGTGCCCTCTTATA-3’，所述PCR的退火温度为53-57℃；所述步骤（2）的梯度透析的方法复性包涵体包括：按照体积比为透析缓冲液：袋内透析液=10:1，将透析袋置于包含5-6 M尿素的透析缓冲液中，进行梯度透析复性，透析4-5 h；弃1/4-1/6体积原透析缓冲液，补充新的所弃体积的透析缓冲液，透析4-5 h，共透析6-9次；最后用0.01M PBS透析3-4 h，重复1-3次；收集透析液，4℃下12000rpm离心15分钟，上清即为复性的VP7或VP8重组抗原，所述透析缓冲液组分为：50 mM Tris，0.5 mM EDTA，50 mM NaCl，5%体积比甘油，1%重量比Gly，其余为超纯水，pH 8.1，最后利用Bradford法对纯化的VP7或VP8蛋白进行定量分析，调整蛋白浓度至3mg/ml。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）得到的VP7或VP8重组抗原蛋白经SDS-PAGE电泳确认有一条分子量大小为33KD或35KD的电泳带，其中VP7复性蛋白分子量大小为33KD或VP8复性蛋白分子量大小为35KD，灰度扫描纯度在90%以上则满足进入下一步骤要求。

6.如权利要求3-5中任一权利要求所述的制备方法，其特征在于，用ELISA法检测步骤（3）中收集的鸡蛋的蛋黄中的抗体滴度，滴度达到1:20000以上即满足进入下一步骤的要求，利用水稀释-硫酸铵沉淀-超滤法从蛋黄中分离纯化轮状病毒特异性的卵黄抗体包括：按照蒸馏水:卵黄=8:1稀释卵黄，用稀HCl调节pH至5.2，4℃静置6-8 h，离心去脂，收集上清液，再用质量百分比40%和25%(NH₄)₂SO₄分步沉淀卵黄抗体，终浓度分别为10%和30%质量百分比，收集沉淀用0.01M PBS溶解后超滤即得卵黄抗体VP7或VP8卵黄抗体，超滤的截留分子量为100kD。

7.一种卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体通过权利要求1-6中任一权利要求的方法制备得到卵黄抗体。

8.如权利要求7所述的一种卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体的纯度为90%以上，抗体滴度为2×10⁴。

9.如权利要求7-8中任一权利要求所述的卵黄抗体的应用，其特征在于，所述卵黄抗体冻干制备成用作预防和治疗轮状病毒感染的抗体干粉。

10.如权利要求9所述的卵黄抗体的应用，其特征在于，所述抗体干粉为口服生物制剂原料。

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