CN113683665A - 一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113683665A
CN113683665A CN202110935118.3A CN202110935118A CN113683665A CN 113683665 A CN113683665 A CN 113683665A CN 202110935118 A CN202110935118 A CN 202110935118A CN 113683665 A CN113683665 A CN 113683665A
Authority
CN
China
Prior art keywords
circovirus type
yolk antibody
protein
recombinant
immunization
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110935118.3A
Other languages
English (en)
Inventor
成子强
孙玉凤
周德方
赵满达
胡莉萍
张利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Agricultural University
Original Assignee
Shandong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Agricultural University filed Critical Shandong Agricultural University
Publication of CN113683665A publication Critical patent/CN113683665A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/02—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from eggs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/11—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from eggs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程领域，提供了一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法，具体制备步骤如下：将含有重组圆圈病毒3型VP1蛋白与弗氏佐剂混合后免疫健康产蛋鸡，加强免疫后所采集鸡蛋的平均抗体效价达1：29，最高抗体效价可达1：213；利用高免蛋提取纯化制备的卵黄抗体产品可对感染圆圈病毒3型的鸡群提供保护，所制备的圆圈病毒3型卵黄抗体效果确实、成本低廉，具有显著的经济与社会效益。

Description

一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程及生物医药领域，提供了一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法。
背景技术
鸡传染性腺胃炎(Transmissible viral proventriculitis,TVP)是以鸡体消化不良、腺胃肿大和生长发育迟缓为特征的疾病。具体表现为增重下降、饲料转化率低和体重整齐度差。目前，国外已将TVP视为肉种鸡和商业蛋鸡生产损失的潜在原因。
2018年，首次从患有传染性腺胃炎的病鸡体内分离到了圆圈病毒3型，并证实GyV3是引起TVP的重要病原。GyV3是单链环状DNA病毒，无囊膜，基因组大小约为2.3kb，属于圆圈病毒属(Gyrovirus，GyVs)，并且根据2016年国际病毒分类委员会批准的最新病毒分类法，GyVs被重新分类到指环病毒科。
截至目前，无控制GyV3感染的有效方法。通常，防治疾病的方法主要有疫苗、抗生素及消毒剂，这些预防和治疗手段虽然能发挥一定的作用，但是疫苗研制耗时久，抗生素滥用现象频发，容易产生耐药性，消毒剂有较强的腐蚀性和刺激性，都不是快速进行疾病防治的有效方法。
卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体,由于卵黄中仅有特异性的IgY类抗体,故称其为卵黄免疫球蛋白IgY。与血清抗体相比,卵黄抗体具有很多独特的优点：(1)产量高、成本低，只需连续免疫蛋鸡，从高免鸡蛋的卵黄中纯化即可得到；(2)卵黄抗体有良好的稳定性，耐热耐酸，且保存时间长；(3)特异性强，针对不同抗原产生特异性抗体，治疗效果确切；(4)无过敏原，安全、高效、无残留、无副作用、环保。现有技术实现方案中，还没有GyV3卵黄抗体的报道。
因此能否提供一种全新的GyV3的卵黄抗体，成为本领域的技术难题。
发明内容
本发明的主要目的就在于克服上述现有技术的不足，提供一种用于GyV3 卵黄抗体的制备方法，具体制备步骤如下：将含有重组GyV3 VP1蛋白与弗氏佐剂混合后免疫健康产蛋鸡，加强免疫后所采集鸡蛋的平均抗体效价达1：29，最高抗体效价可达1：213；利用高免蛋提取纯化制备的卵黄抗体产品可对感染 GyV3的鸡群提供保护，所制备的GyV3卵黄抗体效果确实、成本低廉，具有显著的经济与社会效益。
本发明的具体技术方案如下：
发明人首先提供了一种重组GyV3 VP1蛋白，该蛋白是由GyV3 VP1基因与原核表达载体pET32a通过酶切连接而成，转化大肠杆菌感受态细胞BL21制备而成；
其中GyV3 VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如 SEQ IDNO.2所示；
将上述获得的重组GyV3 VP1蛋白菌株进行诱导表达、菌体破碎、蛋白纯化等，即可获得重组GyV3 VP1蛋白；之后将上述重组GyV3 VP1蛋白与弗氏佐剂混合即可制备成卵黄抗体所用抗原；
利用上述抗原免疫产蛋鸡后可产生高效价卵黄抗体，具体步骤为：
用重组GyV3 VP1蛋白免疫产蛋母鸡，免疫方式为胸肌注射四次，第一次的免疫注射的方法如下：将重组GyV3 VP1蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化得到首免抗原，用1ml该抗原胸肌注射产蛋母鸡；
将重组GyV3 VP1蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化后得到二免、三免和四免用的抗原；首免后间隔一周二免，二免二周后三免，三免三周后四免，然后从高免鸡蛋的蛋黄中提取纯化得到GyV3卵黄抗体，使用聚乙二醇、硫酸铵盐析法提纯即可获得目标卵黄抗体；
上述获得的卵黄抗体性质稳定、纯度高，可大大降低GyV3卵黄抗体的生产成本，对鸡传染性腺胃炎的预防及治疗极具应用价值。
制备的重组GyV3 VP1蛋白抗原免疫蛋鸡后，加强免疫后所采集鸡蛋的平均抗体效价达1：29，最高抗体效价可达1：213，且加强免疫后2个月进行检测，卵黄抗体效价仍符合要求。
经攻毒实验，卵黄抗体预防组使用后鸡群获得80％保护，治疗组使用后鸡群获得66.7％保护，攻毒组的鸡群则100％发病，证明本发明制备的GyV3卵黄抗体对感染GyV3的鸡群具有良好的临床保护效果，可进行临床推广和应用。
综上所述，本发明GyV3卵黄抗体所用免疫原重组GyV3 VP1蛋白，具有病毒特异的抗原性和免疫原性，可刺激机体产生抗原病毒免疫应答，与常规直接使用病毒作为免疫原的方法相比安全性更高、产生的抗体效价提高，极具推广与应用价值。制备的GyV3卵黄抗体用于GyV3的预防或治疗，均取得优异效果，注射抗体的鸡群获得较高程度的保护。
保藏信息
保藏时间：2020年10月1日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心
保藏编号：CCTCC NO:V202061
保藏单位地址：中国武汉武汉大学
分类命名:圆圈病毒3型SDAU－2株(Gyrovirus 3SDAU－2)
附图说明
图1为未纯化的重组圆圈病毒3型VP1蛋白的SDS PAGE检测结果显示图：
图中M为170kDa Marker，1-2泳道为未纯化的重组圆圈病毒3型VP1蛋白；
图2为纯化后的重组圆圈病毒3型VP1蛋白的SDS PAGE检测结果显示图，
图中M为170kDa Marker，1-2泳道为纯化后的重组圆圈病毒3型VP1蛋白；
图3为重组圆圈病毒3型VP1蛋白的Western Blot检测结果显示图：
图中M为170kDa Marker，1-2泳道为重组圆圈病毒3型VP1蛋白；
图4为未纯化圆圈病毒3型卵黄抗体的SDS PAGE检测结果显示图，
图中M为170kDa Marker，1-2泳道为未纯化圆圈病毒3型卵黄抗体；
图5为纯化后的圆圈病毒3型卵黄抗体的SDS PAGE检测结果显示图：
图中M为170kDa Marker，1-2泳道为纯化后的圆圈病毒3型卵黄抗体；
图6为圆圈病毒3型卵黄抗体的Western Blot检测结果显示图：
图中M为170kDa Marker，1-2泳道为圆圈病毒3型卵黄抗体；
图7为实施例2中对制备获得的卵黄抗体效价监测结果图；
图8为试验鸡体重增长规律曲线图；
图9为试验鸡血象观察结果示意图；
图中A：正常组；B：攻毒组；C：预防组；D：治疗组。
图10为试验鸡攻毒后7、14、21天的动物组织器官剖检病变图；
图11为试验鸡组织病理学观察图。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定，下述试验中所采用的试剂除特殊说明外均为本领域常规试剂，所采用的方法为常规方法或直接交由基因公司完成；实验时采用的GyV3-SDAU-2毒株，其保藏编号为CCTCC NO:V202061，保藏于中国典型培养物保藏中心。
实施例1重组圆圈病毒3型(GyV3)VP1蛋白的原核表达及纯化
1.重组GyV3 VP1蛋白原核表达载体的构建，包括以下步骤：
1.1根据GyV3-SDAU-1毒株(GenBank:MG366592)全基因组获取 GyV3-VP1基因，通过跨膜区分析、信号肽分析、疏水性分析和抗原性分析，选择第90至463位氨基酸进行表达，并选用SacⅠ和NotⅠ分别作为上下游酶切位点，进行全基因合成。
1.2将合成的GyV3 VP11125基因用SacⅠ和NotⅠ双酶切后连入pMD 18-T Vector载体相应的酶切位点，转化至感受态细胞DH5α中，提取质粒，将提取的质粒和原核表达载体pET32a(+)使用SacⅠ和NotⅠ酶进行双酶切，将上一步获取的双酶切片段VP11125和pET32a(+)连接后转化至感受态细胞BL21(DE3) 中，提取质粒送华大基因测序，测序结果与GyV3VP11125基因比对结果显示完全匹配，重组质粒构建成功。
2.重组质粒的体外表达及鉴定
2.1构建的原核表达载体，转化至感受态细胞BL21中，转化步骤如下：
2.1.1取感受态细胞BL21 100μL冰浴中解冻，加入连接后的重组质粒10μL，轻轻混匀；
2.1.2冰浴中反应30min；42℃水浴90s(时间严格控制)后迅速转至冰浴中2min，期间严禁晃动；
2.1.3加入400μL LB培养基(不含氨苄)于恒温摇床中37℃、200rpm/min 培养1h；取200μL涂于含有AMP的LB固体培养板中，37℃恒温过夜培养；
2.1.4挑取单个菌落置于10mL含有浓度为100ng/L AMP的LB液体培养基的试管中37℃、200rpm/min培养6h；
2.1.5取200μL菌液送华大基因测序，测序结果表明重组质粒构建成功。
2.2重组质粒的体外鉴定
2.2.1将测序正确的菌液活化后，摇菌，当菌液在对数生长期时，加入1.0 mmol/L的IPTG诱导表达，收取诱导后4h的1mL菌液，超声破碎，对包涵体进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果显示重组蛋白在包涵体中大量表达，证明构建的重组质粒可正确表达GyV3 VP1蛋白。
3重组GyV3 VP1蛋白的大量表达及纯化
3.1重组菌的培养与裂解
3.1.1含重组质粒DNA的大肠杆菌感受态细胞BL21经220rpm/min，37℃培养至OD600 nm约为0.6时，加入IPTG(使其终浓度为0.8mmol/L)，37℃诱导培养4h，10000×g，4℃离心10min收集菌体。
3.1.2将菌体沉淀用PBS重悬后进行离心，反复用PBS重悬3-5次以去除残留的培养基及杂质。取少量菌体混悬液进行超声破碎，离心收集包涵体沉淀。
3.2重组GyV3 VP1蛋白的纯化
3.2.1向菌体沉淀中加入LE Buffer搅拌溶解(约7.5mL LE Buffer/mg包涵体)，室温孵育30-60min或4℃过夜，13400×g 4℃离心30min，去除沉淀，收集上清。
3.2.2使用Ni-NTA亲和层析介质进行蛋白纯化，将未纯化的蛋白样品加入已使用平衡缓冲液平衡好的Ni-NTA树脂中，使样品缓慢流出，控制流速大约为 0.5-1mL/min，重复或循环上样3-4次；使用LE Buffer洗涤填料，重复3-5几次；用2倍柱体积的洗涤液洗涤柱子上的杂蛋白；使用尽量少的洗脱液洗脱，收集的洗脱液即为纯化后的蛋白。结果如图1和2所示，可见纯化前杂带较多，纯化后仅出现一条目的条带，说明纯化效果良好。
3.3圆圈病毒3型VP1蛋白的检测
3.3.1将纯化后的蛋白进行western blot分析，以His标签单克隆抗体鼠抗为一抗(pET32a载体自带His标签)，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG。
经检测，在57kDa处出现阳性信号(图3)，结果表明GyV3-VP1能与His 标签特异性结合。
3.3.2蛋白浓度检测按照BCA蛋白检测试剂盒说明书，以已知浓度的BSA 制备标准曲线。用无菌水将纯化的重组圆圈病毒3型VP1蛋白进行浓度检测，重组蛋白含量为1.129mg/ml。
实施例2免疫原的制备与检验
1免疫原的制备
1.1将实施例1的3.2中纯化的重组圆圈病毒3型VP1蛋白与等体积弗氏佐剂混合充分混匀，置于冰水混合物中进行超声乳化。
2免疫原的检验
2.1物理性状
外观为乳白色乳剂，制剂为油包水型，用移液枪吸取乳化后的免疫原滴于冷水中，均应不扩散；稳定性吸取免疫原于离心管中，经3000r/min离心15分钟，管底应无水相析出。
3 GyV3 VP1免疫原对蛋鸡免疫程序研究
选取180日龄蛋鸡20只，免疫接种由实施例1制备的重组圆圈病毒3型 VP1蛋白与弗氏佐剂按1:1比例乳化制成；不免疫对照组注射同等体积的生理盐水。各组蛋鸡分别进行相应免疫，胸肌多点注射，免疫间隔7、14和21日，共四次免疫，具体如下：
Figure BDA0003212739900000051
分别于首免后7、21、35、49、73、84、93、104、120日收集鸡蛋测定卵黄抗体效价，之后每7日收集高免蛋鸡蛋利用间接ELISA法测定卵黄抗体效价，确定蛋鸡的卵黄抗体产生期和持续期，结果如图7所示。
结果：制备的重组GyV3 VP1蛋白免疫原免疫蛋鸡后，加强免疫后所采集鸡蛋的平均抗体效价达1：29，最高抗体效价可达1：213，且四免后2个月进行检测，卵黄抗体效价仍符合要求(见下表)。
Figure BDA0003212739900000052
结果表明不论是卵黄抗体产生时间、抗体产生高度还是抗体持续期，重组圆圈病毒3型VP1蛋白作为免疫原显示了良好的应用前景。
实施例3圆圈病毒3型(GyV3)卵黄抗体的制备与检验
1GyV3卵黄抗体的制备
按实施例2中3部分的方法利用GyV3VP1蛋白作为免疫原免疫蛋鸡制备高免蛋，收集合格的高免蛋(抗体效价不低于1:64)，蛋壳消毒后进行卵黄分离、过滤除菌、聚乙二醇和饱和硫酸铵盐析法等方法。
采用PEG沉淀法提取卵黄抗体：从免疫鸡蛋中分离蛋黄，将卵黄液与pH7.6 的0.1MTris·Hcl缓冲液按1∶2混合进行稀释，加入PEG6000至终浓度3.5％，充分搅拌混匀，4℃静置12h，10000×g离心10min，取上清液，然后往上清液内加入PEG6000至终浓度为13～15％，充分搅拌混匀后，4℃静置12h，10000×g 离心10min，收集沉淀；
采用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体：从收集的免疫鸡蛋中分离得到卵黄，加入等体积的PBS缓冲液，再缓慢滴加两倍体积的饱和硫酸铵溶液，使饱和硫酸铵溶液的终浓度达到50％，置于4℃冰箱6h或4℃过夜后，以10000×g，4℃离心15min，取其沉淀。用上述两倍体积的PBS溶解沉淀，加入一半体积的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液的终浓度达到33％；4℃静置6h或4℃过夜后，以10000×g，4℃离心15min，收集沉淀，进行冷冻干燥，得到卵黄抗体。
将得到的卵黄抗体溶液经过透析、过滤除菌以及高压真空冷冻干燥制成卵黄抗体冻干粉。
2 GyV3卵黄抗体的质量监测
2.1无菌检验按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。
2.2安全检验将1日龄健康SPF鸡20只平均分为两组，每组10只。第一组饮用本发明制备的卵黄抗体，0.2g/只，第二组只饮用水。免疫后观察鸡群，应全部健活，无任何不良反应。
2.3甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行，均符合规定。
3 GyV3卵黄抗体SDS PAGE检测
利用未纯化和纯化后的GyV3卵黄抗体进行SDS PAGE检测，结果显示经纯化后主要集中在70kDa和25kDa条带处(图4和5)，其余杂带较少，纯化效果良好。
4 GyV3卵黄抗体western blot检测
用GyV3-VP1蛋白进行western blot验证，以GyV3卵黄抗体为一抗，HRP 羊抗鸡IgY为二抗，
在目标位置57kDa处出现阳性信号(图6)，结果表明所制备的GyV3卵黄抗体具有良好的识别GyV3-VP1抗原的特性。
5 GyV3卵黄抗体的效果试验
将1日龄健康SPF鸡50只分为三组。第一组为正常组，10只，只饮用含卵黄抗体冻干粉的无菌水，第二组为攻毒组，10只，只进行攻毒处理，1日龄时经腹腔接种GyV3-SDAU-2毒株0.2mL/只(含3.37×107病毒拷贝数)；第三组为卵黄抗体预防组，15只，先饮用含卵黄抗体的无菌水0.2g/只，3天后腹腔注射GyV3-SDAU-2毒株0.2ml(含3.37×107病毒拷贝数)；第四组为卵黄抗体治疗组，15只，腹腔注射GyV3-SDAU-2毒株0.2ml(含3.37×107病毒拷贝数)，确定接毒成功后开始饮用含本发明制备的圆圈病毒3型卵黄抗体冻干粉的无菌水，0.4g/只。
攻毒后第7d、14d、21d各组随机抽取3只天后统计治疗效果。其中发病标准：1、粪便过料，腺胃乳头肿胀甚至黏连、逐渐消瘦、法氏囊和胸腺严重萎缩、再生障碍性贫血；2、死亡；3、PCR检测阳性。出现以上3+1或3+2的情况即判为发病。
圆圈病毒3型卵黄抗体保护效果试验分组
Figure BDA0003212739900000061
Figure BDA0003212739900000071
对试验鸡进行体重称量并记录，监测四个分组的鸡群体重变化，分析鸡群的生长状况制备折线图，并用SPSS软件将预防组和治疗组的体重数据分别与接毒组的数据进行比较，分析体重增长情况的差异。
试验鸡体重增长差异
如图8所示，正常组的鸡在整个实验过程中均无异常，没有表现出发病情况，有良好精神的状态，生长发育也较为良好，个体的差异不显著；预防组和治疗组与攻毒组相比，体重显著高于攻毒组，与正常组相比，体重低于正常组；攻毒组的鸡攻毒后开始表现出精神沉郁，食欲不振，生长发育迟缓，与正常组鸡的体重开始出现差异，在3周时，个体的体重均匀度较差。
采集正常组、攻毒组、预防组和治疗组四个分组的鸡少量新鲜血液制备血涂片，进行血象观察(图9)。
攻毒组幼稚红细胞数量增多，呈明显贫血像。预防组和治疗组较攻毒组症状较轻，幼稚红细胞数目较少，贫血现象不明显。
取正常组、攻毒组、预防组和治疗组四个组的雏鸡的胸腺、法氏囊、骨髓和腺胃等组织器官，进行试验鸡的大体病变观察(图10)。
攻毒组的鸡腺胃乳头出血、增生并逐步黏连；骨髓颜色变淡，呈粉白色；胸腺色淡、萎缩；法氏囊发育不良。预防组和治疗组较攻毒组病变轻，且随着时间的延长，腺胃不再粘连、出血的症状消失，骨髓逐渐恢复鲜红色。
取正常组、攻毒组、预防组和治疗组四个组的组织块进行石蜡切片的制作，采用H&E染色法进行染色，并在光学显微镜下观察各组织的病理变化(图11)。
攻毒组组织呈现明显病变，腺胃固有层和深层复管腺间质有大量淋巴细胞浸润，黏膜绒毛断裂，上皮细胞脱落；法氏囊淋巴滤泡发育不全，数量减少，甚至缺如，淋巴细胞耗竭；胸腺萎缩，皮质和髓质淋巴细胞流失，几近耗竭；骨髓造血细胞减少，被脂肪细胞替代。预防组和治疗组的病变较攻毒组轻微，呈现好转趋势。
结果：卵黄抗体治疗组与预防组在鸭圆环强毒攻毒后鸭群获得100％保护，生理盐水对照组的鸭群则100％发病。证明本发明制备的鸭圆环病毒卵黄抗体对感染鸭圆环病毒的鸭群具有良好的临床保护效果，可进行临床推广和应用。
圆圈病毒3型卵黄抗体治疗效果试验
Figure BDA0003212739900000072
由以上结果可以看出，预防组的保护率达到了80％，治疗组的治愈率达到了66.7％，未完全治愈和未完全获得保护的试验鸡在卵黄抗体的作用下也逐渐好转，因此本发明的GyV3卵黄抗体冻干粉有效地实现了对GyV3的防治，大大提高了对动物的保护率。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法
<150> 2021104704901
<151> 2021-04-29
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1125
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ccagacacaa ctaaaggcaa aaacgttaca acaactaatg tggcactaat taacgttaac 60
ctgaaagagt tcttctgggc cacactgcca ctagacgcaa ggtcaaagat tggaggaccc 120
aaccccttcc cacaacacat ccagggatgt gactgggcgg gcatagccac aacccacaaa 180
ggctgctggc catacagtac acaaatgtca tcatctagac agccaggggc atggccttca 240
gaatggtggc gatgggcact tcttcttatg catcctagat ccaatgtacg attcttcgga 300
tccccgaaac tgatgaccct accacaaata ggacagttcc tggggggctg gcaactattc 360
acccacagat tcacaaaatt ccgtgtgctt gcaactaaga gcagagaatc gttctccccg 420
gtcgcgagcc tgcttgtaca agacaattac tttgcaagaa gagagggtgc agggccacca 480
atatcgggac aaccaccaat gtgcaccatg caaagactta cgagagacta tacaggcaca 540
gaaagcaatg ctccagctaa tgaaaccaca ataccatcca tgccaccaga cccaccccaa 600
taccccgctc aaaccggctg cagcacggcg gtagaccctg gtgaatacct cctcgcagga 660
ctcacacgta cagcagtatc ctgctggtat tcacgctcaa catacccaag ctttgctacg 720
ctatcagcac taggggcacc atggtcattc ccagcaggac agaagtcaat cagcaaaaca 780
tccttcaaca aacatgtcat tagaggcatg ggtgacccac aaggcaaaaa atggctcacc 840
ctggtaccga aagaacaaga atggatcaat tcggactcaa tgacaaagtc agaactggac 900
acggacatag ctacattgta cctagctcaa ggaacaagca gagcaaacag ctacaaattc 960
aacacattcc acgaggtaat ggtacaagac cccatgaatg tagccccctg ggcagtcgtc 1020
aaagtctcca gcgtctggac actcggcaac aacagaagac catacccatg ggatgtcaac 1080
tggtacaacg aattcactgc agaaggccgc gtccccgcag actag 1125
<210> 2
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
Pro Asp Thr Thr Lys Gly Lys Asn Val Thr Thr Thr Asn Val Ala Leu
1 5 10 15
Ile Asn Val Asn Leu Lys Glu Phe Phe Trp Ala Thr Leu Pro Leu Asp
20 25 30
Ala Arg Ser Lys Ile Gly Gly Pro Asn Pro Phe Pro Gln His Ile Gln
35 40 45
Gly Cys Asp Trp Ala Gly Ile Ala Thr Thr His Lys Gly Cys Trp Pro
50 55 60
Tyr Ser Thr Gln Met Ser Ser Ser Arg Gln Pro Gly Ala Trp Pro Ser
65 70 75 80
Glu Trp Trp Arg Trp Ala Leu Leu Leu Met His Pro Arg Ser Asn Val
85 90 95
Arg Phe Phe Gly Ser Pro Lys Leu Met Thr Leu Pro Gln Ile Gly Gln
100 105 110
Phe Leu Gly Gly Trp Gln Leu Phe Thr His Arg Phe Thr Lys Phe Arg
115 120 125
Val Leu Ala Thr Lys Ser Arg Glu Ser Phe Ser Pro Val Ala Ser Leu
130 135 140
Leu Val Gln Asp Asn Tyr Phe Ala Arg Arg Glu Gly Ala Gly Pro Pro
145 150 155 160
Ile Ser Gly Gln Pro Pro Met Cys Thr Met Gln Arg Leu Thr Arg Asp
165 170 175
Tyr Thr Gly Thr Glu Ser Asn Ala Pro Ala Asn Glu Thr Thr Ile Pro
180 185 190
Ser Met Pro Pro Asp Pro Pro Gln Tyr Pro Ala Gln Thr Gly Cys Ser
195 200 205
Thr Ala Val Asp Pro Gly Glu Tyr Leu Leu Ala Gly Leu Thr Arg Thr
210 215 220
Ala Val Ser Cys Trp Tyr Ser Arg Ser Thr Tyr Pro Ser Phe Ala Thr
225 230 235 240
Leu Ser Ala Leu Gly Ala Pro Trp Ser Phe Pro Ala Gly Gln Lys Ser
245 250 255
Ile Ser Lys Thr Ser Phe Asn Lys His Val Ile Arg Gly Met Gly Asp
260 265 270
Pro Gln Gly Lys Lys Trp Leu Thr Leu Val Pro Lys Glu Gln Glu Trp
275 280 285
Ile Asn Ser Asp Ser Met Thr Lys Ser Glu Leu Asp Thr Asp Ile Ala
290 295 300
Thr Leu Tyr Leu Ala Gln Gly Thr Ser Arg Ala Asn Ser Tyr Lys Phe
305 310 315 320
Asn Thr Phe His Glu Val Met Val Gln Asp Pro Met Asn Val Ala Pro
325 330 335
Trp Ala Val Val Lys Val Ser Ser Val Trp Thr Leu Gly Asn Asn Arg
340 345 350
Arg Pro Tyr Pro Trp Asp Val Asn Trp Tyr Asn Glu Phe Thr Ala Glu
355 360 365
Gly Arg Val Pro Ala Asp
370

Claims (4)

1.一种重组圆圈病毒3型VP1蛋白，其特征在于：该蛋白是由圆圈病毒3型VP1基因与原核表达载体pET32a通过酶切连接而成，转化大肠杆菌感受态细胞BL21制备而成；
其中圆圈病毒3型VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤如下：
将重组圆圈病毒3型VP1蛋白与弗氏佐剂混合制备成卵黄抗体所用抗原；
利用上述抗原免疫产蛋鸡后可产生卵黄抗体。
3.根据权利要求2所述圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤如下：
用重组圆圈病毒3型VP1蛋白免疫产蛋母鸡，免疫方式为胸肌注射四次，第一次的免疫注射的方法如下：将重组圆圈病毒3型VP1蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化得到首免抗原，用1ml该抗原胸肌注射产蛋母鸡；
将重组圆圈病毒3型VP1蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化后得到二免、三免和四免用的抗原；首免后间隔一周二免，二免二周后三免，三免三周后四免，然后从高免鸡蛋的蛋黄中提取纯化得到圆圈病毒3型卵黄抗体，使用聚乙二醇、硫酸铵盐析法提纯即可获得目标卵黄抗体。
4.根据权利要求3所述圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤如下：
重组圆圈病毒3型VP1蛋白与弗氏佐剂的体积比为1：1。
CN202110935118.3A 2021-04-29 2021-08-16 一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法 Pending CN113683665A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110470490 2021-04-29
CN2021104704901 2021-04-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113683665A true CN113683665A (zh) 2021-11-23

Family

ID=78579952

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110935118.3A Pending CN113683665A (zh) 2021-04-29 2021-08-16 一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113683665A (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102617731A (zh) * 2012-04-19 2012-08-01 华中农业大学 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体及其制备方法和应用
CN103554254A (zh) * 2013-11-05 2014-02-05 四川理工学院 一种抗人a组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和应用
CN104710530A (zh) * 2015-03-17 2015-06-17 浙江省海洋水产养殖研究所 抗副溶血弧菌ompk卵黄抗体制备及其应用
CN104725503A (zh) * 2015-03-31 2015-06-24 华中农业大学 一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体及其应用
CN105412923A (zh) * 2015-12-04 2016-03-23 上海市动物疫病预防控制中心 一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂及其制备方法
CN108752470A (zh) * 2018-06-13 2018-11-06 苏州大学 一种抗鲤疱疹病毒ii型orf72的卵黄抗体及其制备方法
CN109200281A (zh) * 2018-10-24 2019-01-15 山东农业大学 单链环状DNA病毒GyV3的亚单位疫苗及其制备
CN109929032A (zh) * 2019-02-26 2019-06-25 青岛今墨堂生物技术有限公司 一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102617731A (zh) * 2012-04-19 2012-08-01 华中农业大学 抗猪圆环病毒2型卵黄抗体及其制备方法和应用
CN103554254A (zh) * 2013-11-05 2014-02-05 四川理工学院 一种抗人a组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和应用
CN104710530A (zh) * 2015-03-17 2015-06-17 浙江省海洋水产养殖研究所 抗副溶血弧菌ompk卵黄抗体制备及其应用
CN104725503A (zh) * 2015-03-31 2015-06-24 华中农业大学 一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体及其应用
CN105412923A (zh) * 2015-12-04 2016-03-23 上海市动物疫病预防控制中心 一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂及其制备方法
CN108752470A (zh) * 2018-06-13 2018-11-06 苏州大学 一种抗鲤疱疹病毒ii型orf72的卵黄抗体及其制备方法
CN109200281A (zh) * 2018-10-24 2019-01-15 山东农业大学 单链环状DNA病毒GyV3的亚单位疫苗及其制备
CN109929032A (zh) * 2019-02-26 2019-06-25 青岛今墨堂生物技术有限公司 一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PHAN,T.G等: "GeneBank YP_005454312.1", 《GENEBANK》 *
PHAN,T.G等: "GeneBank YP_005454312.1", 《GENEBANK》, 13 August 2018 (2018-08-13), pages 1 - 2 *
袁世玉: "圆圈病毒3型（GyV3）对鸡和小鼠致病特性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊网）》 *
袁世玉: "圆圈病毒3型（GyV3）对鸡和小鼠致病特性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊网）》, no. 11, 15 November 2020 (2020-11-15), pages 17 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108329378B (zh) 塞内卡谷病毒vp1蛋白、编码基因、杂交瘤细胞株和单克隆抗体及其应用
CN109182380B (zh) 杆状病毒表达的猪瘟e2亚单位疫苗的制备方法及应用
CN113512096B (zh) 一种鲈鱼弹状病毒重组g2蛋白及其应用
CN109721642B (zh) 一种i群血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗及其制备方法
CN110872578B (zh) 一株变异株传染性法氏囊病毒、亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN112500458B (zh) 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用
CN111471701B (zh) 高效表达鹅星状病毒可溶性衣壳蛋白的orf2基因的方法及其应用
CN107098974A (zh) 一种融合蛋白及其应用
CN109136198A (zh) 一种表达鸡传染性贫血病毒vp1、vp2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗
CN112921005A (zh) 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用
CN102260322B (zh) 幽门螺杆菌抗原肽及其应用
CN113943376B (zh) 一种融合基因、其编码蛋白及其在抗非洲猪瘟中的应用
CN114561366A (zh) 一种山羊库布病毒分离株及其应用
AU2020103776A4 (en) Koi herpesvirus (khv) orf-149-based carbon nanotube supported nucleic acid vaccine and application thereof
CN111440815B (zh) 一种新型鸭呼肠孤病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法
CN109867713B (zh) 一种犬瘟热基因工程亚单位疫苗
US11767356B1 (en) Canine parvovirus nanobody CPV-VHH-E3 and application thereof
CN111973738A (zh) 一种基于猪瘟病毒基因的核酸和重组蛋白共免疫疫苗、制备方法及应用
CN113940993B (zh) 一种鲈鱼弹状病毒g2-2m亚单位疫苗及其制备方法
CN114903986B (zh) 一种猪链球菌三组分亚单位疫苗其制备方法
CN112159480B (zh) 一种鸡传染性法氏囊病病毒多抗原表位蛋白及其应用
CN114437237B (zh) 金黄色葡萄球菌trap靶向重组蛋白抗原及其用途
CN113683665A (zh) 一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法
CN110013549B (zh) 一种戊型肝炎亚单位疫苗
CN113855795A (zh) 禽戊型肝炎病毒orf2亚单位疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20211123

RJ01 Rejection of invention patent application after publication